廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)Journal of Guangdong Pharmaceutical College Oct, 2009, 25(5)吡硫醇聚乙二醇前藥的合成與表征張圍宇,王紅,蔡波濤,胡春玲(湖北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院湖北武漢430065)摘要:目的合成吡硫醇聚乙二醇前體藥物,對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行初步體外釋放及刺激性試驗(yàn)研究。方法以單甲氧基聚乙二醇4000為原料,與丁二酸酐反應(yīng)后再與N羥基丁二酰亞胺縮合得到活潑酯最后與吡硫醇反應(yīng)得到目標(biāo)化合物;用薄層色譜、紫外、紅外、核磁共振氫譜對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。結(jié)果與結(jié)論合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征結(jié)果表明單甲氧基聚乙二醇4000成功地連接到了吡硫醇上;初步的體外降解及刺激性試驗(yàn)表明該前藥具有一定緩釋作用,且能顯著減小對(duì)注射部位及血管的刺激作用。關(guān)鍵詞:吡硫醇;單甲氧基聚乙二醇;前藥;結(jié)構(gòu)表征中圖分類(lèi)號(hào):R914文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1006-8783(200)05-0493-03Synthesis and characterization of pyritinol-PEGZHANG Wei-yu, WANG Hong, CAI Bo-tao, HU Chun-ling( School of pharmacy, Hubei University ofChinese medicine, Wuhan 430065. ChinaAbstract: Objective To synthesize and characterize pyritinol-PEG prodrug, and assess its in vitro releaseand imitation. Methods mPEG4K was first reacted with succinic anhydride, and then treated with Nhydroxyl succinic anhydride, finally, reacted with pyritinol to give the target pyritinol-PEG which is theprodrug of pyritinol. Results The chemical structure of pyritinol-PEG was characterized by TLC, UV, FTIRand 'H-NMR. Conclusion The structural characterization of the target compound showed that mPEG4Kwas bonded to pyritinol. This prodrug has slow-release profile during in vitro release test, and significantlylow vascular imitationKey words: pyritinol methoxy polyethyleneglycol; prodrug; synthesis高分子量的聚乙二醇及其單甲氧基聚乙二醇等枝狀及注射部位乃至整個(gè)上肢皮膚水腫、發(fā)硬癢痛由于其良好的水溶性生物相容性和無(wú)免疫原性以等不良反應(yīng)。作者通過(guò)采用單甲氧基聚乙二醇的活及無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)在前體藥物的制備中有越來(lái)越多的化酯與吡硫醇合成前體藥物3叫,以期改善吡硫醇應(yīng)用12。吡硫醇臨床上主要用于腦震蕩綜合癥、藥物半衰期短以及刺激性大的問(wèn)題腦外傷后遺癥、腦炎及腦炎后遺癥等的頭脹痛、頭暈失眠、記憶力減退注意力不集中情緒變化等癥1實(shí)驗(yàn)部分狀的改善亦用于腦動(dòng)脈硬化、老年癡呆等。臨床主1.1儀器與試劑要用其鹽酸鹽,因其半衰期短,口服給藥需每天3次很不方便;靜脈滴注時(shí),藥物對(duì)血管黏膜有刺激RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);作用,易發(fā)生注射部位血管腫脹疼痛、呈青紫色樹(shù)78HW型恒溫磁力攪拌器(杭州儀表電機(jī)有限公司);SKFG01電熱恒溫鼓風(fēng)干燥器(湖北省黃石市醫(yī)療器械廠);SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)收稿日期:2009-07-01;修回日期:2009-10-11城科工貿(mào)有限公司);Uv-1700紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)基金項(xiàng)目:湖北省自然科學(xué)基金資助課題(200ABA213)作者簡(jiǎn)介:張圍字(1981-),男在讀碩士研究生,Ema:(日本島津);DFY低溫恒溫反應(yīng)浴(鄭州長(zhǎng)城儀器zhangweivusuper@163.com,通訊作者:王紅(98-),有限公司);wRSB數(shù)字熔點(diǎn)儀(上海精密科學(xué)儀女教授碩士生導(dǎo)師,主要從事新藥研究與開(kāi)發(fā),器公司); Perkin-Elmer Spectrum200FTR光譜儀Email:wanghonghb502@yahoo.com.cne(美國(guó)PE公司);AS600(600MHz)高分辨率核磁共494廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)第25卷振儀;ZF6型三用紫外線分析儀(上海嘉鵬科技有85%,mp56.3-58.2℃。