第62卷第10期化工學(xué)報 Vol. 62 No.102011年10月 CIESC Journal October 2011 KEECEEEEEEEG研究論文聚乙二醇修飾重組人干擾素的過程優(yōu)化潘紅春1,劉紅,程永剛2,彭力2,徐波2,楊紅濤2(西南大學(xué)藥學(xué)院,重慶400716;2太極集團(tuán)西南藥業(yè)股份有限公司,重慶400038)摘要:采用分子量20000直鏈單甲氧基PEG琥珀酰亞胺琥珀酸酯(mPEG-SS)對畢赤酵母表達(dá)的重組人干擾素(rhIFNw)進(jìn)行氨基化學(xué)修飾,以期獲得抗原性降低及穩(wěn)定性增加的單鏈PEG修飾產(chǎn)物(peg--rhIFN)。建立了PEG修 rhIFNw飾的反應(yīng)體系,考察了修飾反應(yīng)各因素對單修飾產(chǎn)物得率的影響,優(yōu)化修飾工藝條件為:反應(yīng)體系起始pH值8.5, rhIFNw/PEG摩爾比1:7, rhIFNw濃度0.75mgml-2,磷酸鹽緩沖液濃度50mmol·L-1,于25℃振蕩反應(yīng)4h,用30%冰醋酸終止應(yīng).在優(yōu)化條件下,單鏈 PEG-rhIFN含量和修飾率分別達(dá)到0.25mg·ml-和34.63%。純化后的單鏈 PEG-rhIFNw具有典型PEG修飾蛋白的特性,體外抗病毒活性保留了天然 rhIFNo抗病毒活性的15%。關(guān)鍵詞:重組人干擾素;聚乙二醇;過程優(yōu)化;抗病毒活性o:10.3969/.issn.0438-1157.2011.10.028中圖分類號:TQ031.2;TQ021.8文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A文章編號:0438-1157(2011)10-2876-09 Processing parameters optimization of PEGylation of recombinant human interferon omega PAN Hongchun'', LIU Hong', CHENG Yonggang'2, PENG Li,xubo2, YANG Hongtao2 School of Pharmaceutical Sciences, Southwest University, Chongqing 400716, China; 2 Southwest Pharmaceuticals Company Limited Liability, Taiji Group, Chongqing 400038, China) Abstract: In order to reduce the antigenicity and enhance the stability of the recombinant human interferon omega (rhIFNw) expressed in Pichia pastoris, the amino group modification of rhIFNw with mono- methoxy polyethylene glycol succinimidyl succinate(mpeg-ss,00) was investigated. It was found that the optimized reaction conditions for the highest modification yield of mono PEG-rhIFNw were as follows: in 50 mmol.L-I and pH 8. 5 phosphate buffer, concentration of rhIFNw 0. 75 mg.ml-I, molar ratio of rhIFNw to PEG 1 7, and reaction time4 h at 25C. Under the optimized conditions, the content and modification yield of mono PEG-rhIFNw- reached.25mg.ml-and34.3%, respectively.he purified PEG-rhIFNo had the characteristics of typical PEGylated protein. The experiments showed that the antiviral activity of prepared PEG-rhIFNw could retain about 15% of the antiviral activity of the native rhIFNw Key words: recombinant human interferon omega(rhIFNw); PEGylation; process optimization; antiviral activity2011-01-07收到初稿,2011-05-29收到修改稿 Received date: 2011-01-07.聯(lián)系人:劉紅。