第45卷第6期中山大學(xué)學(xué)報( 自然科學(xué)版)Vol.45 No.62006年11 月ACTA SCIENTIARUM NATURALIUM UNIVERSITATIS SUNYATSENINov.2006聚乙二醇-聚乙烯亞胺共聚物的制備及其表征張璇，潘仕榮，呂澍，胡海梅，張未(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東廣州510080)摘要: 用親水的聚乙二醇對聚乙烯亞胺進行改性，制備適用于基因轉(zhuǎn)染的非病毒類載體。以異佛爾酮二異氰酸酯活化聚乙二醇，再與聚乙烯亞胺反應(yīng)，兩步法合成了聚乙二醇-聚乙烯亞胺(PEC-PE)嵌段共聚物，分別用IR、'H NMR、GPC、DSC對共聚物進行了表征。在IR譜圖上可見mPEC-NCO中異氰酸基、及PEC-PEI中脈:基的特征峰;根據(jù)'H NMR譜圖計算表明，此聚合反應(yīng)為可控反應(yīng)，通過調(diào)節(jié)PEC與PEI的投料比例可控制共聚物組成及相對分子質(zhì)量; CPC曲線上共聚物為-單峰，與PEG和PEI均聚物峰位置不同，表明產(chǎn)物是PBEC-PEI共聚物，DSC分析也表明共聚物T。較均聚物均有不同程度的下降，這是PEG和PEI兩種嵌段相互纏結(jié)的結(jié)果。因此證明成功合成了PEC-PEI 共聚物。關(guān)鍵詞:聚乙烯亞胺;聚乙二醇;共聚物;異佛爾酮二異氰酸酯中圖分類號: 0632. 12文獻標識碼: A文章編號: 0529-6579 (2006) 06-0053-05隨著基因治療的不斷深人，非病毒基因載體的黏接劑， 具有柔軟、耐水、耐油、耐熱、無毒等特研究近年來取得了很大進展。陽離子聚合物是被廣點， 已獲得美國FDA的認可。2002 年，Pelesen'"泛研究的非病毒載體之一,通過其分子鏈上的正電用己二異氰酸酯(HMDI)作偶聯(lián)劑制備了PEI-b-荷與DNA鏈上的負電荷的靜電作用締合并轉(zhuǎn)變成PEG。IPDI 同HMDI相比2個一NCO基團的活性納米級復(fù)合體"，保護DNA免受核酸酶降解。較低，反應(yīng)速度較平穩(wěn)，毒性較低:穩(wěn)定性好、耐1995年，Bousift2-3) 首次報道了聚乙烯亞胺老化性能優(yōu)、原料易得、反應(yīng)簡單，故用作本研究(polyethylenimine, PEI)可作為非病毒載體。PEI的偶聯(lián)劑。本研究開辟了一條PEC-PEI共聚物的結(jié)構(gòu)單體(- CH2- CH,-NH,-) 中每3個原子新的制備 方法。含-一個氮原子，可質(zhì)子化生成正電性氨基，成為與1實驗部分基因復(fù)合的作用點，在體內(nèi)有較高的轉(zhuǎn)染率。但是，因為PEI強的滲透作用，破壞細胞的溶酶體1.1 實驗原料膜，顯示出細胞毒性(4)，為了改善PEI的生物性聚乙烯亞胺(PEI, M. 25 000, Aldricb-Sigma能，采用引入PEC對其進行修飾，PEG 是無毒和公司產(chǎn)品，支鏈型，無水);聚乙二醇單甲醚抗免疫原性的水溶性大分子，有優(yōu)良的生物相容(mPEG, M.為2000和5000, Fluka公司); 異佛性，通過PEG修飾PEI形成共聚物即可克服PEI爾酮二異氰酸酯(IPDI, 廣州市匯采涂料化學(xué)品有DNA復(fù)合物溶解性差、細胞毒性大和傳送過程中限公司,進口分裝);二月桂酸二丁基錫( DBTL,沉積等不足[4)。用PEG修飾PEI的方法,國外報廣東麗寶涂料助劑公司);氯仿(分析純，廣州試道多使用特異活性的PEG修飾劑，例如含琥珀酰劑二廠 ,用前用無水氯化鈣干燥過夜，再在60 C亞胺酯端基的PEC15-6), 含環(huán)氧化物湍基的與IPDI回流4h,以除去微量的水和乙醇);乙醚PEC[",含醛基端基的PEG,它們的制備復(fù)雜，來(分析純，廣州試劑二廠);石油醚(30 ~60 C，源缺少，所得PEG-PEI共聚物的產(chǎn)率較低。分析純，廣州試劑二廠)。異佛爾酮二異氰酸酯(IPDI) 屬脂環(huán)族二異1.2異氰酸酯單端基聚乙二醇的制備氰酸酯，其相對分子質(zhì)量大，蒸氣壓低，毒性小，將mPEG先110 C脫水處理4 h,再用定量氯并且有良好的耐候性、耐熱性和耐溶劑性8]，以仿溶解。稱10倍摩爾量IPDI, 溶于氯仿，加入IPDI為原料制造的食品、醫(yī)藥、化妝品包裝袋用0. 