綜述生命科學(xué)儀器2009 第7卷/10月刊苦瓜抗HIV活性蛋白及其聚乙二醇修飾研究進展屈默龍 劉鑫(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院610064 )摘要苦瓜籽含有許多具有抗HIV活性的核糖體失活蛋白，例如a-苦瓜素，β -苦瓜素和MAP30,它們還分別具有隨胎、抗腫瘤活性、抗乙肝病毒活性等。本文從結(jié)構(gòu)、功能、抗HIV分子機制、與其它病毒作用、與其它藥物相互作用等方面總結(jié)了MAP30蛋白的研究,并根據(jù)現(xiàn)有的聚乙二醇修飾方法對MAP30修飾研究提出了展望。關(guān)鍵詞核糖體失活蛋白苦瓜素, MAP30,人免疫缺陷病毒，聚乙二醇苦瓜(Momordica charatia L)是葫蘆科年攀援草本型RIP由一條多肽鏈組成，堿性糖蛋白，等電點在苦瓜屬植物，果實性寒味苦,具有清熱解毒、滋養(yǎng)強8~10之間，具有RNAN-糖苷酶(RNAN-glycosidase,壯等功效?？喙现杏卸喾N化學(xué)物質(zhì),如momorcharins,RNG)的活性; I型RIP由分子量相近的A、B兩條.momordenol,momordicilin, momordicins, momordicinin,多肽鏈通過一對二硫鍵相連,并通過強烈的疏水作用momnordin,momordolol等1"。本文將介紹其中抗HIV活結(jié)合在- -起，等電點在6~8之間。其中A鏈和I型性的蛋白。RIP-樣具有RNAN-糖苷酶活性; B鏈是一個對半乳糖專- -的凝集素,能介導(dǎo)A鏈進人細胞發(fā)揮作用。1.苦瓜素現(xiàn)有研究表明，MAP30可以特異地抑制受病毒感染a苦瓜素和β苦瓜素可以抑制HIV-2整合酶,對的細胞和腫瘤轉(zhuǎn)化細胞，誘發(fā)其凋亡，但對正常細.皰疹病毒、HIV、柯薩奇病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒都具胞卻沒有毒副作用，顯示了巨大的臨床應(yīng)用價值。有體外抗病毒活性,抑制鳥苷酸環(huán)化酶相關(guān)的發(fā)病機2.1. MAP30 的結(jié)構(gòu)理，抑制白血病等癌癥。a苦瓜素對子宮內(nèi)膜的分化MAP30基因沒有內(nèi)含子,全長861 bp,編碼286有抑制作用,因此還具有墮胎功能,對絨毛膜癌和黑個氨基酸,其中包括N端23個氨基酸的引導(dǎo)肽。成熟素瘤細胞具有毒性,可增強小鼠巨噬細胞的殺傷腫瘤的MAP30蛋白為263個氨基酸，其51 ~ 53位的Asn-效果。β苦瓜素可以抑制假孕鼠子宮蛻膜化和內(nèi)膜、Leu-Thr是N連接糖基化位點。另外，MAP30含有肌瘤細胞的增殖,也可抑制培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜細胞的生特定的Trp)9和Met2s殘基，但不含Cys殘基21。Y70,物合成活性。β苦瓜素還通過降低胚泡的附著,抑制YIPFS,R0T幾個殘基可能有RNA N-糖苷酶活性,它滋養(yǎng)層生長和破壞內(nèi)部細胞的發(fā)育實現(xiàn)其墮胎活性。們在蛋白空間結(jié)構(gòu)的一條溝中,形成-一個與逆轉(zhuǎn)錄病a和β苦瓜素不影響卵泡的補充和成熟。雄性動物實毒整合酶類似的結(jié)構(gòu)，與整合酶競爭,從而抑制病毒驗表明a苦瓜素和β苦瓜素不影響離體的大鼠睪丸間基因組的整合。D4 和E8是主要與Mn2*作用的殘基，細胞在黃體激素誘導(dǎo)下的睪酮生成,也不影響離體的Mn2*等二價金屬離子在MAP30抑制整合酶、松弛超大鼠無莢膜腎上腺細胞在促腎上腺皮質(zhì)素誘導(dǎo)下的皮螺旋DNA有重要作用"。2.2. MAP30 的抗腫瘤活性質(zhì)酮生成|川。MAP30對人惡性膠質(zhì)瘤、表皮樣瘤、黑色素瘤、2. MAP30骨髓瘤、肝癌、乳腺癌、成神經(jīng)癌和前列腺癌表現(xiàn)出不同的敏感性。