第一作者:潘紅春(1966一),女博士,教 corresponding author: liu Hong, Ihphch@126.com授級高級工程師第10期潘紅春等:聚乙二醇修飾重組人干擾素的過程優(yōu)化2877二極管陣列檢測器, SHIMADZU2410紫外分光引言光度計, Phast-System-全自動水平電泳儀,Bio重組人干擾素(recombinant human inter--Rad680型酶標(biāo)儀。 feron omega, rhIFNw)是一種多功能細(xì)胞因子, rhIFNo原液,由畢赤酵母表達(dá),純度大于它可在細(xì)胞表面與特殊受體結(jié)合而發(fā)揮抗病毒、抗98%,抗病毒活性1.81×10U·m1-1,比活性細(xì)胞增殖和免疫調(diào)節(jié)作用尤其對肝炎病8.82×107IU·(mg蛋白)1,西南藥業(yè)股份有限毒、SARA病毒、多種腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的抑制公司提供;單甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亞胺酯作用,臨床上有望開發(fā)成一種有效的抗病毒抗腫瘤(mPEG-SS),直鏈,分子量20000士300,純度藥物。然而,rhFN依然存在天然蛋白藥物的體98%, SigmaPEG-r公司出品單鏈原液,、。,內(nèi)半衰期短、免疫原性強(qiáng)等諸多不足,使其應(yīng)用開純度大于98%,抗病毒活性2.79×10iu·ml-,發(fā)速度受限。目前,有關(guān)克服 rhIFNw局限性的研比活性1.51×107IU·(mg蛋白)-1,本所自制;究報道較少,僅有美國 Intarcia Therapeutics公司 rhIFNw標(biāo)準(zhǔn)品,CHO表達(dá),購于WHO,編號為利用 DUROS微滲透泵技術(shù)實(shí)現(xiàn)了 rhIFNw的皮94/754,活性單位20000I·安瓿1下脈沖緩釋給藥1.2 rhIFN的PEG修飾和純化聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)化學(xué)將適量純度98% rhIFNw原液加入到一定pH修飾技術(shù)已成為改善蛋白質(zhì)、多肽、抗體、值和濃度的磷酸緩沖液中,使 rhIFNw達(dá)到需要的基因治療等藥物臨床療效的重要手段,在提高藥濃度,按照預(yù)先確定的rhIFNw/E摩爾比加入物穩(wěn)定性、延長半衰期、降低免疫原性、提高藥物PEG,混合均勻后于一定溫度下、200rmin振水溶性等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。迄今,至少已蕩反應(yīng)確定時間,然后加入適量30%冰醋酸溶液有8種PEG修飾的蛋白和多肽類藥物被批準(zhǔn)應(yīng)用終止反應(yīng)。利用 Sepharose離子交換層析和 Super-于臨床疾病治療,且有更多正在經(jīng)歷臨床實(shí)驗。dexG凝膠過濾層析組合,先除去 rhIFNoo,再除PEG修飾蛋白分子是一個極其復(fù)雜的過程,修飾去多鏈PE- -rhIFNw副產(chǎn)物。效果受到諸多因素的影響,如蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、修飾方1.3PEG修飾 rhIFNo過程中pH值變化自動監(jiān)式、PEG分子結(jié)構(gòu)、分子量大小、修飾條件等。測和控制近年來,PEG修飾技術(shù)呈現(xiàn)出一些新趨勢L10,已將pH電極置入放大反應(yīng)體系中,用能自動監(jiān)開發(fā)出許多針對某些氨基酸側(cè)鏈或末端氨基進(jìn)行選測和控制pH值的發(fā)酵控制系統(tǒng)自動監(jiān)測反應(yīng)體系擇性修飾的修飾劑。pH值變化,從而獲得PEG修飾 rhIFNw過程的本文作者針對 rhIFNw蛋白分子中游離賴氨酸pH值變化曲線。通過該控制系統(tǒng),用酸堿溶液控側(cè)鏈E氨基和N末端氨基,用分子量2000的直制反應(yīng)體系pH值在需要范圍內(nèi),以促進(jìn)PEG化鏈單甲氧PEG琥珀酰亞胺琥珀酸酯(monome學(xué)修飾反應(yīng)進(jìn)行 thoxy polyethylene glycol succinimidyl succinate1.4peg- -rhIFNco含量測定mPEG-SS)對rhIFNw分子中的游離氨基進(jìn)行選擇采用RPHPLC法同時測定反應(yīng)混合液中單鏈性化學(xué)修飾,以期獲得高單鏈PEG修飾率和少位 PEG-rhIFNw和殘留rhIF含量。色譜柱為Wa置異構(gòu)體。通過PEG修飾條件優(yōu)化、分離純化、ters公司 Symmetry300m4反相柱(250mm×結(jié)構(gòu)表征、位置異構(gòu)體、理化性質(zhì)等研究,發(fā)現(xiàn)純4.6mm,30nm,5um),流動相A為水:TFA=化的單鏈 PEG-rhIFNo僅含2種位置異構(gòu)體。本990:10(pH2.2),流動相B為100%乙氰,流速文將著重報道PEG修 rhIFNw飾過程中各修飾條為1.0ml·min-1。