中國臨床藥理學(xué)雜志.。226.。2003年6第19番第了期(總第83期1特約綜述SPECIAL REVIews蛋白藥物聚乙二醇化技術(shù)的研究進(jìn)展Research Development on The Protein Drug PEGylation TechnologyR9 A李力’鄭意端摘要蛋白藥物聚乙二醇化技術(shù)是指-項利用聚乙。二醇衍生物對蛋白藥物進(jìn)行化學(xué)修飾的技術(shù)。聚乙二醇的代表藥物有:腺苷脫氨酶、干擾崇a -2b和干擾索a -2a等。它可以改善藥物的可溶性和穩(wěn)定性，減少免疫原性和蛋白水解，顯著增加體內(nèi)循環(huán)時間，以及在作州部位提高藥物濃度和延K駐留時間從而提高療效。本文對該技術(shù)進(jìn)行了綜述。(深圳市清華源興生物醫(yī)藥科技有關(guān)鍵詞聚乙二醇衍生物; 化學(xué)修飾，蛋白藥物限公司，廣東深圳518057)中國臨床藥埋學(xué)雜志2003, 19(3)226 ~229Abstract The protein drug PEGylation technology is a technology that chermicallymodifies protein drug by polyethylene glycol derivatives. There were the proteindrugs PEGylation such as adenosin deaminase, x -2b-interferon, a -2a-interferon,ctc. It can improve solubility and stability of drugs. reduce immunogenicity andproteolysis, greatly increase circulation time and improve efficacy due to increasedLILiconcentration and longer dwell time at the site of action. The technology is reviewedZHENG Yi-duanin this paper.Key words polyethylene glycol derivative; chemical modification; protein drugChin J Clin Pharmacol, 2003, 19(3)226 ~229聚厶二醇(polyethylene glycol, PEG)是: .種無毒、 高吸水性的大分子聚(Shenzhen Tsinghua Yuanxing合物，是由憶_醇單體: HO-(CH,CH2O)-CH2-CH2-OH聚合而成，根據(jù)構(gòu)成的單體數(shù)量不等聚合成分子量從幾白至兒萬的高分子材料。由于PEG無Bio-pharma Science and Techno-毒，并APEG分子中存在大量乙氧基，它們能夠與水形成氫鍵，使PEG具logy Co., LTD, Shenzhen 518057)有良好的水溶性，囚而成為一種被)泛使用的化學(xué)修飾材料?？谇?，PEG化學(xué)修飾普遍采用的是單甲氧基聚厶二醇(mPEG)，分子組成為: CH,O-(CH2CH,2)-CH2-CH2-OH."。聚乙二醇末端的羥基是其化學(xué)反應(yīng)的功能基團(tuán)，但必須在較激烈的條件下才能與其他基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，因此必須通過適當(dāng)方式活化后，方叮用于各類蛋白質(zhì)藥物的化學(xué)修飾，活化后形成的端基在聚乙二醇的應(yīng)用中起若決定性的作用，不同的端基具有不同的用途。收稿: 2003 05-10活化后形成的聚乙二醇衍生物的構(gòu)型，可以分為線型和分支鏈，而根修網(wǎng): 2003-05-25據(jù)活化后聚C二醇鏈兩端端基的同還可以分為同端基聚乙二醇和異端基°通訊作者Tel:(075526980713Fax:(0755)26980584聚乙二醇'。