6%n70的化化劉NRTT收上述兩溶液混合,中國煤化工TYHCNMHG收稿日期: 2006 -01 -22基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(30570500)作者簡介:張璇(1976 年生)，女，博士研究生;通訊聯(lián)系人:潘仕榮; E-mail: gpshr@ 163. com54中山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)第45卷75 C左右回流反應(yīng)8 h,所得產(chǎn)物在石油醚中沉.的NCO的活性大8~10倍。用作偶聯(lián)劑與PEG反淀，沉淀用氯仿溶解，再用石油醚沉淀，此操作重應(yīng)時，脂鏈上的NCO在催化劑作用下先與- -0H復(fù)多次直至將過量的異佛爾酮去除干凈，真空干反應(yīng)后，脂環(huán)上的NCO就難于再與- -0H反應(yīng)，燥，得白色蠟狀至粉末狀固體。故生成的預(yù)聚體副反應(yīng)少。加入過量的IPDI可使1.3 PEG-PEI嵌段共聚物的合成反應(yīng)進行的更加完全。而Petersen[9!使用的HMDI將PE1用20倍(質(zhì)量比)氯仿溶解，磁力攪上的兩個NCO為對稱結(jié)構(gòu)，活性相同，有可能同拌下將異氰酸酯活化的單甲氧基聚乙二醇的氯仿溶時和兩個mPEG反應(yīng)而無法再繼續(xù)與PEI反應(yīng)，本液逐滴加人PEI溶液中，再加人0.6% ~0.7% 的實驗采用IPDI做偶聯(lián)劑可避免此種情況。與PEI催化劑DBTL,置60 C回流反應(yīng)16 h,蒸去多余氯反應(yīng)前必須將過量的IPDI 除去，因為殘留的IPDI仿，余下液體用大量乙醚沉淀，過濾，真空干燥，可使PEI大分子間形成交聯(lián)而至使溶解性下降。稱量。IPDI可溶于石油醚，而活化的PEG在石油醚中沉1.4表征淀0]，用大量的石油醚反復(fù)洗滌預(yù)聚體可除去1.4.1 IR 分析mPEG、 mPEG-NCO、PEG-PEI 樣IPDI?；罨腜EG不穩(wěn)定，研究發(fā)現(xiàn)預(yù)聚體放置3品分別采用KBr壓片制備; PEI 樣品用其CHCl3液d后NCO的質(zhì)量百分含量下降了一半以上，故在KBr晶片上涂膜制備，各樣品的IR譜分析在PEG預(yù)聚體必須盡快和PEI進行反應(yīng)。PerkinElmer 683型紅外光譜儀上進行。將活化的PEG緩慢逐滴加入PEI溶液中，使.1.4.2 'H NMR測定以CDCI3為溶劑，溫度26PEG與PEI充分發(fā)生共聚反應(yīng)，避免局部濃度過C，在Brucker AM400型核磁共振儀上進行。高。生成的聚合物在乙醚中立即沉淀，而未反應(yīng)的1.4.3 GPC 測定以聚苯乙烯作為標準物， 四氫PEI不沉淀可除去未反應(yīng)的PEI。呋喃為流動相，流速1.0 mL/min,溫度40 C,在2.2紅外 光譜分析Waters515/410凝膠滲透色譜儀上進行。在圖2(a)中，3300~3400cm-'的寬峰代1.4.4 DSC分析程序升溫速率為10 C/min,在表N-H的伸縮振動, 2 900 cm-'峰代表亞甲基NETZSCH DSC204差示掃描量熱儀上進行。C-H伸縮振動，表明聚合物PEI 中存在有--NH--和CH2，證實了PEI的(-CH2--.2結(jié)果 與討論CH2- -NH2-)結(jié)構(gòu)。圖2 (b)中3 300~3 5002.1共聚物的合成cm~'的寬峰代表0-H的伸縮振動, 2 888 cm~'峰共聚物的合成路線如圖1所示。代表亞甲基C- -H伸縮振動，1 108 cm~'峰代表在預(yù)聚反應(yīng)中mPEG被活化，末端的羥基轉(zhuǎn)變C--0醚鍵的吸收峰，說明mPEG 中有為異氰酸根的預(yù)聚體，此預(yù)聚體對PEI中的氨基有- -CH2- -CH2-0-和-0H的存在。圖2 (c)較高的反應(yīng)活性。