線性梯度洗脫和等度洗脫相結(jié)件優(yōu)化的研究結(jié)果以及單鏈EG化 rhIFN合,流動相用前均經(jīng)0.45m尼龍膜過濾、脫氣,(peg--rhIFNw)的體外抗病毒活性。檢測波長280nm,柱溫30℃,每次進(jìn)樣30μl1.5PEg修飾率的計算1實(shí)驗根據(jù)反應(yīng)混合液中 rhIFNw殘留量和反應(yīng)初始1.1儀器與試劑體系 rhIFNw含量,計算總pg- -rhIFNw修飾率, Waters2695高效液相色譜儀, Waters2996其中包括單鏈PEG修飾和多鏈PEG修飾產(chǎn)物。計2878化工學(xué)報第62卷算公式為1反應(yīng)體系殘留rhN濃度總PEG修飾率換算后反應(yīng)體系初始 thFNw濃度100% mPEG-O-C-H2C-CH2-C-O-N+(1 mPEG-succinimidyl snccinate根據(jù)單鏈Pg- -rhIFNw含量和反應(yīng)初始體系 incubate rhIFNw含量,計算單鏈PE- -rhIFNo修飾率,計算公式為單鏈PEG修飾率反應(yīng)體系單鏈 PEG-rhIFN濃度 mPEG-o-c-H2C-CH2-C-HN-mIFNoo+OH-N換算后反應(yīng)體系初始 rhIFN濃度 PEGylated rIFNoo100%(2)圖1PEG修 rhIFNw飾的化學(xué)反應(yīng)式1.6抗病毒活性測定 Fig. 1 Reaction scheme of synthesis of PEGylated參照2010年版中國藥典三部附錄XC“擾 recombinant human interferon omega (rhIFNw)素生物學(xué)活性測定”中WISH細(xì)胞法測定,結(jié)果 (A linear polyethylene glycol (PEG)-succinimidyl用IFN標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校正。 succinate yields an amide linkage with or c-amino group of rhIFN)2結(jié)果與討論確定單鏈 PEG-rhIFNw僅包含2個位置異構(gòu)體,2.1mpeg-ss選擇性修飾 rhIFNo的a或氨基推斷單鏈P-rhIFNw-的修飾位點(diǎn)為Lys(33)或人干擾素級結(jié)構(gòu)中賴氨酸含量較少,僅Lys(167)和Lys(46)或Lys(52)或Lys(152)第33、46、52、134、136、137、152和16位為2.2pH值對PG修飾rhi的影響賴氨酸,且第3位半胱氨酸(Cys)與第101位用25mmol·l-na2hpo4-kH2PO4緩沖液,Cys以及第31位Cys與第141位Cys殘基結(jié)合形調(diào)節(jié)反應(yīng)體系寬起始pH值4.0~10.0及窄起始成2個二硫鍵,因此, hIFN分子的N末端pH值7.30~8.70進(jìn)行實(shí)驗,維持反應(yīng)體系a氨基及部分賴氨酸側(cè)鏈e氨基不易暴露用 rhIFNw濃度0.5mg·ml-1, rhIFNw/PEG摩爾比 mPEG-SS針對游離氨基進(jìn)行選擇性化學(xué)修飾,有1:7,溫度25℃,搖床轉(zhuǎn)速200r·min-1,總體望減少單鏈 PEG-rhIFNw位置異構(gòu)體的形成。其積0.5ml。反應(yīng)4h后各加20μ130%冰醋酸溶液化學(xué)反應(yīng)式見圖1.通過對純化的單鏈PE結(jié)束反應(yīng),用HPLC測定單鏈 PEG-rhIFNw含量, rhIFN進(jìn)行毛細(xì)管電泳、等電點(diǎn)和肽圖分析,可結(jié)果見圖20.160.1270.050.00.1416000.1201140.0管150.00.1000.100.08百840.020.00.09300.00.0410.020.00.020.0806789107.37.57.77.98.18.38.58.00 initial value initial pH value(a) (b)圖2起始pH值對單鏈 PEG-rhIFNw含量的影響 Fig.2 Influences of initial pH value on PEG-rhIFNo content第10期潘紅春等:聚乙二醇修飾重組人干擾索的過程優(yōu)化2879圖2(a)結(jié)果表明,反應(yīng)體系起始pH值低于飾率和濃度,并可使 rhIFN得到充分利用,但因6.0時,修飾rh的反應(yīng)發(fā)生,起始PEG修飾劑價格PEG-rhIFNw昂貴,為主要成本pH值8.0~9.0時,有利于PEG修飾 rhIFNw,來源,故PEG修飾工藝研究過程更應(yīng)重點(diǎn)考慮單鏈PEg -rhIFNw-濃度達(dá)到0.11~0.12mgPg修飾劑的充分利用此外,SDS凝膠電泳圖ml-1,總修飾率為47%~50%,單鏈peg譜顯示,/PEG摩爾比達(dá)到1:10,多鏈 rhIFNw修飾率最高可達(dá)25.17%。