限公司)。1.2.2吡硫醇聚乙二醇前藥的合成參照文藥用單甲氧聚乙二醇400mPEC4K)(南京威獻(xiàn)進(jìn)行合成試驗(yàn)研究。稱(chēng)取干燥的mPEC4K爾化工有限公司);吡硫醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù):98.5%,水A4.0g(0.1mmoL),用50 mL DMF溶解,0~5℃分:0.17%,批號(hào):080519,上海新云化工有限公司提攪拌20min,依次加人NHs0.23g(0.2mmoL)和供);丁二酸酐、二環(huán)己基碳酰亞胺(DCC)、N羥基DCC0.62g(0.3mmoL),0~5℃攪拌10min,依次琥珀酰亞胺(NHS)、對(duì)二甲氨基吡啶(DMAP)、薄層加入吡硫醇0.48g(0.13mmoL)和DMAP0.16g層析硅膠GF、均為化學(xué)純,N,N-二甲基甲酰胺(0.13mmoL)。0~5℃反應(yīng)2h,30~35℃下反應(yīng)(DMF)、三氯甲烷、二氯甲烷、乙醚、甲醇、吡啶、丙20h,停止反應(yīng),反應(yīng)液過(guò)濾,濾液在快速攪拌下加酮均為分析純?nèi)肜湟颐?80mL,攪拌5min后置冰箱中靜置301.2方法mn。過(guò)濾得淺米黃色固體,將固體用30mL水溶解,1.2.1單甲氧基聚乙二醇4000琥珀酸單酯過(guò)濾濾液用二氯甲烷萃取(35mL×3),用1mol/L(mPEC4KA)的合成參照文獻(xiàn)[7-8]進(jìn)行合成HCl洗滌(10mL×2)后再用水洗(15mL×2)。加試驗(yàn)研究。稱(chēng)取干燥的單甲氧基聚乙二醇4000人適量無(wú)水硫酸鈉干燥,靜置過(guò)夜。過(guò)濾干燥劑,濾(mPEC400040g(10mmoL),溶于150mL三氯甲液再用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾,濾液濃縮,快速攪烷中加入丁二酸酐2.0g(20mmL)和1.6mL吡拌下加入冷無(wú)水乙醚沉淀產(chǎn)物,過(guò)濾得淺米黃色粉啶加熱回流反應(yīng)48h,減壓回收溶劑,殘余物中加末40℃真空干燥24h(干燥劑為P2O3),得淺米入飽和 NaHco3溶液150mL使溶解,過(guò)濾,用80黃色粉末(吡硫醇的載藥量4.89%),mp56.5mL乙酸乙酯萃取2次,水相冷卻至0℃后用2mo59.2℃L的HC酸化至pH2左右,用二氯甲烷100mL分32結(jié)果與討論次萃取,合并二氯甲烷層,無(wú)水Na2SO4干燥過(guò)夜。濾去干燥劑濃縮至粘稠快速攪拌下加入冷無(wú)水乙2.1合成醚300mL,放入冰箱靜置,待產(chǎn)品完全析出后過(guò)濾吡硫醇聚乙二醇前藥的合成路線如下。抽干,P2O3干燥,稱(chēng)重,得mPEC4KS35g,產(chǎn)率為CH3OCH2 CH2o-tCH2CH20TCH-CH2OHOCH2CH20tCH2CH20CH2CH20-C-CH2CH2COOHNOHcH2OCH2CH2O十CH2CH2OcH2CH2O一C-CH2CH2C-OCCDMAPCHaOCH2CH20-tCH2CH20+CH2CH20-C-CH2CH2C-R2.2表征醇前藥,用DMF溶解分別點(diǎn)樣于同一硅膠板上,以221熔點(diǎn)測(cè)定用毛細(xì)管法對(duì)目標(biāo)化合物與吡丙酮石油醚甲醇(體積比l:1:1)為展開(kāi)劑展開(kāi),硫醇進(jìn)行熔點(diǎn)測(cè)定,得目標(biāo)化合物的熔點(diǎn)為56.5~取出,晾干,置紫外燈(254mm)下檢視吡硫醇斑點(diǎn)592℃,明顯低于吡硫醇的2159~217.7℃推斷與目標(biāo)化合物斑點(diǎn)清晰,且兩試樣R值相差較大,目標(biāo)化合物是不同于吡硫醇的其他物質(zhì)。說(shuō)明目標(biāo)化合物是不同于吡硫醇的其他物質(zhì)。2.22薄層色譜鑒別稱(chēng)取吡硫醇、吡硫醇聚乙二2.2.3紫外色譜鑒別分別稱(chēng)取吡硫醇及目標(biāo)化第5期張圍宇,等.吡硫醇聚乙二醇前藥的合成與表征495合物少量溶于0ml…LHo中經(jīng)適當(dāng)稀釋得3結(jié)論一定濃度的溶液分別在200~400mm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果:吡硫醇的0.1mol·LHCl本研究合成了吡硫醇聚乙二醇前藥,經(jīng)熔點(diǎn)測(cè)溶液在295.20mm有最大吸收,目標(biāo)化合物的0定、薄層色譜、紫外圖譜、紅外光譜核磁共振氫譜表mol.L"HCl溶液在297,40m有最大吸收。結(jié)果征,表明mPEC4K成功地連接到了吡硫醇上。通過(guò)表明:目標(biāo)化合物具有吡硫醇分子的基本結(jié)構(gòu);最大初步的體外降解及刺激性試驗(yàn)該前藥具有一定緩吸收波長(zhǎng)發(fā)生紅移,mPEG已經(jīng)連接在吡硫醇上。釋作用,且能顯著減小在注射過(guò)程中對(duì)注射部位及22.4紅外光譜表征將目標(biāo)化合物和各步反應(yīng)血管的刺激作用。