E-mail: 1ili@thyx.com聚乙二醇活化的方法主要有:氰尿酰氯法、羥基琥珀酰亞胺法、琥珀中國煤化工YHCNMHGChin J Clin Pharmacol27_June,2003.V0lL 19No.3YSereINo.83)酸酐及琥珀酰亞胺兩步活化法等。其中羥基琥珀酰亞化學(xué)研究所、中國科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)研究所等。胺法活化的PEG應(yīng)用比較廣泛。國內(nèi)關(guān)于聚乙二醇衍生物和聚乙二醇化技術(shù)的研聚乙醇衍生物(分子量一般為5 000-20 000，也究和開發(fā)，目前大多數(shù)還是局限于科研院所和學(xué)校，有30 000或更高)可與蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈上的氨基.巰基產(chǎn)業(yè)化水平較低，尚處于初始階段。存在的問題主要和羧基等化學(xué)基團(tuán)反應(yīng)從而與蛋白質(zhì)相偶聯(lián)51.有:①聚乙: _醇修飾劑(PEGs)基本從國外進(jìn)口，產(chǎn)品價根據(jù)偶聯(lián)基團(tuán)的不同，話化后聚乙:醇街生物時格很高; H前尚未有國內(nèi)1“家生產(chǎn)、銷售該類產(chǎn)品，分為:氨基修飾用烷基化PEGs和酰基化PEGs,如PEG-②制備1.藝尚不成熟，包括活化聚乙二醇，制備成為醛、PEG-環(huán)氧化物、PEG- 琥珀酰亞胺酯;巰基修飾用聚乙二醇銜生物以及利用聚乙二醇衍生物對藥物進(jìn)行PEGs,如PEC- 馬水酰亞胺、PEG- 鄰毗啶。二硫醚，和修飾的工藝目 前還局限于實驗室，不具備產(chǎn)業(yè)化的條羧基修飾用PEGs,如PEG- 酰肼。件，另外對中間產(chǎn)物和終產(chǎn)品進(jìn)行檢測的儀器和設(shè)備也不夠先進(jìn)，③研究與開發(fā)的結(jié)合程度不高，這也是聚乙二醇修飾目前中國研究機(jī)構(gòu)與制藥企業(yè)之間存在的-一個主要問聚厶二醇修飾(PEG modification)又稱分f的PEG化題:團(tuán)任專利上受到限制，由于國內(nèi)起步較晚，作為(PEGylation),赴20世紀(jì)70年代后期逐漸發(fā)展起來的一研發(fā)生產(chǎn)聚乙二醇 衍生物的領(lǐng)先企業(yè)，Nektar公司已項熱門技術(shù)"，是用水溶性聚合物修飾藥用物質(zhì)的方經(jīng)成功開發(fā)出20多種聚乙二酶銜生物(包括第2代產(chǎn)法之-.它可以解決化合物、蛋白和多肽等物質(zhì)在臨品)，并申請了專利:其次Roche公司和Schering-Plough床應(yīng)用過程中存在的詐多問題。公司針對聚乙.:醇干擾素的應(yīng)用也進(jìn)行了專利保護(hù)，目前有很多藥物，特別是蛋白質(zhì)類大分子、抗腫因此能否繞開專利問題這也是開發(fā)聚乙二醇藥物的一一瘤新藥由于免疫原性強(qiáng)、毒副作用大，因而限制了它個主要問題。國內(nèi)的研究目前主要集中在PEG修飾后藥物的理們在臨床上的應(yīng)用，而某些藥物由F血漿半衰期短,化性質(zhì)和話性研究、動物有效性研究和聚乙二醇修飾為了獲得顯著的臨床效果，不得不加大給藥劑量和給劑及修飾條件的優(yōu)化。羅氏公司的PEGASYSTM已F藥次數(shù).從而帶米嚴(yán)重的毒副作用。相比之下，聚乙2003年I月獲得SFDA批準(zhǔn)開始進(jìn)入中國市場，而先靈二醇修飾后以增加溶解性利穩(wěn)定性，延長血漿半衰僚雅公司的PEG Intron AM也在申請進(jìn)口批準(zhǔn)的臨床中。期，降低免疫原性和抗原性，降低毒副作用和.提高2.2國外研究現(xiàn)狀膜的滲透性。原因如下。①PEG的甲基中含有大量的氫原子，氫鍵川與水分f結(jié)合，從而增加了溶解性。國外的研究，包括聚C二醇衍生物的制備和聚乙②PEG干擾了細(xì)胞清除機(jī)制，增加了蛋白質(zhì)類分子對二醇藥物的開發(fā)日前都處于領(lǐng)先的地位。見表1。血循環(huán)中蛋白酶和胰酶的抵抗,③PEG化后，分子質(zhì)表1 國外上市的聚乙二醇藥物量增大，皮下注射后吸收緩慢，由于流體半徑加大導(dǎo)產(chǎn)品(商品名)臨床應(yīng)用上:市時間致腎小球濾過減少，降低腎臟排泄，④PEG 本身不具腺茌脫胺酶免疫缺陷性疾病1990-03有免疫原性，PEG化后，PEG速蓋了蛋白的抗原決定簇，(ADAGENT*)從而降低免疫原性和抗原性。