Fan等4的研究了重組MAP30對人類大MAP30( Momordica anti-HIV protein of 30 kD)是從腸癌LoVo細胞的影響,結(jié)果表明, Map30對LoVo細胞苦瓜中分離到的分子量為30kD的I型核糖體失活蛋的抑制成顯著的時間和劑量依賴效應(yīng)，可以觀察到明白。核糖體失活蛋iboeinacivatinrotein,RIP)是顯的溫亡后應(yīng)加核 沈縮和邊男警集或分裂、猬亡小廣泛存在于植物界的-類蛋白毒素,能夠破壞核糖體體等中國煤化工因組降解。Northen結(jié)構(gòu)，抑制蛋白質(zhì)的生物合成。包含兩種類型: 1和w{MYHC N M H Ge- -的Bax轉(zhuǎn)錄和表作者介紹:四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院本科生。沒有經(jīng)費資助。通信地址:四川省成都市四川大學(xué)望江校區(qū)生命科學(xué)學(xué)院06生技，郵編: 610064。E-mail: liuxin01@gmail.com。3.綜述生命科學(xué)儀器2009 第7卷/10月刊達上調(diào)，抗凋亡成員Bcl-2 則下調(diào)。Sun等5)在2001卷曲的pUC18質(zhì)粒作為異源目標DNA，切除了3’末年用微陣列分析了MAP30處理的Kaposi肉瘤(多發(fā)于端GT二核苷酸的U3和U5作為底物。整合酶對目標DNA惡性AIDS病人)相關(guān)病毒(KSAV或HHV-8)感染的細胞進行隨機剪切,并將病毒DNA的3'末端與目標DNA切的基因表達變化。他們報道發(fā)現(xiàn)MAP30影響了HHV-8口處的5’末端連接,形成缺口。結(jié)果表明MAP30可以感染的BC--2細胞中與擴張和增殖相關(guān)的病毒和細胞干擾病毒DNA 3'末端的定位,抑制HIV-1整合酶鏈轉(zhuǎn)基因的表達,從而抑制惡性腫瘤生長。移活性，其抑制作用同樣呈現(xiàn)劑量依賴性。2.3. MAP30 抗HIV活性HIV整合的最后-步是去整合,即病毒DNA脫離Lee-Huang 等2檢測了MAP30的抗HIV活性。結(jié)宿主以便進-一步傳播。Lee -Huang等I設(shè)計了38個核果表明抑制合胞體形成、p24產(chǎn)生和逆轉(zhuǎn)錄的半抑制苷酸的底物模擬逆轉(zhuǎn)錄病毒的重組中間體,其中發(fā)卡濃度分別為0.83nM、0.22nM和0.33nM,在這些濃度形的部分為病毒特異性的U5序列,啞鈴形部分為任意下沒有細胞毒性,并且短時間孵育對于病毒初期感染的目標序列，整合酶催化這兩部分的分離。結(jié)果表明是有效的(15秒，25%抑制率);如果病毒吸附后MAP30可以抑制病毒部分從整體上裂解或釋放。再要提高抗HIV活性則需要更高濃度(167- 1670nM)。2.4.與其它藥物相互作用MAP30在33.4nM的濃度下沒有觀察到有抑制DNA合Bourinbaiar等$通過檢測被HIV感染的MT-4細胞成和蛋白質(zhì)生產(chǎn)，對p24產(chǎn)生和逆轉(zhuǎn)錄的抑制率分別中p24表達的降低來測量Map30對抗HIV藥物地塞米為98%和87%;相比之下，天花粉蛋白(GLQ233)對松(DEX)、吲哚美辛(IND)、齊多夫足(AZT)的增強作HIV逆轉(zhuǎn)錄活性抑制90%的劑量卻造成35%的DNA合用。結(jié)果顯示，加入1.5nM的MAP30后，地塞米成抑制和40%的蛋白質(zhì)合成抑制，顯然MAP30的治松和吲哚的IC50降低了1000 倍并且沒有產(chǎn)生細胞毒療效果好于天花粉蛋白。MAP30還可以用于預(yù)防HIV性(對AZT沒有明顯影響),表明使用MAP30結(jié)合的性傳播，因為即時是HIV和HSV抑制濃度1000倍低藥理劑量的地塞米松和吲哚美辛可提高抗艾滋病毒的MAP30也不會影響精子的活力和運動心。治療的療效。2.3.1. RNA糖苷酶活性2.5. MAP30 對其它病毒的作用MAP30作為I型核糖體失活蛋白，在體外具有2.5.1. MAP30 抗HSV活性RNA N-糖苷酶活性。