圖2(b)結(jié)果表PEG-rhIFNw條帶顯著增強(qiáng)因此,綜合考慮修飾明,PEG修飾rh反應(yīng)進(jìn)行的最適合起始pH率、修飾劑成本以及分離純化成本,選擇 rhIFNw/值為8.34,此時,單鏈PEG-rhIFNw濃度為0.112PEG摩爾比為1:5進(jìn)行下面的研究。mgml-,總修飾率為55.7%,單鏈PEG2.4反應(yīng)時間對PEG修飾 rhIFNo的影響 rhIFNw修飾率達(dá)23.40%。因此,控制反應(yīng)體系控制起始pH8.3, rhIFNw/PEG摩爾比1:的起始pH值8.0~8.5為宜。反應(yīng)pH值是PEG5,其他反應(yīng)條件不變,研究反應(yīng)時間對PEG修飾化蛋白的最重要影響因素之一,除影響修飾反應(yīng)速 rhIFNo的影響。分別于反應(yīng)1、2、3、4和6h時率外(12,還影響修飾位點(diǎn)的專一性,導(dǎo)致單鏈取樣測定單鏈PE -rhIFNo-的含量,結(jié)果見圖4PEG蛋白位置異構(gòu)體比例的變化13隨著反應(yīng)時間延長,單鏈 PEG-rhIFNw含量逐漸2.3 rhIFNo/Pg摩爾比對PEG修飾的影響增加;當(dāng)反應(yīng)時間達(dá)到4h時,單鏈peg- -rhIFNo控制反應(yīng)體系 rhIFNw/PEG摩爾比為1:1、含量達(dá)到最高為0.100mgml,單鏈peG1:5、1:10、1:15和1:20,起始pH為8.3, rhIFNo修飾率和總修飾率分別為20.77%和其他反應(yīng)條件同上,結(jié)果示于圖3,由圖可知,35.80%。因此,PEG修飾 rhIFNw的反應(yīng)時間以 rhIFN/PEG摩爾比為1:15時,反應(yīng)液中單鏈4h為宜。peg G-rhIFNw-含量最高達(dá)0.173mgml-1,單鏈2磷酸緩沖液濃度對G修飾的影響peg- -rhIFNo修飾率最高達(dá)35.94%; rhIFNw/控制起始pH8.3, rhIFNw/PEG摩爾比1:PEG摩爾比為1:20時,單鏈PEG--ThIFNo修飾5,反應(yīng)時間4h,其他反應(yīng)條件不變,研究磷酸率下降,而總修飾率達(dá)到最大為90.8%。緩沖液濃度對PEG修飾 rhIFNw的影響。分別控PEG修飾蛋白藥物過程中,蛋白/PEG摩爾比制磷酸緩沖液濃度為12.5、25、50、100和200的選擇因蛋白種類、PEG種類、修飾位點(diǎn)等而各mmoll,測定單鏈 PEG-rhIFNw含量,結(jié)果不同115,范圍在(1:1)~(1:250)。高見圖5。隨著磷酸緩沖液濃度的增加,單鏈PEG rhIFNw/peg摩爾比雖有高單鏈eg--rhIFNw修 rhIFNw含量呈逐漸降低趨勢,但磷酸緩沖液濃度0.18不宜太低,以25~50mmol·L-為宜。因此,選100.00.183800.1690.036.0T0.1480.00.16T34.00.127000.140.1060.0巴32.00.1230.0,0.0850.0801028.00.0640.00.100.0426030.00.080.0220.024.010.00.061:11:51:101:152201:151:20 mhIFNo/PEG molar ratio0.0420.034圖3 rhIFNw/pG摩爾比對peg- rhIFNw含量的影響 reaction time/h Fig.3 Influences of rhIFN/PEG molar ratio圖4反應(yīng)時間對 PEG-rhIFNw含量的影響 on PEG-rhIFNo content Fig.4 Influences of reaction time on PEG-rhIFNw content2880化工學(xué)報第62卷0.1560.00.4580.00.4070.00.1455.00.35600.00.1350.0E03050.00.250.1240.045.00.200.1130.00.1540.020.00.100.100.0510.00.0935.010.40.71.01.31.61.9104070100130160190 mhIFNe concentration/mgml' buffer concentration/mmol-L-圖6 rhIFNw濃度對eg -rhIFNw-含量的影響圖5緩沖液濃度對 PEG-rhIFNw含量的影響 Fig.6 Influences of rhIFNoo concentration Fig.5 Influences of buffer concentration on PEG-rhIFNo content on PEG-rhIFNo contenth,反應(yīng)總體積0.5ml,反應(yīng)振蕩轉(zhuǎn)速200r擇磷酸緩沖液濃度25mmol·L進(jìn)行下面的min-1,反應(yīng)終止液30%冰醋酸20μl。確定表1研究。所示的各因素和水平,選用表2所示的L9(34)2.6 rhIFNo濃度對PEG修飾 rhIFNo的影響正交表安排實(shí)驗,共進(jìn)行9組實(shí)驗,每組3個平行控制磷酸緩沖液濃度25mmol·L-1,起始樣,實(shí)驗結(jié)果取其平均值,以單鏈PEG- -ThIFNwpH8.3, rhIFN/PEG摩爾比1:5,反應(yīng)時間4和 rhIFNw殘留含量為測定指標(biāo),以單鏈EGh,其他反應(yīng)條件不變,研究 rhIFNw濃度對 PEG rhIFNw修飾率為評價指標(biāo)。