此外，PEG 修飾還體現(xiàn)犬冬酰胺酶白血病、黑索瘤194-42在體內(nèi)活性提高而體外活性降低，該作用在GM-CSF.(ONCASPARTMIY1L2、L6. TNF a和IFN v及其他生物分子上也得到干擾素a-2b(PEG-INTROND)慢性丙肝2000-05體現(xiàn)t"1。干擾素a -2b+利巴韋林丙肝2001-08因此，越來越多的PEG化蛋白質(zhì)藥物上市或者進(jìn)(PEG-INTRONTM+REBETOLM)人臨床，例如Enzon公司開發(fā)的治療免疫缺陷性疾病T擾素a-2u代償性肝病、慢性丙肝2001-08的腺背脫胺酶(ADAGENM)，治療白血病、惡性黑色素(PEGASYSMI)瘤的PEG化天冬酰胺酶(ONCASPARTM. PEG 化干擾索干擾索a-2a+ 利巴5林代償性肝病、慢性丙肝2001-12a -2b (PEG INTRONMI),羅氏的PEG化干擾索a -2a .(PEGASYSTM+COPEGUSIM)(PECASYST)第。粒細(xì)胞集落刺激因子粒細(xì)胞減少癥2002-01(NEULASTARI Pegflgrastim)2藥物聚乙二醇化技術(shù)的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀生長抑素肢端肥大癥2002-112.1國內(nèi)研究現(xiàn)狀(SOMAVENT/pegvisomnant)PEG-水凝膠防止手術(shù)后粘著2001-11國內(nèi)開展有關(guān)聚乙二醇研究的主要有中國藥科大SprayGelTM Adhesion(歐洲)學(xué)、沈陽藥科大學(xué)、天津大學(xué)、中國科學(xué)院上海生物BarrerSystem中國煤化工MYHCNMHG中國臨床藥理學(xué)雜志。2282003年6月第19在第了期(總第83期從表1可以看出，在1年多的時間內(nèi)共有3個聚乙舉例說明如下。:醇產(chǎn)品上市。腺苷脫氨酶(adenosine deaminase) 聚乙二醇腺苷從表2也可以看出，到口前為止，國外共有28個脫氨酶是世界.上第一個上市的聚乙二醇藥物，用于治品種處于臨床前研究的不同階段。相信在不久的將來，療嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷性疾病SCID (severe combined會有大量的聚C二醇藥物上市，而且隨脊我國進(jìn)一步immunoideficiency disease ,SCID)是因干細(xì)胞分化缺陷而的開放，國際化趨勢的進(jìn)-步加強(qiáng)，也會有更多的藥表現(xiàn)T、B細(xì)胞減少，體液和細(xì)胞免疫均缺陷。出生6個月起發(fā)病，對各種類型感染均易感。約20%SCID由物進(jìn)人中國市場。腺背脫氨酶缺陷引起。目前針對SCID主要是采用基因表2國外處于臨床階段和臨床前研究的聚乙二醇療法，但由于基因療法受到諸多限制，例如有效性和藥物安全性等方面'91。而聚乙二醇腺甘脫氨酶u[以不同程產(chǎn)品(商品臨床應(yīng)用仙床前度的恢復(fù)患者的免疫功能，且耐受良好、無過敏反應(yīng)。研究階段天冬酰胺酶(asparaginase) L天冬酰胺酶(ASNase)超氧化物歧化酶(PEG-SOD)腦損傷終市能夠催化L天冬酰胺水解成L天冬氨酸，將其與其他干擾素a -2b(PEG-INTRONT)白血病皿期化療藥物相結(jié)合是治療白血病的一-種有效手段， 但由干擾索a -2b(PEG-INTRONT)惡性黑色素瘤田期十它在血液存留時間短，長期接受治療的白血病病人+擾素x -2b(PEG-INTRONM)實體瘤、HIVu期需要經(jīng)常注射。而ASNase是從大腸桿菌中提純川來喜樹堿(PROTHECANTM/非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞I期的，在重復(fù)注射的條件下容易引發(fā)危險的免疫反應(yīng)"0。PEG-camptothecin)肺癌、胰腺癌.