IPDI 的2個異氰酸基連接方式和圖2 (b) 相比，多了2267和1 719 cm~|兩個不同，活性也不同，脂鏈上NCO的活性比脂環(huán)上Hc'0NCODBTLCHCINOCH0E cHCHoF. CH2ChOHCHO t cncnoF, CILCHO C -NHnCc kcHHgCCHNH2NHwEmnE N~JNNHENgENjJ..NH2cODBTLCHCIO中國煤化工CHO- E cncno子, CHCH20-C-MYHCNMHGH3C圖1 PEG-PEI 共聚物的合成路線Fig 1 Synthetic scheme of PEC-PEI copolymer第6期張璇等: 聚乙二醇-聚乙烯亞胺共聚物的制備及其表征55峰,位于2267 cm~'峰代表未參加反應(yīng)的脂環(huán)鏈上2.3 'H NMR的測定的NCO的伸縮振動, 1 719 cm -1峰代表生成的氨基圖3-1中，a(δ 2.772)和b( 82.656)處的吸甲酸酯中C=0(酰胺I)的伸縮振動，表明收峰應(yīng)歸屬分別與仲胺和叔胺相連的亞甲基質(zhì)子mPEG發(fā)生預(yù)聚反應(yīng)，- -OH轉(zhuǎn)化為一NCO。圖2(- CH2)的化學(xué)位移。圖3-2中d(δ3.667),e(d)中3 410 cm~'峰應(yīng)為0-H及N--H兩峰的(δ 3.831)和f(δ 3.717)的峰均為mPEG中亞甲基疊加，此峰同樣顯得很寬。和2 (c) 相比，2 267質(zhì)子(- -CH2)的化學(xué)位移,c(δ 3.387)處的吸收cm~處的0=C=N吸收峰消失，表明活化的峰為CH,0一中甲基的一-CH, 質(zhì)子的化學(xué)位移。mPEC中的NCO與PEI反應(yīng)完全，而1 700 cm~的圖3-3同圖3-2相比，主要在低場出現(xiàn)了一系列C=0氨基甲酸酯基峰仍存在并增加了脲基在峰，g(δ 3. 025 )處的吸收峰為與氨基甲酸酯基相連1 570 cm-'的伸縮振動，由此可初步確定共聚物的亞甲基質(zhì)子(- -CH2)的化學(xué)位移,h(δ 2.964)PEG-PEI的生成。處的峰應(yīng)為- -NCO相連的次甲基(- CH)質(zhì)子的化學(xué)位移，i、j.k.1(δ 1. 700、1. 061、1. 200、(a) 心0.925)的幾處峰均為環(huán)已烷上的亞甲基及與之相Www連的甲基上質(zhì)子的化學(xué)位移。圖3-4同圖3-1和圖3-3相比，既有PEG上質(zhì)子的特征吸收峰c"、d"、e"、f"(δ3. 399.3.658.3.776.4. 112),又有PEIIMMC上質(zhì)子的特征吸收峰a' b'(82.783.2.659),低場i'、j'、k'、I' (δ 1.701、1.063.1.232、0. 880)處還可(o)~1710見環(huán)已烷上的亞甲基及與之相連的甲基上質(zhì)子的吸收峰，由此圖譜可進- -步 確定聚合物為PEG與PEI12.r的共聚物。同時可根據(jù)共聚物中乙烯亞胺單元(δ2.5~3.0)和乙二醇單元δ 3.6中相關(guān)氫的積分面積之40000 3500 3000 2500 20001500 1000 500 0比計算出共聚物中兩組分的質(zhì)量比及相對分子質(zhì)w/cm^量，見表1。圖2均聚物 與共聚物的的IR譜圖從表1中可以看出，由'H NMR所計算的不同F(xiàn)ig2 IR spectra of homopolymers and copolymers投料比所得的共聚物的實際組成與反應(yīng)的投料比接(a) PEI, (b) mPEG, (e) mPEC-NCO, (d) PEG-PEI近，說明反應(yīng)是一種可控反應(yīng)，因此可通過改變反應(yīng)物的投料比來調(diào)節(jié)生成共聚物的組成。PEIHN ENi.ENJ. NItmPEGCHO t cHCHO . CHCItOHNCOmPBG- NCO CtO E chHCHtoF. CiHCHO- NHAch 1,HCNHEiNyJ.EN J。NHh4CCPEG-PEI CHO f chciho王. cHCitoC -NH icX大10 86420,HCRCH了中國煤化工圖3均聚物與共聚物的'H I.MHCNMHGFig3 'H NMR spectra of homopolymers und cwupunymers1、PEI2, mPEG 3, mPEG-NCO and 4 PEC PEI56中山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)第45卷表1PEC-PEI共聚物的組成及相對分子質(zhì)量Tab.1 Compositions and molecular weights of PEG-PEI copolymer反應(yīng)物產(chǎn)物.