產(chǎn)物用壓片法進(jìn)行紅外掃描,各圖譜進(jìn)行對(duì)比,得到參考文獻(xiàn)目標(biāo)化合物中可能的基團(tuán):352540cm-(酚羥基[1] GREENWALD RB, CHOE YH, MCGUIRE J,aa伸縮振動(dòng));1735.68cm(酯羰基上羰基伸縮振Efective drug delivery by pegylated drug conjugates[J]動(dòng));145532cm1,1349.52cm-1,1297.18cm1[2 GREENWALD RB. PEG drugs: an overview[J]. J94967cm(均為聚乙二醇骨架伸縮振動(dòng));110825Controll releas, 2001, 74(2): 159-171m(醚健不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng));2869.55cm-(吡啶[3] ABUCHOWSK1A, MCCOY RR, PALCZUK N C Effect of環(huán)上碳?xì)渖炜s振動(dòng))。表明mPEG已經(jīng)連接在吡硫covalent attachment of polyethylene glycol on immunogenicity醇上。and circulating life of bovine liver catalase[J].JBiolChem,1977,252(11):3582-358622.5核磁共振氫譜表征由于 mPEGAK的相對(duì)[4] ABUCHOWSK1A, VAN ES T, PALCZUK N C. Alteration分子質(zhì)量及氡的個(gè)數(shù)遠(yuǎn)超過(guò)所載的吡硫醇,所以在of immunological proprties of bovine serum albumin by圖譜上很難看到吡硫醇的氫信號(hào),無(wú)法準(zhǔn)確積分氫covalent attachment of polyethylene glycol [J]. J Biol的個(gè)數(shù)。各氫的化學(xué)位移(8)如下:2.6~2.8Chem,1977,252(11):3578-3581(—0-CO-CH2-CH2C0_0-),3.3-3.4[5]公偉薛春佳馮軍等單甲氧基聚乙二醇修飾L門(mén)冬(-0CH3),3.4-3.8(-0CH2),4.2~4.3酰胺酶的研究[].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志,2005,38(5)336-339(一CH2-0-C0-)[6 LEE H, PARK TG. Preparation and characterization of2.3初步體外釋放及刺激性試驗(yàn)mono-PEGylated ipidermal growth factor: evalution of in2.3.1體外釋放試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[11-12]采用透itro biologic activity[J]. Pharm Res, 2002, 19(6):845析袋與紫外分光光度法,分別在0.1mol·L的HC0.1mo,L的NOH、及0.1m,的[7!成東,王亞輝喜明龍,等乙二行生物的合成研pH72的磷酸鹽緩沖液3種不同的環(huán)境中對(duì)吡硫醇[8] YUKIO N, KAZUNORI K, MASAO K,a.Py(hyme聚乙二醇前藥做了體外釋放研究。結(jié)果:吡硫醇與glycol )and cyclodextrin as novel building units for單甲氧基聚乙二醇4000琥珀酸單酯的物理混合物molecular assembly and polyrotaxanes[J]. Polym Prepr在酸性、中性、堿性條件下,24h釋放率均達(dá)90%以1997,38(2):529-533上;吡硫醇聚乙二醇前藥24h后的降解情況分別為[9]葉海張燦沈文斌等.燈盞乙素聚乙二醇前藥的合成與表征[J].中國(guó)天然藥物,20064(4):283-286酸性條件下釋放36%、堿性條件下53%、中性條件[o] GRENWALD RB, PENDRI A, CONOVER C,ea.Dng下26%;前藥在不同條件下的釋放速率大小為:堿deliver systems: 2, Camptothecin 20-0-poly (ethlene性>酸性>中性glycol )ester transport forms[J]. J Med Chem, 1996, 39232刺激性試驗(yàn)參照文獻(xiàn)31,通過(guò)小鼠抓(20):1938-1940.撓試驗(yàn)大鼠舔足試驗(yàn)、大鼠尾靜脈刺激性試驗(yàn)對(duì)吡[1]常軍鄭玉斌段久芳等含5氟尿嘧啶的聚乙二醇酯的制備與表征[]現(xiàn)代化工,2006,26(3):40-42.硫醇聚乙二醇前藥做初步刺激性考察。小鼠抓撓試[12]孟繁娜,唐星,符純美鹽酸毗硫醇無(wú)痛型注射液的制驗(yàn)結(jié)果:供試組與陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較差異備[J沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2006,23(12):754-756均有顯著性(P<0.01)。大鼠舔足試驗(yàn)結(jié)果:供試[13] LOVELL M W. Less-painful emulsion formulations for組與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.05),intravenous administration of clarithromycin試組與陰性對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.01)。Pham,I994,109:45-57大鼠尾靜脈刺激性試驗(yàn)結(jié)果:供試組的刺激性與陽(yáng)[14 J CANNON J E. Reduction of pain on intravenous infusionwith bile salt formulations for a macrolide antibiotic[J]性對(duì)照組比較顯著減小。int j Pharm,1995,114:65-74.