國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志2012年1月第33卷第1期 Int J Lab Med. January2012.vol.3ai基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究楠竹葉乙醇提取液與水煮液的抑菌效果比較梁瑩(威寧學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原系實(shí)驗(yàn)室43710摘要:目的比較楠竹葉無水乙醇提取液與楠竹葉水煮液的抑菌效果。方法采取瓊脂平板擴(kuò)散法測定楠竹葉無水乙醇提取液與楠竹葉水煮液的抑菌效果及其最小抑菌濃度(MC)。結(jié)果無水♂醇提取液與水煮液對(duì)金黃色萄萄球菌、表皮葡笥球菌、大腸杄菌、傷寒杄菌、普遜變形杄菌、枯草芽孢杄菌均有明顯的抑菌效果,當(dāng)提取液的濃度在100%和50%時(shí)的最小抑菌濃度分別為6.25%、12.5%、3.13%、6.25%、12.5%、25%和12.5%、12.5%、25%、12.5%、6.25%、50%。結(jié)論無水乙醇提取液的抑菌效果與濃度有密切關(guān)系,而水煮液兩種濃度的抑菌效罘與濃度影響不大。且提取液濃度在50%時(shí)與水煮液濃度在100%時(shí)的抑菌效果差距不大。因此,楠竹葉的水煮液對(duì)G和G菌的感染均有輔助療效的作用關(guān)鍵詞:乙醇;楠竹葉;提取液;水煮液;抑菌效果DOI:10.39691673-4130.2012,01.019文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1673-4130(2012)01-0045-02The compare on the antibacterial effect of bamboo leaves ethanol extracts and bamboo leaves decoctionDe partment of Medical microbiology of Basic Medical, Xianning University, Hubei 437100, ChinaAbstract: Objective To compare on the antibacterial effect of bamboo leaves ethanol extracts and bamboo leaves decoction.Methods Agar plate diffusion method was used to determine ethanol extract of bamboo leaves and bamboo leaves and decoction an-tibacterial effect of the minimum inhibitory concentration Results It showed that ethanol and decoction extract were significanttibacterial effect against Staphylococcus aureus Staph. epidermidis, Escherichia coli Salmonella typhi, proteus vulgaris, Bacillus subtilis, the minimal inhibitory concentration of the extract for them were 6. 25%.12 5%.3. 13%.6.25%, 12.5%. 25% and 12.5%12.5%,25%.12.5%.6. 25%,50% when the concentration of extract at 100% and 50%. Conclusion The experiment indicatesthat the antibacterial effect of bamboo leaves ethanol extracts is closely related to the concentration, and the antibacterial effect ofbamboo leaves decoction is little related to the concentration, and the antibacterial effect of extract concentration in 50% and decoction concentration in 100% are not differ much. Therefore, the decoction of bamboo leaves have secondary treatment effects forgram positive and negative bacteria.ambotibacterial effec楠竹又名毛竹、貓頭竹、孟宗竹,屬禾本科竹亞科剛竹屬,術(shù)有限責(zé)任公司)普通肉湯培養(yǎng)基(由本室提供)。