它不但作用于SS、5.8S和Bourinbaiar 等9|檢驗了MAP30對人合胞體病毒18SrRNA,而且僅僅作用于28SrRNA中的A4324或HSV的抑制。MAP30在334nM的濃度對胚肺成纖維細G4323核苷酸，解開A4324或C4323位置核糖和嘌呤胞系W1-38沒有細胞活性影響，這與阿昔洛韋(ACV,之間的連接，使核糖體因不能結(jié)合延伸因子II而終止一種HSV特異的核苷酸類似物)相似,但它對HSV的抑蛋白質(zhì)的翻譯。制效果高出ACV很多,說明其抑制原理不同于核苷酸2.3.2. DNA拓撲失活活性抑制劑。無論是ACV敏感株HSV-1還是抗性株HSV-2,Lee- Huang等分別用天然和重組MAP30與人DNAMAP30的半抑制濃度都在0.1-0.3 μM:這比抗HIV的拓撲酶I (TopolI)處理HIV-1 LTR,超卷曲DNA都解濃度高了近1000倍。螺旋成開環(huán)和線性的狀態(tài)。再用DNA回旋酶處理,2.5.2. MAP30 抗HBV活性TopoII處理過的DNA可恢復(fù)超卷曲狀態(tài)，天然和重Fan等0利用人肝癌細胞檢測MAP30對人乙肝病組MAP30處理過的DNA均不能恢復(fù)，說明MAP30能毒(HBV)的抑制作用，結(jié)果表明，MAP30 抑制HepG2.使超卷曲的病毒和質(zhì)粒DNA不可逆地解螺旋,并催2.15細胞中的乙型肝炎病毒DNA的復(fù)制和HbsAg、HbeAg化雙鏈斷裂形成拓撲學(xué)上的無活性產(chǎn)物。的分泌,不同濃度的MAP30在較長時間(9天)作用后效2.3.3.抑制HIV-1整合酶活性果差異顯著,表明抑制效果成劑量依賴性和時間依賴HIV整合開始時，整合酶結(jié)合到HIV LTR的末端性。MAP30 對胞外DNA的抑制好于核內(nèi)eccDNA和序列,并從底物的標記鏈3'末端特異性地切去二核苷reDNA的抑制，對ssDNA、HBV mRNA和pgRNA幾乎酸GT。Lee-Huang 等用- -段含21個堿基對的寡核苷無抑制作用。Fan由此推測核內(nèi)有MAP30不能作用的酸作為底物，模擬HIV-ILTR的U3或U5末端，發(fā)現(xiàn)cccl中國煤化工MAP30可以抑制HIV-I整合酶對底物的切除，其抑制2.6.:[HCNMHG作用程度依賴于HIV-1整合酶和MAP30的濃度。Lee-nuang本中組人物竹困中成功表達MAP30。HIV 整合的第二步是鏈轉(zhuǎn)移。Lee-Huang等T"以超結(jié)果表明天然和重組的MAP30對合胞體、p24生成和逆，4生命科學(xué)儀器2009 第7卷/10月刊轉(zhuǎn)錄的半抑制濃度幾乎相同，在0.2nM- -0.3nM之間?？梢岳枚c突變技術(shù)將賴氨酸突變?yōu)槠渌缓被?002年Arazi等川"報道了用胡瓜黃花葉病毒-AGII作為側(cè)鏈的氨基酸，再與PEG相耦連。但是MAP30有15載體在葫蘆科植物(黃瓜、甜瓜、南瓜等表達MAP30,個賴氨酸，占6%，如果全部突變可能導(dǎo)致MAP30失這提供了一個可食用抗病毒蛋白的來源。遺憾的是活。另一種定點突變是通過計算機輔助預(yù)測抗原的定點Arazi沒有提供蛋白產(chǎn)量的信息，也不知道果實里有沒突變技術(shù),可以選擇性突變賴氨酸,有待于在MAP30中有表達。葉子中提取的MAP30蛋白對HIV-1合胞體和進一步研究。p24生成的半抑制濃度介于0.24至0.3InM,在3.3 μM3.1.2.巰基修飾時仍沒有抑制細胞DNA和蛋白質(zhì)的現(xiàn)象,對感染人類MAP30無半胱氨酸，但重組生產(chǎn)的蛋白可以在皰疹病毒8型(HHV- 8)的BC -2細胞系的半抑制濃度為不同位點定點突變出半胱氨酸,比較不同位點修飾后0.4nM:這些都說明南瓜表達的MAP30與天然分離的的清除率,從中選擇清除率最低的位點。這種方法也抗病毒效果、細胞毒性情況是相同的?？梢杂糜谥亟M的MAP30。2.7. MAP30 片段化3.1.3.