第35卷第5期第659頁華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)Vol.35 No.5 P. 6592006年10月Acta Med Univ Sci Technol H uazhongOct. 2006聚乙二醇去細(xì)胞化組織工程帶瓣管道的物理特性蔣雄剛'徐鵬'韓嘯!楊華靜’張凱倫'I華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心血管外科,武漢4300222華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,武漢430030摘要目的探討聚乙二醇(PEG)法在生物帶瓣管道準(zhǔn)備中的應(yīng)用價(jià)值,比較PEG去細(xì)胞前后帶瓣管道的物理特性。方法豬主動(dòng)脈瓣帶瓣管道分為去細(xì)胞組和正常對照組,去細(xì)胞組用PEG和DNaseI處理,蘇木精-伊紅染色觀察去細(xì)胞情況,DNA含量測定,計(jì)算去細(xì)胞百分率;豬主動(dòng)脈帶瓣管道條置于力學(xué)測試儀,測定最大負(fù)荷、最大應(yīng)力最大應(yīng)變和彈性模量。結(jié)果PEG 組去細(xì)胞百分率為95. 32%,去細(xì)胞豬帶瓣管道組織中看不到細(xì)胞成分;且細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)結(jié)構(gòu)保存完整,膠原纖維排列整齊,無明顯斷裂,仍呈波浪狀平行排列,結(jié)構(gòu)緊湊,彈性纖維結(jié)構(gòu)清晰,組織無明顯水腫。生物力學(xué)檢測,與對照組比較最大負(fù)荷、最大應(yīng)力、彈性模量、最大應(yīng)變等的差異均無顯著性意義。結(jié)論P(yáng)EG法去除細(xì)胞完全,細(xì)胞外基質(zhì)保存完整,對組織機(jī)械性能無明顯影響,適于構(gòu)建組織工程帶瓣管道。關(guān)鍵詞組織工程; 聚乙二醇; 生物帶瓣管道 ;去 細(xì)胞化中圖法分類號R318. 1Biophysics of Acellular Porcine Valved Conduits by Decellularization with Poly Ethylene GlycolJiang Xionggang，Xu Peng, Han Xiao et alDe partment of Cardiovascular Surgery, Union Hos pital, Tongji Medical College ,Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022Abstract Objective To study a new method of preparing acellular porcine valved conduits by decellularization with polyethylene glycol and to observe the change of mechanical properties. Methods The porcine aortic conduits were decellularizedwith poly ethylene glycol (PEG) and DNase I，while the fresh porcine aortic conduits were used as control. Histological ex-amination of them stained with HE dye was done. The content of DNA was detected in the two groups by photometer. The me-chanical properties were assessed by AGS-J. Results The decellularizing percentage was 95. 32 % and the structure of extracellular matrix (ECM) was well reserved in PEG group. The mechanical properties had no significant difference between thetwo groups in peak load, maximal stress, etc. Conclusion The method of PEG could remove cellular components effectively,while it did not disrupt the histological structure of ECM and the mechanical properties.Key words tissue engineering; poly ethylene glycol; porcine cardiovascular conduits; decellularization組織工程是運(yùn)用工程學(xué)和生命科學(xué)的原理,構(gòu)~3cm的管道組織,分為去細(xì)胞組和對照組,每組建生物替代品,用以維持、恢復(fù)和提高組織的功能。