多年生綠植物,主要分布在湖南、湖北、江西、福建等地。楠竹1.1.4供試菌金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、表皮葡萄球竹葉在食用、藥用方面都有著悠久的歷史。竹葉含有大量的黃菌(ATCC12228)、大腸桿菌(ATCC25922)、傷寒桿菌(ATCC酮、內(nèi)酯、多糖、葉綠素、氨基酸、維生素、微量元素等營養(yǎng)素。14028)、普通變形桿菌(ATCC49132)、枯草芽孢桿菌(ATCC其中黃酮具有抗衰老、抗應(yīng)激、抗疲勞、調(diào)節(jié)血脂、阻斷亞硝化9372),來源于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)微生物學(xué)教硏室反應(yīng)、增加免疫能力、抗菌和抑菌等作用2。據(jù)《中藥大辭典》1.1.5試劑石油醚(上海寶曼生物科技有限公司),無水乙記載,淡竹葉功用:主治清熱除煩,生津利尿;治熱病煩渴,小兒醇(安徽特酒總廠),0.9%的無菌生理鹽水(湖北拓朋藥業(yè)有限驚癇,咳逆吐血,面赤,小便短赤,口糜舌瘡等。近幾年來,有關(guān)公司人員對(duì)楠竹葉乙醇提取液的抑菌效果作了大量的研究3,得到1.1.6陽性藥物紙片青霉素( peillin G,PG)、鏈霉素( strep了廣泛的認(rèn)識(shí)。但是,提煉提取液的操作過程繁瑣,而楠竹葉水 tomycin,Sim)、慶大霉素( gentamicin,Gm)、氯霉素(ch煮液既方便又省時(shí)更省力省費(fèi)用?，F(xiàn)以楠竹葉無水乙醇提取液 phenicol,CM)均來自杭州天和微生物試劑有限公司的抑菌效果與楠竹葉水煮液的抑菌效果進(jìn)行比較,報(bào)道如下。1.2方法1材料與方法1.2.1供試菌懸液的制備營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基24h新1.1材鮮培養(yǎng)物,用無菌生理鹽水洗下,并稀釋至含菌量為5×10°1.1.1設(shè)備DHP9082D電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海申賢恒溫設(shè)5×10CFU/mL(麥?zhǔn)媳葷岱?的懸液,備用5備廠);全自動(dòng)不銹鋼雙層立式電熱蒸汽壓力消毒器(上海三申1.2.2楠竹葉提取液的制備6將楠竹葉烘干,粉碎,稱取醫(yī)療器械有限公司);垂直流超凈工作臺(tái)(上海智城分析儀器制10g竹葉于三角燒瓶中,加人100mL石油醚,常溫脫脂脫色2造有限公司);RE20lC(2L)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(南京旺厚儀器設(shè)備有h,過濾回收限公司);DK-600電熱恒溫水溫槽(上海申賢恒溫設(shè)備廠);熱回收除盡中國煤化工的石油醚通過水溶加在60℃恒溫水浴TDL80-2B臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);電熱鼓風(fēng)干燥箱中提取16CNMHG心沉降10mn,去除箱(上海申賢恒溫設(shè)備廠)。沉淀雜質(zhì)得到棕色的提取液。提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進(jìn)行真空1.1.2楠竹葉采摘于咸寧學(xué)院校園小竹林的當(dāng)年竹葉。濃縮,濃縮至10mL內(nèi),再加適量蒸餾水繼續(xù)濃縮除去溶劑至1.1.3培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂(BR生化試劑。北京奧博星生物技10mL,經(jīng)高壓蒸汽滅菌,備用國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志2012年1月第33卷第1期 IntJ Lab Med. January2012,Vol.33,No.11.2.3楠竹葉水煮液的制備將新鮮楠竹葉50g洗凈涼表3楠竹葉水煮液的抑菌效果干,剪碎,加適量蒸溜水煎煮30min后倒出,再加適量的蒸溜抑菌圈直徑(mm)水繼續(xù)煎煮20min倒出,將兩次提取液合并,過濾,濃縮至50供試菌100%m(100%)。