胃癌.PEG修飾后L天冬酰胺酶可以降低免疫原性，聚乙人血白蛋白血漿代用站1/1期二醇天冬酰胺酶(ONCASPARTM) 于1994年2月上市，牛血紅蛋白(PEG-hemoglobin)癌癥I期紫杉酶(PECG-paclitaxel)晚煳實體瘤和白血病I 期是第2個被批準(zhǔn)的聚乙二醇藥物，用于治療急性淋巴尿酸酶(PEG-Uricase)痛風(fēng)性白血病和惡性黑色素瘤。細(xì)胞毒索(PEG-cytotoxics)臨床前近幾年，新的梳狀PEG衍生物分子PM 13(分 子量單鏈抗原結(jié)合蛋白(PEG-SCAs)約13 000)和PM 100(分f量約100 000)也被用于蛋白質(zhì)干擾索a-2a(PEGASYS")乙肝①期的修飾。與線狀的PEGI和分枝狀的PEG2相比，PM下擾紊a -2a+鹽酸組胺病癥、丙肝修飾的ASP在較低修飾程度時即能降低免疫反應(yīng)性，(PEGASYSIM+ Maxamnine)同時保留較高的酶話性11.121。+擾素ax-2a+利巴書林丙肝山期干擾素(interferon IFN) lFN 是一類能提高機(jī)體免(PEGASYSM+ COPEGUSTM)粒細(xì)胞集落刺激因了1期疫力，具有抗病毒、抗腫瘤作用的細(xì)胞因子?？共《咀饔檬峭ㄟ^在細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)一種對抗病毒感染的狀態(tài)和(Pegylated G-CSF)腫瘤壞死因子(PEG-sTNF-RI)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎0期調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的效應(yīng)去中和病毒或清除受病毒感染的聚乙二醇抗-TNF a抗體片斷JCDP870鳳濕性關(guān)節(jié)炎I /四期細(xì)胞。1FN 的抗腫瘤機(jī)制尚不明確，但它能引起人類腫(PEG-anti-TNF a antibody fragment)瘤細(xì)胞的以下幾種改變。人類腫瘸細(xì)胞顯示出DNA.聚乙醇抗PDGF- B受體腫瘤RNA和蛋白合成的顯著減少;在體外試驗?zāi)軐Χ喾N人人源化抗體片斷CDP860類腫瘤細(xì)胞發(fā)揮共抗增生作用;抑制移植到裸鼠的人CDP 791/PEG-Anti-GFR antibody臨床崩類腫瘤細(xì)胞的生長。CDP 484/PEG-Anti-IL- Ibeta antibody炎癥疾病目前，PEG修飾的IFN a即PEG INTRONM (聚乙干擾索a-l(PEG-infergen)丙二醇千擾素a -2b)于2001-01上市，PEGASYSTM (聚乙MACUGENTM(PS*)滲出性(濕性)凹期二醇干擾素a -2a)于2001-08上市。用于治療丙肝的抗VEGF的Aptamer老年黃斑變性(AMD)PEG-IFN a -1和PEG-interferon β -Ia都正處于1期臨床。睫狀體神經(jīng)營養(yǎng)因子, CNTF嚴(yán)重肥胖修飾后的IFN a具有如下特性。增加了生物利用(PEG-Axokine )干擾素- B -1a(PEG-interferon β -1a)度，增強(qiáng)了有效性和安全性，減少了免疫原性和毒性生長徼素釋放因了(PEG-GHRF)以及延長了半衰期。水蛭素(PEG Hirudin)外科:手術(shù)I期.粒細(xì)胞集落剌激因子(granulocyre colony stimulaing尿酸酶(Puricase 1 PEG-Uricase)factor, G-CSF) 分子量為19000左右，叮誘導(dǎo)造血干細(xì)白介索-2(PEG-IL-2)抗HIV感染胞的增殖和分化，致血液中的中性粒細(xì)胞數(shù)月增加，PEG-水凝膠防止手術(shù)后粘著美國咖另外它還能刺激成熟中性粒細(xì)胞從骨髓中釋出并激活*PS: pegaptanib sodium.中性封細(xì)胞的功能常用千治療因化療或先天原因?qū)е袊夯HCNMHGChin J Clin Pharmacol229」Jan.2003.Vo. 19No XSeriaNno.43)致的血液中中性粒細(xì)胞數(shù)口減少等癥。