正交實(shí)驗結(jié)果見表2修飾 rhIFNw的影響。分別控制 rhIFNw濃度為表1正交實(shí)驗各因素和水平0.125、0.25、0.5、1和2mg·ml-1,測定單鏈 Table Factor and level of orthogonal designeg- -rhIFNw含量,結(jié)果見圖6.隨著 rhIFNw濃 Initial pH Molar ratio rhIFNo度的增加,體系中PEG濃度也按摩爾比1:5同比 Level value of rhIFNo concentration- ter.增加,致使反應(yīng)體系中單鏈PEG -rhIFNw和多鏈peg- -rhIFN均隨 rhIFNw濃度增加而增加。當(dāng)0.500.03 rhIFNw濃度為2mg·ml時,體系中單鏈PEG80.750.05 rhIFNw濃度可達(dá)0.422mgml-1.修飾率計算結(jié)38.51:71.000.07果顯示,單鏈 PEG-rhIFNo修飾率隨 rhIFNo濃度直觀分析上述實(shí)驗結(jié)果,各因素和水平對應(yīng)的增加的變化幅度不大,而總修飾率呈現(xiàn)先逐漸增K、k和極差R值見表2。比較各因素極差R值大加,后降低并趨于穩(wěn)定的變化趨勢,當(dāng) rhIFNw濃小,確定各因素主次順序為B>C>D>A.因素A度為0.5mgm時,總修飾率為最高達(dá)對單鏈PE- -rhIFNo修飾率影響小,且適當(dāng)提高74.24%因此,綜合考慮,選擇rhIFNw濃度為體系pH值有利于加快反應(yīng)速度,選取A3;因素0.5mg·ml較適宜。C的水平2和水平3差別不大,且 rhIFNw濃度越2.7Peg修飾 rhIFN的正交實(shí)驗高副產(chǎn)物多鏈 PEG-rhIFN生成越多,選取C2;根據(jù)上述各單因素對PEG修飾的影響程度,對于因素B,雖然 rhIFN/PEG摩爾比1:7可能選取起始pH值、 hIFNw/PEG摩爾比、磷酸緩沖偏小,但綜合考慮PEG修飾劑的成本和利用率,液濃度和反應(yīng)體系 rhIFNo濃度4個因素進(jìn)行正交不再進(jìn)行更大PEG含量的實(shí)驗研究,選取B3確實(shí)驗,以考察各因素相互變化的綜合效果。其他實(shí)定優(yōu)化PEG修飾 rhIFNw的工藝條件驗條件分別為:控制反應(yīng)溫度25℃,反應(yīng)時間4為B3C2D2A3第10期潘紅春等:聚乙二醇修飾重組人干擾素的過程優(yōu)化2881表2L(34)正交實(shí)驗設(shè)計與結(jié)果表3驗證實(shí)驗結(jié)果 Table 2 Arrangement and results of L,(3) Table 3 Results of verification experiment orthogonal experiment by HPLC determination PEGylation PEG-rhIFNw PEGylation rate/% Factor Experiment Experiment rate of mono- content mono-PEG-(mono+poly) No. No. PEG-rhIFNoP EG-rhIFNo A C D/% optimized experiment0.4634.1762.031111114.75 No.3 experiment0.22431.0459.382312231.22132331223133.01修飾 rhIFNw均可獲得良好的修飾效果,前者略優(yōu)2323131216.79于后者,前者可使反應(yīng)液中單鏈PEG-rhIFNw含4567823312312327.082330.73量達(dá)到0.246mg·ml-,單鏈Eg -rhIFNw-修飾22.12率達(dá)到34.17%,總修飾率為62.03%。正交實(shí)驗20.44優(yōu)化的PEG修飾條件可用于后續(xù)研究和放大研究。9332.182.8溫度對PEG修飾的影響K178.9853.6665.9274.01K274.6078.7480.1984.07在上述優(yōu)化實(shí)驗條件下,選擇5℃、25℃和K374.7495.9282.2170.2440℃進(jìn)行PEG修飾 rhIFNw的溫度實(shí)驗,反應(yīng)中kk處26.32717.88721.97324.6定時取樣測定,結(jié)果見圖8.溫度顯著影響PEG24.86726.24726.73028.02324.91331.97327.40323.4n修飾 rhIFNw的速率,溫度越高反應(yīng)速度越快。R1.46014.0865.4304.615℃下,3h前單鏈 PEG-rhIFNw含量隨反應(yīng)時間延長而快速增加,3h后則緩慢增加;3h和24h確定PEG修 rhIFNw飾反應(yīng)體系的優(yōu)化條件單鏈eg -rhIFNw-的含量分別為0.157mgml-為:起始pH值8.5, rhIFNw/PG摩爾比1:7,和0.224mgml1,修飾率分別為21.81%和 rhIFNw濃度0.75mg·m-1,磷酸緩沖液濃度5031.06%。