其它Huangl2根據(jù)MAP30天然的緊湊結(jié)構(gòu)推測其中間如果蛋白結(jié)合較大分子量的PEG,血液中半衰期部分較重要，因此將其保護起來進行水解，得到三個會上升,但是活性會降低，-般結(jié)合1到2個EG鏈就主要片段,兩個大的(21-22kDa,25- -26kDa)具有抗HIV足夠發(fā)揮作用,因為少數(shù)長的PEG鏈比多數(shù)短的PEG鏈活性，半抑制濃度在0.2-0.4nM之間。中間片段與原更有效6。用PEG雙酯、PEG- 甲基馬來酸酐、PEG-蛋白相似，可以抑制p24表達,抑制HIV-1整合酶，具苯基羥基琥珀胺碳酸鹽等可逆修飾蛋白，隨著時間的推有DNA拓撲解旋活性,但沒有細胞毒性,不抑制細胞移,聚乙二醇被酶解而減少,逐步釋放蛋白,可減少PEG自由轉(zhuǎn)錄這說明MAP30蛋白水解片段仍具有生物活修飾帶來的活性減少。除了線性的PEG分子外,基于賴性。有趣的是MAP30N末端的10個氨基酸和C末端氨酸或其它核心構(gòu)建的分支PEG對蛋白質(zhì)和多肽的修飾的76個氨基酸不是抗HIV活性所必須的1。C末端也有作用，由于一個修飾位點結(jié)合2個PEG,減少了是蛋白正確折疊和在核糖體上定位所必須的,因此可修飾位點數(shù)，從而降低了失活的可能，同時更好的保以調(diào)節(jié)RIP的活性而不影響其抗病毒功能對不同RIP護蛋白免收免疫系統(tǒng)的威脅(圖1 )I71。分析表明N末端氨基酸序列可能決定RIP對HIV的治3.2. MAP30-PEG 結(jié)合物研究進展療指數(shù),例如天花粉蛋白與MAP30的N端44個氨基酸有相似性。3.聚乙二醇修飾0-0()興口3.1. PEG修飾方法圈1分支型PEG修飾減少免疫原性對于注射用治療性蛋白，增加分子量或負電性4.展望可以減少被腎臟濾過的可能，因此聚乙二醇(PEG)修飾能賦予蛋白質(zhì)和多肽類多種優(yōu)良性能,具體表現(xiàn)為循MAP30的PEG修飾還有很多未解決的問題,例如環(huán)半衰期延長(逃過腎過濾，很大程度上與修飾后分PEG修飾可能給蛋白的分離純化帶來挑戰(zhàn)。目前的修飾子量有關(guān))、免疫原性降低或消失、毒副作用減少、理主要集中在傳統(tǒng)的氨基直鏈隨機修飾,定點修飾、羧基化穩(wěn)定性增強等,在很大程度上拓寬了蛋白質(zhì)和多肽修飾、分支修飾、可逆修飾的效果還不清楚。在PEG分類的應(yīng)用范圍41。子量的選擇。上可以有其它嘗試。修飾后與其它藥物的相3.1.1. 氨基修飾互作用情況也未見報道。大多數(shù)抗腫瘤實驗均為體外實在PEG修飾早期,修飾靶點多為蛋白質(zhì)或多肽的驗,體內(nèi)實驗的效果未必同樣理想;修飾后抗HIV的效氨基,包括賴氨酸的ε氨基和鈦鏈末端的a氨基,多果還沒有體外實驗報道，更不用說體內(nèi)實驗了。為隨機修飾，多個氨基的存在常導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)物的不均針對大腸桿菌或其它植物重組生產(chǎn)的MAP30的修一，也不利于分析和確定產(chǎn)物中聚乙二醇的修飾位點。飾也沒中國煤化工效果與天然一樣,由于遠離活性中心的N端定點修飾可以有效地保持藥況8重YHCNMH G的生產(chǎn)方式。Philip物的原有生物活性，所以可以用聚乙二醇的醛基衍生Lin Huang等將MAP30酶解，結(jié)果表明一些21kDa甚物(mPEG一CHO)選擇性修飾蛋白質(zhì)的末端氨基;也至0.8kDa的片段仍具有活性啊，這些片段可能仍具抗5綜述.生命科學(xué)儀器2009 第7卷/10月刊原性或半抗原性，可以用PEG修飾，但這方面的工physicaJ Research Comnunieations, 1995. 208(2): p.79-785.作尚沒有報道，今后可以進- -步探究這些片段與其庀[9] Burinbaiar, A.S. and s. 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