GCSF 的毒性較4結(jié)語輕，半衰期知短"。聚乙:醇藥物是在原有藥物的基礎(chǔ)上，通過改良PEG修飾G-CSF于2002.1上市，它對多核性中性粒產(chǎn)品特性來進(jìn)-步擴(kuò)大臨床應(yīng)用范圍。由于聚乙醇細(xì)胞引發(fā)功能和集落刺激功能發(fā)生分離|41，前者在化技術(shù)為藥物帶來了許多優(yōu)良的產(chǎn)品特性，開拓了新PEG修飾后增強(qiáng)，而后者保持不變或減弱，說明用PEG藥研發(fā)的新領(lǐng)域。修飾某些蛋白質(zhì)分子可精細(xì)地改變其生物活性范圍，從而開粹新的臨床應(yīng)用范圍。參考文獻(xiàn):超氧化物歧化酶(superoxide dismutase. SOD)能1川夠催化氧自由基的歧化反應(yīng)，足機(jī)體消除有害氧自由perspectives. Int J Pepr Protein Res, 1987:29:145.基的重要的酶。大多數(shù)氧A白由基在頭部創(chuàng)傷部位的腦[21 魏米.聚乙二醇化干擾索及在內(nèi)型肝炎治療中的應(yīng)用.新消化雜志、2001;9:1296-1299.血管晚處存積時，可造成神經(jīng)元損傷、局部缺血性神[3|付春曉 蛋白的聚乙二醇修飾及其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。經(jīng)元損傷和血管損傷，從而導(dǎo)致血管痙攣。SOD對放國外醫(yī)學(xué)一藥學(xué)分冊. 2001:28:78-81.射性損傷、氨巾毒、再灌性損傷以及各種炎癥，尤其[4」 熊成東，王亞輝，袁明龍，等.聚乙二醇術(shù)生物的合成研是對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎均具有良好的治療作用9)。究進(jìn)展.高分了通報，2000;1:39-45.但該酶有生物半衰期短，異體蛋白免疫原性和忠15) Veronese FM. Peptide and protein PEGylation: are view of pro-者不易吸收利用等缺點，因而限制了其臨床應(yīng)用。該blems and solutions. Biomaterials, 200122:405-417.酶經(jīng)過聚乙“:醇修飾后，克服了以上缺點?？捎糜谥?161 關(guān)潔，劉景晶、胡卓逸。蛋白質(zhì)藥物的聚厶二醇修飾.藥療腦損傷的聚乙二醇SOD正處于申報階段。學(xué)進(jìn)展.2002;26:146-151.腫瘤壞死因子(umor necrosis factor TNF) TNF- a[7| Yuji I, Makoto F. Hideyuji s, et al, Biomedical and biotchnologicalI applications of PEG-and PM -modified proteins. Tibrech, 1995:是由激活巨嗜細(xì)胞產(chǎn)生的-種蛋白，具有重要的生理13:86-91.功能。它具有協(xié)同的抗腫瘤效能: - - 方面直接表現(xiàn)為8] Frrggia B. Nerli B. Nuci HD, et al. Thermal features of the對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用:另方面可激話宿主的抗bovine senum albumnin unfolding bhy polyethylene glycols. Int J Biol腫瘤應(yīng)答并選擇性地|起腫瘤組織內(nèi)部的微循壞障礙。Macromol, 199;26:23.但是，TNF- a在體內(nèi)的清除速率很快，要產(chǎn)生明顯的9] Fischer A. Hacein Bey s, Cavazzana-Cavo M, et al. Gene therapy抗腫瘤效果需要非常大的使用劑量，由此常引發(fā)一系of severe combined immunodeficiencies. Nature Reviews Immuno-列肛重的毒副作用，包括發(fā)熱、組織炎癥和組織損傷，logy, 202:615-621.