25℃和40℃下,3~4h時單鏈PEGmmolL,溫度25℃,反應(yīng)時間4h,反應(yīng)總體 rhIFNo含量達(dá)到最大,隨后呈緩慢降低趨勢;單積0.5ml,反應(yīng)振蕩轉(zhuǎn)速200r·min-,30%冰鏈eg -rhIFNw含量最大值分別為0.227mg醋酸反應(yīng)終止液20μlml-(4h)和0.260mg·ml(3h),修飾率最大用正交實(shí)驗優(yōu)化的PEG修 hIFNw飾反應(yīng)條值分別為31.56%(4)和36.17%(3h)件和正交實(shí)驗結(jié)果最好的3號實(shí)驗組條件進(jìn)行驗證SDS凝膠電泳分析結(jié)果表明,溫度越高反應(yīng)實(shí)驗,各組實(shí)驗3個平行樣,單鏈 PEG-ThIFNw速度越快,單鏈PEG- -rhIFNw含量越高,然而多含量和修飾率以及總修飾率結(jié)果見表3,DS凝膠聚 PEG-rhIFNw副產(chǎn)物也會隨之增加,同時蛋白電泳圖譜見圖7。在優(yōu)化和3號實(shí)驗條件下,PEG藥物也會失去更多生物活性,甚至使目標(biāo)產(chǎn)物失去 marker 20.30 poly-PEG-thIFNe0.2540℃830×103620×10 mono-PEG-thIFNo25℃E0.20475×10380.155℃32.5×1030.10250×103 rhIFNe0.0516.5×100圖7驗證實(shí)驗 SDS-PAGE分析 reaction time/ Fig. 7 SDS-PAGE analysis of verification experiment圖8溫度對 PEG-rhIFNo含量的影響 1-optimized experiment; 2-No. 3 experiment Fig. 8 Influences of temperature on PEG-rhIFNo content2882化工學(xué)報第62卷應(yīng)用價值。 rhIFNw的熱穩(wěn)定性研究結(jié)果表明放大實(shí)驗,考察修飾工藝的可放大性,便于純化工40℃下熱穩(wěn)定性較差,25℃下熱穩(wěn)定性相對較好,藝、質(zhì)控方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、單鏈PE-rhIFNw-特低溫下熱穩(wěn)定性最好。綜合考慮PEG修飾反應(yīng)速性等研究工作的開展。按每批100 mg PEG修飾劑度、 rhIFNw熱穩(wěn)定性、大生產(chǎn)可操作性等因素,進(jìn)行0801、0802和0803三批放大實(shí)驗研究。表4選擇PEG修 rhIFNw飾的適宜溫度為25℃結(jié)果表明,獲得的優(yōu)化修飾工藝條件具有很好的穩(wěn)2.9peg修飾mn反應(yīng)過程的pH變化和控制定性和可操作性。三批放大實(shí)驗的平均單鏈PEGEG修 rhIFNw飾會使反應(yīng)體系的pH降低 rhIFN含量、單鏈peg- -rhIFNo修飾率和總修飾用全自動發(fā)酵罐pH自動控制系統(tǒng)監(jiān)測PG修飾率分別為0.25mg·ml-1、34.63%和69.20%。 rhIFNw反應(yīng)過程的體系pH發(fā)現(xiàn),起始pH8.5的張琛等16利用單甲氧基聚乙二醇(mPEG)化學(xué)修飾反應(yīng)體系,反應(yīng)1h后體系pH降至8.22h修飾中性蛋白酶的總修飾率為41.7%,楊宇峰后體系pH穩(wěn)定至8.1左右結(jié)合圖4分析盡管等用單甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亞胺(SPA-反應(yīng)體系pH降低很快,但修飾反應(yīng)仍在繼續(xù),單mPEG20000)修飾重組人干擾素a1b的單點(diǎn)修飾鏈pg -rhIFNo-濃度和修飾率逐漸增加,直到4h率為33%。因此,本研究結(jié)果已達(dá)到并超過文獻(xiàn)時達(dá)到最高。報道的結(jié)果。針對上述問題,利用該pH自動控制流加酸堿表4放大實(shí)驗結(jié)果體系,開展PEG修飾 rhIFNw反應(yīng)體系pH的過 Table 4 Results of amplification experiments程控制研究,控制反應(yīng)過程體系pH維持8.5 PEG-rhIFNw PEGylation rate/%(8.4~8.6),每半小時取樣測定,結(jié)果見圖9.1 Experiment content mono-PEG No poly)-h內(nèi)單鏈PEG -rhIFNw含量達(dá)最大,隨后呈逐漸降 /mg. ml-1 rhIFNos G-rhIFNuo低趨勢;SDS凝膠電泳分析結(jié)果顯示,1h后多鏈08010.25208020.2350435.069.1532.670.02pg -rhIFNw-呈逐漸增多趨勢08030.26136.2568.440.180.162.11peg -rhIFNo-的抗病毒活性測定0801、0802和0803三批g- -rhIFN原0.14液的抗病毒活性和蛋白濃度,計算出比活和比活殘80.12留率,見表5。 