名稱r( PEG)w( PEG)M,(PEG) M,(PEI)修飾/% TDEOL w(PEI)/% M,(PEG-PEI)y/%r(PEI)w( PEI)PEI25 00000PEC-PEI(2-25-1)2 0004. 171/30.52.981. 1331 00079. 55PEG-PEI(2-25-2)12.51/11.810.554.414600075.0PEG-PEI(2-25-3)37.53/14.526. 032.5177 000PEG- PEI(5-25-1)5 0001.670.373.5334 00073. 86PEC-PE(5-25-2)500051. 247.241.06 .61 00075. 29PEG-PEI(5-25-3)153.5420. 619. 55128 00087.342.4 GPC 的測定圖4a、b、c、d分別為PEI、PEG、PEC-PEI3.00| (a(2-25-2) PEC-PEI(5-25-2)的GPC圖,曲線上共聚2.50物為一單峰，與PEI和PEC均聚物峰位置不同,2.00表明產(chǎn)物是PEG-PEI共聚物，沒有PEG和PEI均1.50聚物的存在。GPC計算所得聚合物PEC-PEI(2-25-1.000.502)和PEG-PEI(5-25-2)的M。分別為44 740和0.0053 990，相對分子質(zhì)量分布值分別為1.24和1.16。4.10 3.90 3.70 3.50~與'H NMR計算得到的相對分子質(zhì)量相比，GPC 測2.50| (b得的聚合物的相對分子質(zhì)量偏小，這是由于嵌段共聚物有著與GPC標樣聚苯乙烯不同的流體力學(xué)行1.5為所致。本文研究的共聚物的相對分子質(zhì)量以'HNMR的測定結(jié)果為準。2.5、共聚物的 DSC分析0.00 ;圖5中a線的峰為mPEG結(jié)晶熔融的吸熱峰,享3.00 ()T.為66 C。b、c、d線共聚物的T.分別為52.7.50.2、49.3 C,較均聚物Tm有不同程度的下降，這是PEC和PEI兩種嵌段的相互纏結(jié)的結(jié)果使結(jié)1.50 |晶度下降", PEI質(zhì)量含量越高，T下降就越大。隨著共聚物中PEI含量的增加，共聚物在低溫-側(cè)的峰面積逐漸減少，表明mPEG的結(jié)晶性被破壞。4.904.704.504.304.10同時高溫一-側(cè)127~128C出現(xiàn)的吸熱峰強度隨(d)PEI含量的增加而增大。由此表明共聚物存在微相分離，具有嵌段共聚物的特征。3結(jié)論將單甲氧基聚乙二醇用異佛爾酮二異氰酸酯活5.104.904.704.504.304.10化生成預(yù)聚體，再與聚乙烯亞胺聚合制備嵌段共聚lg M物，用IR、'H NMR、GPC、 DSC 對共聚物進行了GPC譜圖表征。結(jié)果表明，生成了PEC-PEI共聚物，產(chǎn)物中國煤化工。3 and copolymers中無殘留反應(yīng)物，該聚合反應(yīng)為可控反應(yīng),通過調(diào)YHC N M H GEI(2-25-2)節(jié)PEG與PEI的投料比例可控制共聚物組成及相and (d)PEC-PEI(5-25-2)對分子質(zhì)量。PEG-PEI 嵌段共聚物有望成為新型非病毒基因載體材料。.第6期張璇等:聚乙二醇-聚乙烯亞胺共聚物的制備及其表征57[5] JUNG W H,JAE HP, KANG M H, et al. PEGylatedpolyethyleninine for in vivo local gene delivery based onlipiodolized emulsion system[ J]. J Controlled Release ,(2) mPEG(5000)2004, 99(1): 167- 176.[6] TANGA GP, ZENGA J M, GAOASJ, et al. Polyethy--(b) PEG-PEI(-25-3)lene glycol modified polyethylenimine for improved CNS(c) PEG-PEl(5-25-2)gene transfer: effects of PECylation extent[ ]. Biomate-rials, 2003, 24(13): 2351 - 2362. .