各5個(gè)管道組織?，F(xiàn)已有多種不同的去細(xì)胞方法用來制作去細(xì)胞天然1.2去細(xì)胞組帶瓣管道的制備生物支架,但是這些方法或多或少存在不足,所以尋①新鮮豬動(dòng)脈帶瓣管道首先置入含抗生素PBS找-種最佳的去細(xì)胞方法仍是構(gòu)建組織工程生物支液(NaCl:8 g/L.KCl:0.2 g/L, KH2PO2:0.2 g/L,架的重要組成部分。本實(shí)驗(yàn)采用1%聚乙二醇.Naz HPO4:3.48 g/L,青霉素,鏈霉素各100 U/ml)(PEG)和DNase I處理豬帶瓣管道組織，探討中漂洗數(shù)次,除去血塊和黏著物。②放入1 g/mlPEG法在生物帶瓣管道準(zhǔn)備中的應(yīng)用價(jià)值,并比較PEG(Mw=1 000,上海浦東高南化工廠)中,室溫下PEG去細(xì)胞前后帶瓣管道的物理特性。浸泡30~45 min.振蕩器加以振蕩。③含抗生素PBS液浸中國煤化工U/ml DNase I液(Sig-材料和方法maMYH.CNMHG素PBS液浸泡24hx1.1實(shí)驗(yàn)材料與分組3次,置入含抗生素PBS液于4 'C 保存待用。取剛宰殺成年豬的心臟，取其動(dòng)脈瓣和瓣上21.3新鮮帶瓣管道的制備用含抗生素PBS反復(fù)沖洗3次后,以含抗生素蔣雄剛，男,萬方數(shù)副教授PBS液浸泡30 min后置于4 'C 保存待用。華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)2006年10月第35卷第5期1.4組織形 態(tài)學(xué)觀察測試儀,協(xié)和醫(yī)院骨科力學(xué)實(shí)驗(yàn)室),夾持間距為10從去細(xì)胞組和對照組分別切取6塊管道壁組mm。以5mm/min將瓣膜向兩邊拉伸,記錄最大織,4%多聚甲醛固定后,蘇木精伊紅染色觀察去細(xì)負(fù)荷、最大應(yīng)力、最大應(yīng)變和彈性模量。胞情況,膠原纖維和彈力纖維染色了解管道細(xì)胞外1.7 統(tǒng)計(jì)分析基質(zhì)狀況。采用SPSS 12. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)1.5 DNA含量測定以x士s表示,樣本均數(shù)比較用組間t檢驗(yàn)，P<<從去細(xì)胞組和對照組分別隨機(jī)切取6塊管道壁0.05為差異有顯著性意義。組織,各稱重100 mg后放入深低溫冰箱凍存3 h,2結(jié)果將凍存組織研磨,PBS勻漿，3 000 r/min 離心5min。加入RNA裂解液500μl和20mg/ml蛋白酶2.1組織形 態(tài)學(xué)觀察K5pμl,37C水浴12h;加500μl酚氯仿異戊醇新鮮帶瓣管道組織柔軟,略帶粉紅色,去細(xì)胞組(25 : 24 : 1),10 000 r/min離心15 min;水相移入管道組織較新鮮組織略薄，呈乳白色。切片觀察,對新管,加3 mol/L醋酸鈉40 μl,與1 ml冷無水乙醇照組含有大量的細(xì)胞結(jié)構(gòu),包括間皮細(xì)胞、成纖維細(xì)混勻,一20 'C 靜置30 min;14 000 r/min 離心20胞、內(nèi)皮細(xì)胞及毛細(xì)血管等,并有網(wǎng)格狀的膠原纖維min,棄上清;室溫干燥10 min后,沉淀溶于40 μl和彈性纖維(圖1A,封4)。去細(xì)胞豬帶瓣管道組織TE緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L ED-中基本看不到細(xì)胞成分,膠原纖維排列整齊,無明顯TA,pH 8. 0),分光光度計(jì)測定260 nm處吸光度斷裂,仍呈波浪狀平行排列,結(jié)構(gòu)緊湊,彈性纖維結(jié)(A)值。去細(xì)胞率(%)=(對照組A值-去細(xì)胞組構(gòu)清晰,組織無明顯水腫(圖1B、C.D,封4)。A值)/對照組A值X 100%。2.2 dNA 含量分析1.6 力學(xué)測試PEG處理后去細(xì)胞百分率為95.32%。去細(xì)胞組和對照組分別隨機(jī)切取8塊管道壁組2.3生物力 學(xué)測試結(jié)果織，管道壁組織沿長軸剪成1.5cmX0.8cm矩形條與新鮮帶瓣管道組織相比，去細(xì)胞組織最大負(fù)塊,夾持在兩片細(xì)砂紙做成的框架中。