PEG-rhIFNw原液的比活均大于0.101.00×107I·(mg蛋白)-1,與 rhIFNw的比活8.82×107IU·(mg蛋白)-比較,peg--rhIFN0.08的比活有較大幅度降低,約保留 rhIFNw比活的06051.01.5202.53.03.54.015%左右。PEG修飾蛋白主要考慮修飾物在體內(nèi) reaction time/h外殘留生物活性和腎臟清除率兩個因素,佩樂能圖9控制ph8.5時 PEG-rhIFN含量的變化 Fig.9 Change of PEG-rhIFNw, content at pH 8.5表5peg -rhIFN-原液的蛋白質(zhì)含量、抗病毒活性和比活 Table 5 Protein concentration, antiviral and實(shí)驗結(jié)果表明,控制反應(yīng)過程體系pH8.5有 specific activities of PEG-rhIFNo利于修飾反應(yīng)啟動,但不利于單鏈EG- -rhIFNo Antiviral Protein Specific Specific穩(wěn)定,有助于多鏈 PEG-rhIFNw生成。有關(guān)反應(yīng) Batch No sctivity concentration residue activitypH值過程的研究還需要更加深入細(xì)致,但圖9結(jié) /IU.ml-1 /ugml-1 protein level@/%果已預(yù)示,要獲得更高單鏈PEG- rhIFN含量和08012.79×1061851.51×10717.12修飾率,可控制反應(yīng)體系略低pH或分階段控制不08022.37×101731.37×10715.53同pH,同時,反應(yīng)體系放大時應(yīng)加強(qiáng)反應(yīng)pH值08032.82×101891.49×10716.84的過程控制。 Specifi ctivit (mg protein )- antivial activity (IU.ml-1)/protein concentration( ml-1), Specific activity2.10g修飾 rhIFNo的放大實(shí)驗 residue level( % specific activity of PEG-rhIFNo/specific activity對優(yōu)化和驗證的PEG修飾 rhIFN工藝進(jìn)行 of rhIFNu100%第10期潘紅春等:聚乙二醇修飾重組人干擾素的過程優(yōu)化2883(Eg-FNa-2b,12000直鏈)和派羅欣(EG proteins at consistent rate continuously for 3 to 12 montlFNa-2a,40000支鏈)上市以來取得的喜人臨床]. Journal of Diabetes Science and Technology, 2008.2(3):461-467應(yīng)用效果,說明修飾物體外生物活性的保留程度并 [6] Jevsevar S, Kunstelj M, Porekar V G. PEGylation of不與體內(nèi)療效有直接的對應(yīng)關(guān)系,還與腎臟清隙率 therapeutic proteins [J]. Biotechnology Journal, 2010,5有關(guān)。佩樂能和派羅欣的體外抗病毒活性僅分別保(1):113-128留天然蛋白的28%8和7% [7] Pasut G, Veronese M. PEGylation for improving the Today3結(jié)論 effectieness of therapeutic biomolecules [ Drugs Too(Barc),2009,45(9):687-695針對 rhIFNw的賴氨酸氨基和N末端氨基,8]luy Harding, Turner, Smith, Athwal Grossmann J G, Davis K G, Rowe A J. Effect of PEGylation用直鏈琥珀酸琥珀酰亞胺酯類mPEG進(jìn)行選擇性 on the solution conformation of antibody fragments [J].化學(xué)修飾。