經(jīng)高壓蒸汽滅菌,備用。2.4實(shí)驗(yàn)紙片制備將備用的楠竹葉提取液和楠竹葉水煮金黃色葡萄球菌液作為原液,分別用2倍稀釋法稀釋成兩種不同的濃度表皮葡萄球菌100%、50%8,用新華定性濾紙制作成直徑5mm的濾紙片大腸桿菌經(jīng)高壓蒸汽滅菌處理后,置120℃,2h烤干,用無菌鑷子夾取傷寒桿菌浸在不同濃度的楠竹葉提取液和楠竹葉水煮液中12h,備用。普通變形桿菌1.2.5陰性對(duì)照液紙片的制備將直徑5mm的無菌濾紙片放入0.9%的無菌生理鹽水中浸泡12h,備用枯草芽孢桿菌1.2.6瓊脂平板擴(kuò)散法測定用涂抹法將各供試菌液(100L)接種在培養(yǎng)基上,再用無菌鑷子夾取浸有不同濃度提取液表4陽性、陰性對(duì)照組的抑菌效果和水煮液的濾紙片及陽性和陰性對(duì)照紙片,分別貼于涂布供試抑菌圈直徑(mm)菌的瓊脂平板上。其中每個(gè)瓊脂平板貼3片,每種細(xì)菌對(duì)應(yīng)每供試菌鹽水種液片重復(fù)3次。完成后,置于37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24h,觀金黃色葡萄球菌察測定各瓊脂平板上濾紙片周圍抑菌圈直徑的大小,比較抑菌效果表皮葡萄球菌1.2.7最小抑菌濃度(MIC)的測定用2倍稀釋法,將楠大腸桿菌竹葉提取液與楠竹葉水煮液的原液(100%),用無菌蒸餾水稀傷寒桿菌釋為50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%、1.56%6種不同濃普通變形桿菌0度,分別取2mL放入無菌平板內(nèi),然后倒入高壓滅菌后的營枯草芽孢桿菌養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基2mL,充分混勻,冷卻凝固后,每個(gè)平板加人0.2mL供試菌液涂勻。每個(gè)濃度重復(fù)3個(gè),以不放提取液和水煮無抑菌效果液的平板作為對(duì)照完成后37℃培養(yǎng)24h觀察結(jié)果,以含提2.2最小抑菌濃度(MIC)測定結(jié)果見表5取液與水煮液濃度低,而無肉眼可見菌生長的平板濃度為該菌表5提取液與水煮液最小抑菌濃度(MIC)的最小抑菌濃度(MIC)最小抑菌濃度(MIC)1.2.8藥敏實(shí)驗(yàn)紙片判斷標(biāo)準(zhǔn)見表供試菌表1藥敏實(shí)驗(yàn)紙片判斷標(biāo)準(zhǔn)提取液(%)水煮液(%)抑菌圈直徑(mm)金黃色葡萄球菌6,25抗菌藥物高度敏感中度敏感耐藥表皮葡萄球菌大腸桿菌25.0≤11傷寒桿菌普通變形桿菌枯草芽孢桿菌25.0050.03討論葉無水乙醇提取液與楠竹葉水煮液和陽性、陰性對(duì)照組的抑菌效果新鮮竹葉乙醇提取液及水煮液的濃度在本研究顯示,100%的提取液對(duì)供試菌的抑菌效果均比較強(qiáng)。而提取液濃度在50%時(shí),供試菌的抑菌圈直徑落差較大0%和50%時(shí)對(duì)供試菌都有明顯的抑制作用。其中對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等化膿性球菌的抑制能力最強(qiáng),大特別是金黃色葡萄球菌由18.5mm下降到10.5mm,表皮葡萄球菌的抑菌圈直徑也由21.5mm降至12.0mm。說明提取腸桿菌、傷寒桿菌、普通變形桿菌等腸道桿菌的抑菌效果次之,液的抑菌效果與濃度有密切的關(guān)系。但對(duì)大腸桿菌、傷寒桿菌枯草芽孢桿菌的抑菌效果最弱。見表2~4影響不大。本研究顯示,楠竹葉的水煮液濃度在100%和濃度表2楠竹葉提取液的抑菌效果在50%時(shí),供試菌的抑菌圈直徑相近,說明抑菌效果與濃度無抑菌圈直徑(mm)供試菌明顯差異,具體原因有待于進(jìn)一步研究賈桂云等0報(bào)道,竹葉的提取液適合添加到由細(xì)菌引起金黃色葡萄球菌變質(zhì)的食物中。說明竹葉的提取液在飲食過程中無毒無害表皮葡萄球菌而姚志蕊等腸桿菌為防腐劑,中國煤化工過敏反應(yīng)。上述研究傷寒桿菌均表明,楠CNMHG個(gè)生產(chǎn)領(lǐng)域。根據(jù)普通變形桿菌藥物敏感實(shí)驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)12,抑菌效果表明竹葉提取液及水煮枯草芽孢桿菌液對(duì)G-和Gˉ菌均有一定的抑制作用,特別對(duì)化膿性球菌作用更加明顯。因此,有待成為純天然的廣譜抗(下轉(zhuǎn)第48頁)國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志2012年1月第33卷第1期 IntJ Lab Med, January2012,Vol.33,No.1(可能還有吸入)卵囊污染的水或食物而被感染。