-(d) PEG-PE(5-2S-1)7] SUNGSJ, MINS Y,CHO K Y, et al. Eleet of polyth--50_10150 2006rylene gycol on gene delivery of polyethyleni- mine[J].Biol Pharm Bull, 2003 , 26(4): 492 -500.圖5 mPEG 及共聚物的DSC曲線[8] 鐘立.異氰酸酯的合成與應(yīng)用[J].化工進展,2000Fig5 DSC curves of mPEG and copolymers(4) :50-53.[9] PETERSEN H, FECHNER P M, MARTIN A L, et al.參考文獻:Polyethyleninine-graf-poly( ethylene glycol) copolymers:influence of copolymer block stuture on DNA complex-[1] KAKIZAWA Y, KATAOKA K. Block copolymer micellsation and biological activities as gene delivery system[J].for delivery of gene and related compounds[J]. 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J Contolled Release, 2001 ,72(1-3): 115 - 125.Synthesis and Characterization ofPoly ( ethylene Glycol) - Polyethlenimine' CopolymerZHANG Xuan, PAN Shi-rong, L0 Shu, HU Hai-mei, ZHANG Wei(The No. 1 Afiliated Hospital, SUN Yat-sen University , Cuangzhou 510080, China)Abstract: PEI was modified with PEC in order to improve is physical properties for nonviral gene delivery. mPEGwas modifed with IPDI, which was reacted with PEI to synthesize the block copolymer of PEG-PEI. The copolymerwas characterized by IR, 'H NMR, GPC, DSC analysis. IR spectrum showed the absorption of the isocyanate ofmPEG-NCO and absorption of the urea bond of PEG-PEI. The results of 'H NMR analysis indicated the polymeriza-tion was a controlled reation, in which the composition and molecular weight of the copolymer could be contrlledthrouth adjusting ratio rates. The GPC of the copolymer exhibited only one peak different from that of PEG and PEIhomopolymers, ilustrating the product only contained PEC-PEI copolymer. DSC measurements of copolymershowed a shift of T。to lower values in comparison to the T. of PE中國煤化工antanglement of thetwo blocked chains. The results indicated the PEG-PEI block cosfully.THCN M H GowmsieKey words: polyethylenimine; monomethoxy ( polyethylene glycon, ,wpurylror, soupuun usocyanate