帶組織條塊.荷、最大應(yīng)力,彈性模量,最大應(yīng)變等差異均無統(tǒng)計(jì)的砂紙框架兩邊夾于力學(xué)測試儀(AGS-J電子萬能學(xué)意義(表1)。表1兩組帶瓣管道機(jī)械性能測試比較(z士s,n=8)分組最大負(fù)荷(N) .最大應(yīng)力(N/ mm)最大應(yīng)變(mm/N)彈性模量去細(xì)胞組21. 242士1.4354. 877士0.57235. 118士6. 04516.549士0.678對照組25. 586士1.6935. 974士0. 34233. 685士7.53317. 152士1.579有功能的組織”。對生物材料的處理,目前多使用3討論去細(xì)胞方法[2]。去細(xì)胞生物材料在完全去除原有細(xì)心臟外科許多疾病的治療涉及半月瓣及其所屬胞成分的基礎(chǔ)上,因保留完整的瓣膜細(xì)胞外基質(zhì)血管的替換，臨床上許多手術(shù)如Rastalli、 Ross、(ECM),使種子細(xì)胞易于黏附和生長叼,且由于主Konno、Norwoodll期手術(shù)等都需要以帶瓣管道為要組織相容性抗原存在于所有有核細(xì)胞，帶瓣管道材料。目前臨床應(yīng)用的人工帶瓣管道為大口徑的機(jī)去細(xì)胞處理消除了細(xì)胞表面主要組織相容性抗原和械瓣膜,不適合小兒應(yīng)用,并需終生抗凝。生物帶瓣細(xì)胞內(nèi)的蛋白抗原,改善了組織相容性,能明顯減少管道則具有較好的組織相容性和更廣泛的適應(yīng)證。由異種細(xì)胞引起的免疫反應(yīng)所造成的瓣膜鈣化和衰但異體組織免疫原性所致酶、化學(xué)降解使帶瓣管道敗*]故被認(rèn)為是-種具有前途的組織工程生物材變性、撕裂、鈣化、新生物形成,嚴(yán)重影響了帶瓣管道料。中國煤化工組織形態(tài)學(xué)與人類相.的使用壽命。因此對異體帶瓣管道進(jìn)行預(yù)處理以消以[5MYH. CNMH G究?，F(xiàn)已有多種不同除免疫原性、防止降解、增強(qiáng)修復(fù)和再生的能力是生的去細(xì)胞方法用來制作去細(xì)胞天然生物支架,均取物帶瓣管道研究的目標(biāo)。得一定的效果+10]。理想的帶瓣管道應(yīng)具有良好的組織工程的理想目標(biāo)，是將自體活細(xì)胞種植于組織相容性和較好的物理特性,其制備的關(guān)鍵在于高分子材料或坐物材料等可降解支架上,最終形成去細(xì)胞程度和ECM完整性的保留。經(jīng)典的Tri-蔣雄剛等.聚乙二醇去細(xì)胞化組織工程帶瓣管道的物理特性tonX-100、胰酶EDTA四步法在去細(xì)胞的同時(shí)對=考文獻(xiàn)ECM也具有一定的消化作用,其去細(xì)胞后帶瓣管道的機(jī)械強(qiáng)度受到影響。因此尋找一種最佳的去細(xì)胞[1]葉福林,徐志云,張寶仁,等.去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣葉的獲取和內(nèi)皮細(xì)胞的種植[J].中國修復(fù)重建外科雜志,2003, 17(6):方法仍是構(gòu)建組織工程生物支架的重要組成部分。本實(shí)驗(yàn)采用1%PEG和DNaseI處理豬帶瓣管[2]LETH R G，WILHELMI M，WALLES T, et al. Acellu-larized porcine heart valve scaffolds for heart valve tissue en-道組織，結(jié)果顯示經(jīng)PEG處理后的帶瓣管道組織gineering and the risk of cross spices transmission of porcine中幾乎所有細(xì)胞成分均被去除,去細(xì)胞百分率達(dá)到endogenous retrovirus[J]. J Thorac Cardiovase Surg, 2003,126(3): 1000- 1004.95.32%,且組織形態(tài)學(xué)觀察,處理后的膠原纖維、彈[3]HODDEJ P, RECORDR D, TULLIUSRS, et al. Reten-tion of endothelial cell adherence toporcine- derived extracellu-力纖維仍保存清晰的層狀結(jié)構(gòu),無明顯斷裂、空洞、lar matrixafter dsisnfection and sterilization[J]. Tissue Eng,或組織水腫,支架的空間結(jié)構(gòu)完整保存。