進(jìn)入人體后,[3]XaoL,FaRyan U, et al. Cryptosporidium taxonomy: recent卵囊內(nèi)的子孢子逸出并寄生于胃腸道或其他組織(如呼吸道)advances and implications for public health [J]. Clin Microbiol上皮細(xì)胞,經(jīng)裂體增殖及配子增殖發(fā)育為卵囊。卵囊在宿主體Rev,2004,17(1):72-9內(nèi)形成孢子排出。卵囊有兩種,一種是通常從宿主排泄的厚壁4]葉應(yīng)嫵,王毓三,申子瑜全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程[M].3版南京卵囊,一種是與自體感染有關(guān)的薄壁卵囊。隱孢子蟲的生活東南大學(xué)出版社,2006:308史僅需5~11d即可完成。由于卵囊排出體外時(shí)已具有感染[5 Pantenburg B, Dann sm, Wang HO. Intestinal immune responseto human Cryptosporidium sp, Infection[J]. Infect Immun. 2008性,使直接和即刻的糞-口傳播成為可能6(1):23-29隱孢子蟲感染是引起艾滋病患者腹瀉的最常見原因。嚴(yán)6〕趙杰,張龍現(xiàn),李逐波.隱孢子蟲病研究進(jìn)展[J].河南備牧獸醫(yī),重的腹瀉多發(fā)生于CD4細(xì)胞顯著減少(<200/L)的支滋病2008,29(5):8-9患者,感染起始于空、回腸,可播散至大部分的胃腸道黏膜。[7]吳亮,陳盛霞,曹建平,等,隱孢子蟲病的流行與診斷研究進(jìn)展臨床特征為頻繁水瀉,一天有數(shù)次至數(shù)十次,患者可出現(xiàn)嚴(yán)重[J].國際醫(yī)學(xué)寄生蟲病雜志,2006,33(5):277-281脫水和電解質(zhì)紊亂,一些患者可進(jìn)展為慢性腹瀉。人對(duì)隱孢子8]張艷梅,潘自鐵,高永剛.人類免疫缺陷病毒感染者及艾滋病患者蟲的易感性與年齡顯著相關(guān),5歲以下嬰幼兒易感染,先天及免疫功能與病毒載量之間的關(guān)系[J.國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2008后天免疫功能低下者及接受免疫抑制劑治療的患者感染率高,也可發(fā)生嚴(yán)重的隱孢子蟲感染1。由藥物造成免疫功能低[9王,劉泉波,許紅梅.兒童遷延性慢性腹瀉的病因分析[J,國際下的患者,停藥后隱孢子蟲病即可痊愈檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2011,32(2):236-238目前,診斷隱孢子蟲病的方法有多種,如病原學(xué)檢查法、免101 Ford A, Duke T, Campbell H. Evidence behind the WHO guide疫學(xué)方法和核酸分子生物學(xué)方法13。免疫熒光法及PCR方lines: hospital care for children: what is the aetiology and treat-ment of chronic diarrhoea in children with HIVLJ. J Trop Pedi-法在國內(nèi)外都已有所應(yīng)用,但由于其成本較高及標(biāo)準(zhǔn)化等原atr,2009,55(6):349-355因,不易于普及病原學(xué)檢查目前仍是隱孢子蟲病確診的[11 Sandhu sK, Priest Jw, Lammie Pi,etal. The natural histroy of金標(biāo)準(zhǔn)。病原學(xué)診斷方法包括碘染色、沙黃-美藍(lán)染色、金胺酚染色、改良抗酸染色等,從糞便中檢查隱孢子蟲卵囊。其isk of HIV infection[J]. Infec Dis, 2006, 194(10): 1428-1437中,改良抗酸染色是臨床實(shí)驗(yàn)室最常使用的可靠方法,抗酸染[12] Udgiri n, Minz M, Kashyap r,eta. Intestinal cryptosporidiosis in色鏡下卵囊呈亮紅色,圓形或橢圓形,直徑4~5m,內(nèi)部子孢living related renal transplant recipients [J]. Transplant Pro子清晰可見。為提高卵囊的檢出率,涂片染色前應(yīng)先濃集卵囊,甲醛乙酸乙酯沉淀法是推薦使用的臨床實(shí)驗(yàn)室糞便濃集13]田利光,周曉農(nóng).