甚至是致命的內(nèi)毒素性休克樣綜合征。PEG修飾可以[101 Francois JI Frotier G. Immobilization of L asparaginase intoa biocompaible poly(ethylene glycol)albumin hydrogel I: prepar-明顯升高TNF- a的生物活性，通過減少給藥劑量達(dá)到ation and in viro characterization. Biotechnol App! Biochem,降低毒副作用的目的1?？捎糜谥委燂L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的1996;23:221-226.PEGs-TNF-R1正處于I期臨術(shù)。[11] Sekine T. Kodera Y. Saito T, et al. L asparaginase modified by poly(ethyene glycol) derivative with a comb shaped form anti tumor3藥物聚乙二醇化技術(shù)的專 利情況activity and induction of immune lolerance. Biomed Res, 199;目前國內(nèi)已授權(quán)的聚乙:二醇專利情況共計4篇，其16:121.中涉及聚乙醇干擾素制備的專利有2個;涉及聚乙[12] Kodera Y,:kine T, Yasukohchi T, er al. Stabilization of L aspar-二醇應(yīng)用于巨核細(xì)胞生長發(fā)育因子MGDF多肽的專利aginase modified with comb shaped poly(thylene glycol) deriv-有1個:涉及聚乙二醇蛋白質(zhì)結(jié)合物的制備方法的專atives, in vivo and in viro.Bioconjugate Chem, 1994;5:283.利有1個。13] 印春華，張敏蛋白質(zhì)和多肽類藥物的聚乙二醇結(jié)含物一-種新型給藥系統(tǒng).中國藥學(xué)雜志, 2001;36:292~296.另外還有22篇涉及聚乙.:醇的專利在公開階段。目前國內(nèi)機(jī)構(gòu)和個人申請井已公開的專利有6個，[l4] Knusi c, Delgado C, Malik F. et al. Polyethylene glycol(PEG)modification of granulocyte macrophage colony stimulating factor說明國內(nèi)已經(jīng)開始注重聚乙二醇修飾的研究和開發(fā)，(GM CSF) enhances neurohilprining activity but not colony但較國外相差還很遠(yuǎn)。stimulating acivity. Br J Hematol, 1992:82:654~663.在全部授權(quán)和公開的專利中，國外制藥大公司掌15] Somack R, Saifer M G, Wiliams L D. Preparaion of longactng握了大部分的聚厶二醇相關(guān)專利(共計20個),涉及superoxide dismutase using high molecular weight polyethylene的范圍包括聚乙:醇 干擾素制備、聚乙二醇干擾索治glycol. Free Radic Res Commun, 1991;12/13:553-562.療應(yīng)用、促紅細(xì)胞生成素、腦神經(jīng)營養(yǎng)因卜BDNF多[16] Tsusumi Y, KihiraT, Yamamoto s, et al. Chemical modification肽、巨核細(xì)胞生長發(fā)育因子MGDF多肽和聚乙二醇街of natural human tumor necrosis factor alpha wilh polyethyleneglycol increases its anti tumor potency. Jpn J Cancer Res, 1994;生物的制備等方面。85:9-12.中國煤化工MHCNMHG