研究了反應(yīng)體系起始pH值、 rhIFNo/ Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008, 97():PEG摩爾 rhIFNw比、濃度、緩沖液濃度、溫度等2062-2079對PEG修飾 rhIFNw的影響,并用通過正交實(shí)驗 [9] Eto Y, Yoshioka Y, Ishida T, Yao X, Morishige T, Narimatsu S, Mizuguchi H. Mukai Y, Okada N.Kiwada優(yōu)化了PEG修飾 rhIFNo過程的反應(yīng)條件,通過 H, Nakagawa S. Optimized PEGylated adenovirus vector因素實(shí)驗和正交實(shí)驗優(yōu)化了PEG修 rhIFNo飾的 reduces the anti-vector humoral immune response against條件,控制反應(yīng)體系起始pH值8.5、 rhIFNo/ adenovirus and induces a therapeutic effect againstPEG摩爾比1:7、 rhIFNw濃度0.75mg·ml-1和 metastatic lung cancer [] Biological Pharmaceutical磷酸緩沖液濃度50mmol·L-1,于25℃振蕩反應(yīng) Bulletin,210,33(9):1540-15444h,用30%冰醋酸終止反應(yīng),可使反應(yīng)體系中單0hu, Duppatla Harth, Schmitz Sebald.site specific PEGylation of bone morphogenetic protein-2鏈PEg -rhIFNw含量、單鏈PE- -rhIFNo修飾率 cysteine analogues [] Bioconjugate Chemistry, 2010, 21和總修飾率分別達(dá)到0.25mg·ml、34.63%和(10):1762-177269.20%純化后的單鏈grh具有典型[1dolfgr,fruhbeisb,69J209PEGrhIN1《AdGR,ErdhdsB,HmnRKuJmr1,Maurerkalsner,maurerPEG修飾蛋白的特性,體外抗病毒活性大幅降低, Fogy I, Ostermann E. Patzelt E, Schwendenwein R, Sommergruber W, Zophel A. Human interferon omega 1:保留了天然 rhIFNw抗病毒活性的15% isolation of the gene. expression in Chinese hamster ovary cells and characterization of the recombinant protein [J]. 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Expert Opinion on Drug(6):615-618 Delivery,2008,5(4):371-383信息與交流2012年《聚氨酯工業(yè)》征訂啟事(郵發(fā)代號28-344)《聚氨酯工業(yè)》創(chuàng)刊于1986年,由中國聚氨酯工業(yè)協(xié)會和江蘇省化工研究所有限公司主辦,國內(nèi)唯一公開發(fā)行的聚氨酯行業(yè)專業(yè)性科技刊物,現(xiàn)已成為中國科技核心期刊和中文核心期刊。被美國化學(xué)文摘(A)和國內(nèi)多家期刊數(shù)據(jù)庫收錄。國際標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)出版物刊號:1SSN1005-1902國內(nèi)統(tǒng)一連續(xù)出版物刊號:CN32-1275/TQ《聚氨酯工業(yè)》主要報道聚氨酯制品及其原料等方面的科技成果與發(fā)展動態(tài),以刊登行業(yè)專題綜述、研究報告、生產(chǎn)應(yīng)用和技術(shù)交流、分析測試方法以及生產(chǎn)設(shè)備技術(shù)進(jìn)展為主,同時還刊登國內(nèi)外聚氨酯技術(shù)及行業(yè)動態(tài)。適合涉及高分子合成材料特別是聚氨酯材料研制、應(yīng)用及管理的科技人員閱讀,創(chuàng)刊以來,受到國內(nèi)外聚氨酯行業(yè)專家學(xué)者、企事業(yè)單位、生產(chǎn)技術(shù)人員以及高等院校的高度重視和一致好評,是從事聚氨酯行業(yè)人士的必備刊物。位、氨酯工業(yè)》為雙月刊,全年訂價80元,郵發(fā)代號28-344訂閱者也可通過以下單位訂閱:《聚氨酯工業(yè)》發(fā)行部:南京市北京西路72號郵政編碼:210024電話:025-83755190,85664648全國非郵發(fā)報刊聯(lián)合征訂:天津市大寺泉北里別墅17號郵政編碼:300385;電話:022-23962479,23973378中國化工信息中心期刊圖書聯(lián)合征訂部:北京安外小關(guān)街53號,郵政編碼:100029電話:010-64444115,64444113;如需開具正式發(fā)票,請另加4元郵寄費(fèi),用于掛號郵寄發(fā)票。為慶祝《聚氨酯工業(yè)》創(chuàng)刊二十周年,本刊隆重推出《聚氨酯工業(yè)》二十周年(1986~2006)期刊合集(DVD光盤),歡迎致電本刊發(fā)行部垂詢。歡迎訂閱!歡迎投稿!歡迎刊登廣告!通過本刊發(fā)行部訂閱辦法:1.銀行匯款開戶行:中國工商銀行南京市草場門支行賬號:4301016309001017389戶名:江蘇省化工研究所有限公司2.郵局匯款地址:南京市北京西路72號郵編:210024收款人:《聚氨酯工業(yè)》編輯部