豬主動(dòng)脈[4]2002,8 (2): 225-234.SIMON A, WILHELMI M, STEINHOFF G, et al. Cardiace中主要含有II、II型膠原和部分彈力纖維,其力學(xué)特valve endothelial cells: relevance in the long term function of性主要由這些成分決定。最大限度保存ECM成分biologic valve prostheses[J]. J Thorac Cardiovasc Surg，1998, 116(4); 609-614.對維持生物支架固有的力學(xué)強(qiáng)度具有重大意義。本[5]葉福林.徐志云,張寶仁,等.豬主動(dòng)脈組織工程瓣膜制備的初步研究[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2003 ,24(3): 242-244.實(shí)驗(yàn)力學(xué)測試表明去細(xì)胞處理后的最大負(fù)荷和最大[6]CURTIL A. PEGG DE, WILSON A. Freeze drying of car應(yīng)力和新鮮組織無明顯差異,表明此法將豬主動(dòng)脈diac valves in preparation for cellular repopulation[J]. Cryo-biology, 1997, 34(1): 13-22.去細(xì)胞后所獲得的纖維支架可以滿足組織工程支架[7]LIVESEY s, BOERBOOM L, COLEMAN C. Dellularized的強(qiáng)度要求。porcine heart valves as templates for host cell repopulation[M]. Georgia:Georgia Institue of Technology, 1998.PEG法去細(xì)胞成分徹底,而對豬主動(dòng)脈組織結(jié)[8]BADER A. HERDEN T, GIERE B, et al. Tissue engineer-ing of autologous heart valves using a physiologic matrix構(gòu)和力學(xué)性能無明顯影響。與常用的TritonX-structure[J]. EurJ Cell Biol, 1997, 74(1): 8-15.100、胰酶EDTA四步法相比，使用試劑少,操作簡[9]BADER A, SCHILLING T, TEEBKENOE, et al. Tissueengineering of heart valves- human endothelial cell seeding of化,去細(xì)胞過程更加方便、有效。用此法去細(xì)胞處理detergent acellularized porcine valves[J]. Eur J Cardiothorac后的豬主動(dòng)脈組織機(jī)械性能保持不變,組織結(jié)構(gòu)無[10] RIEDER E, KASIMIR M T, SILBERHUMERG, etal. DeSurg，1998， 14(2): 279-284.明顯破壞.完整的細(xì)胞外基質(zhì)提供了細(xì)胞黏附生長cellularization protocols of porcine heart valves differ impor-的正常結(jié)構(gòu)和生理環(huán)境,為受體細(xì)胞化組織工程瓣tantly in efficiency of cell removal and susceptibility of thematrix to recellularization with human vascular cells[J]. J膜的研制提供了可靠的天然支架材料。Thorac Cardiovasc Surg, 2004, 127(3): 399-405. .(2006-02-20收稿)(.上接第658頁)內(nèi)皮源性NO以拮抗低氧引起的縮血管反應(yīng),另-dentification by morphologic and immunologic criteria[J]. JClin Invest, 1973. 52(9): 2745-2756.方面血管內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出ICAM-1高表達(dá)的表型,[2] TANUS SANTOSJ E, MORENO H. Is there a place for in-加劇了血小板的黏附與聚集,進(jìn)而導(dǎo)致血管收縮因haled nitric oxide in the therapy of massive pulmonary embol-ism ?[J]. Anesthesiology, 2001, 94 (2): 354.