艾滋病患者幾種易被忽視的腸道寄生蟲感染方法。].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志,2008,26(5):376-381[14]陳盛霞,吳亮,沈玉娟,等.采用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)比較不同方法提純參考文獻(xiàn)隱孢子蟲卵囊DNA效果[].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志2009,27(2):130-1[1] Certad G, Arenas-Pinte A, Pocaterra L, et al. Cryptosporidiosis in[15]盧良安,張文生,李碧波.隱孢子蟲病的病原學(xué)診斷及病例對(duì)照研HIV-infected venezuelan adults is strongly associated with acute究[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2009,15(13):150-151.or chronic diarrhea[J]. Am J Trop Med Hyg, 2005,73(1):54-57[2]杜學(xué)利.免疫缺陷病人隱孢子蟲感染流行病學(xué)特征研究進(jìn)展[](收稿日期:2011-09-20)中國病原生物學(xué)雜志,2010,5(9):699-702(上接第46頁)5]譚瑤,趙清.KB紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)[].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床菌藥物的可靠來源2010,7(20):2290-2291本研究顯示,楠竹葉提取液濃度在50%時(shí)與水煮液濃度6]黃占旺,鄒雙雙,熊水波,等,毛竹葉提取物抑菌作用的初步研究在100%時(shí)的抑菌效果差距不大,而水煮液濃度在100%和J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,27(6):961%時(shí)的抑菌效果均比較穩(wěn)定。因此,提取液的抑菌效果還是[7]陳奇中藥藥理實(shí)驗(yàn)[M.貴陽:貴州人民出版社,198:81比相同稀釋度水煮液的抑菌效果要好。但是考慮到中國人[8]蕭力爭,郭維,劉素純,等,茶葉提取物與二氫楊梅素抑菌活性比眾多,特別是偏僻山區(qū),醫(yī)源條件不齊,同時(shí),水煮液比提取液較研究[J.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,35(2):239-242制作更加方便、經(jīng)濟(jì),需要的儀器條件更為簡單,因此對(duì)于一些[9]李桂蘭,芮成.3種杏香兔耳提取物抑菌活性的研究[.中國醫(yī)藥指南,2010,8(7):45-47常見的皮膚化膿性感染的日常家庭治療,水煮液更為方便實(shí)[10]賈桂云,鄒潤英,郭飛燕,等.竹葉提取物抑菌效果研究[.海南用。輔以飲用、外用、預(yù)防、保健都具有良好的抑制細(xì)菌生長的師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2010,23(4):420-42作用[11]姚志蕊,曹光群,楊成,等.毛竹葉抑菌活性成分提取工藝研究參考文獻(xiàn)].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2008,28(5):51-54[12]姚旌旗,覃金紅,孫劍剛,等.病原學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].北[1]陶文亮,吳玉娟.竹葉黃酮提取分析方法的研究及其新進(jìn)展[J京:科學(xué)出版社,2007:67-68貴州化工,2009,34(3):15-17[13]陽東青,趙美麗,余德潤,等.從竹葉中提取葉綠素[].江西化工2]張英.竹葉黃酮的生理和藥理活性[J].世界竹藤通訊,2004,2中國煤化工[14]孫長花CNMHG生理活性與應(yīng)用研究3]荊文靜.竹葉黃酮類化合物研究進(jìn)展[J].科技情報(bào)開發(fā)與經(jīng)濟(jì)J].四川2009,19(20):139[4]衛(wèi)生部衛(wèi)生法制與監(jiān)督司.消毒技術(shù)規(guī)范[S].2002-11-15.(收稿日期:2011-07-09)