子和舒張因子平衡的失調(diào),使得白細(xì)胞及血小板黏[3] TRUMMER G, BERCHT0LD HERZ M, MARTINJ, etal.附、血栓形成、平滑肌細(xì)胞異常增生并向內(nèi)膜遷移,Successful treatment of pulmonary hypertension with inhalednitric oxide after pulmonary embolectomy[ J ]. Ann Thorac進(jìn)一步加劇了肺血管的缺血低氧。本研究結(jié)果提示在低氧狀態(tài)下NO與ICAM-1[4] WAKEFIELDT w, STRIETER R M, WILKEC A.et al.Venous thrombosis associated inflammation and attenuation均有-定水平的上升,推測在低氧性肺血管疾病中,with neutralizing antibodies to cytokines and adhesion mole-cules[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1995, 15(2):258-NO與ICAM-1作為生理介質(zhì)發(fā)揮了重要的的調(diào)控作用,進(jìn)-步的研究將有助于血栓性疾病的防治。5]中國煤化工al. Reduced neointima hyper-terellular adhesion molecule-YHC N M H Goo, 86(4):434-440.參.考文獻(xiàn)[6] TORBICKI A，VAN BEEK EJ R. CHARBONNIER B, etal. Guidelines on diagnosis and management of acute pulmona-[1] JAFFEE A, N ACHMAN R L, BECHERCG, et al. Cul-ry embolism[J]. Eur Heart J,2000,21(16):1301-1336.ture of human endothelial cells derived from umbilical vein. I-(2005-11-25收稿>聚乙二醇去細(xì)胞化組織工程帶瓣管道的物理特性[正文見第659頁]A:對照組蘇木精伊紅染色;B:去細(xì)胞組蘇木精-伊紅染色:C:去細(xì)胞組膠原纖維染色:D:去細(xì)胞組彈力纖維染色圖1豬動(dòng)脈帶瓣管道組織形態(tài)學(xué)觀察( X 100)華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)主管單位中華 人民共和國教育部Superised by Ministry of Education.主辦單位華中科技大學(xué)Pcople's Republic of China(醫(yī)學(xué)版)編輯出版華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院Sponsored by Huazhong UniversityActa Med Univ Sci學(xué)報(bào)編輯部of Science and TechnologyEdited by Ediorial Department ofTechnol Huazhong(430030武漢航空路13號)Tongi Medical College of HUST日刷長江水利委 員會航測信息雙月刊Bimonthly(13 Hangkong Road. Wuhan工程院印刷廠430030)名譽(yù)主編裘法祖國內(nèi)發(fā)行武漢 市郵局SuberiptionHonorary Chief Editor Qiu Fazu訂購處全國各地部局Domestic: Post Offices of Dif-主編田玉科國外發(fā)行中國國際圖 書貿(mào)易總公司ferent Levels in ChinaChief Editor Tian Yuke(北京399信箱)Foreign: China lntenaional Book發(fā)行范圍公開發(fā)行TradingCorp. P. 0. Box2006年第35卷第5期廣告經(jīng)營許可證號武工商廣字399. Beijing, China2006年10月出版4201004000670號E mail: tjxb@ mails. tjmu. edu. cnOet. 2006 Vol. 35 No. 5刊號: ISSN 1672-0741 CODEN中國煤化工1957年3月創(chuàng)刊CN 42-1678/R國內(nèi)代號:38-37國外代號:BM198國內(nèi)定價(jià)MHCNMHG