沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),201006,41(3):2099303Joumal of Shenyang Agricultural University, 2010-06, 41(3): 299-303鎘對土壤脲酶動力學(xué)特征的影響張昀,可欣2,關(guān)連珠1*,顏麗1(1沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院,沈陽10866;2沈陽航空航天大學(xué)遼寧省清潔能源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,沈陽110136)摘要:采用室內(nèi)模擬培養(yǎng)的方法,對鎘污染土壤脲酶動力學(xué)特征進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:脲酶活性隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而降低,并在第6天達(dá)到最大抑制率;同一培養(yǎng)時(shí)間內(nèi),隨著鎘濃度的增加,土壤脲酶活性呈現(xiàn)降低的趨勢;兩種模型擬合結(jié)果表明模型yrc(l+axy(14+bx)擬合效果較好,說明鎘對土壤脲酶活性的抑制為部分抑制;隨著鎘濃度的增加K值不變,V-和V/K。呈降低趨勢,說明鎘對土壤脈酶的作用為非競爭型抑制,即抑制作用為部分非競爭型抑制。關(guān)罐詞:鎘;脲酶;酶動力學(xué);土壤污染中圖分類號:S1542文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1000-1700(2010)03-0299-05Effect of cadmium on Kinetic characteristics of soil ureaseZHANG Yun! KE Xin GUAN Lian-zhu* YAN Li'(1. College of Land and Environment, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 2 Shenyang AeroSpace University, Liaoning KeyLab of Clean Energy, Shenyang 110136, ChinaAbstract: The kinetic characteristics of soil urease were studied. The results showed that soil urease was remarkable inhibitedwith the concentration of Cd adding. While the maximum inhibtion ratio was attained in the sixth incubation day, the relationshipbetween the concentration of Cd+ and soil urease was described by two models, and the model y=c(1 +ar (1 +bx)was moresuitable. This means that the inhibtion of Cd on soil urease was part of inhibition. The K. was not effected, but the V andVK, were lowed while Cd adding. This results showed that the enzymatic reaction mechanism was noncompetion-inhibitorybetween soil urease and cadmiumKey words: Cadmium; soil urease; enzyme kinetic; soil contamination鎘Cd)是危及人類健康的有毒重金屬之一,在美國毒物管理委員會( ATSDR)黑名單上名列第六位常隨著工業(yè)三廢的排放及農(nóng)藥、施肥等農(nóng)事活動進(jìn)人到土壤生態(tài)系統(tǒng)中,并最終通過遷移、富集等過程進(jìn)入食物鏈,對植物微生物、動物及人類產(chǎn)生威脅。我國土壤鎘污染面積約為13300hm2,土壤鎘含量在1-5ng·kg,最高可達(dá)10mg-kg。土壤酶是土壤中重要的生物大分子,作為養(yǎng)分循環(huán)、有機(jī)質(zhì)形成、能量代謝等過程的催化劑,近年來被應(yīng)用于土壤污染研究領(lǐng)域。由于土壤脲酶動力學(xué)特征不僅可以顯示土壤脲酶含量的高低,而且反映了土壤脲酶與底物、土壤有機(jī)-無機(jī)復(fù)合體等之間結(jié)合的緊密程度和作用過程,因此被廣泛關(guān)注嗎。近年來,在污染物和抑制劑與土壤酶之間關(guān)系的研究中,土壤酶動力學(xué)方法已逐漸開始被采用,但關(guān)于鎘對棕壤脲酶動力學(xué)特征影響的報(bào)道較少。因此開展此方面研究具有重要的理論和實(shí)際意義。本研究釆用室內(nèi)模擬培養(yǎng)方法,對鎘污染土壤的脲酶特征進(jìn)行分析,以探討二者關(guān)系及作用機(jī)理,為環(huán)境監(jiān)測提供相關(guān)依據(jù)。1材料與方法11供試土壤供試土壤為典型棕壤采自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)天柱山田間試驗(yàn)區(qū),為未受污染土壤,采樣時(shí)先去除0~5cm表面土樣,然后五點(diǎn)法釆集5-20cm土樣,供試土壤均勻風(fēng)干后挑除植物殘?bào)w,過2mm尼龍篩備用。用常規(guī)方法測定土壤理化性質(zhì)。供試土壤基本理化性質(zhì)見表1中國煤化工收稿日期:2010-03-19CNMHG基金項(xiàng)目:遼寧省教育廳創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(20081151)作者簡介:張畇(197-),女,沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)講師,博士研究生,從事環(huán)境土壤學(xué)研究?！ねㄓ嵶髡?Corresponding author:美連珠(1958-),男,沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)教授,博士,從事土壤環(huán)境研究沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)第41卷喪1供試士壤基本理化性質(zhì)Table 1 Some physical and chemical properties of tested soil陽離子「機(jī)質(zhì)交換量速效鉀全氤全磷堿解氮有效確全量鎘Avail.KTotal PCECs-Avail K Total NAvail P/gkg/g*kg/col.K/mg kg/mg·kg1.2方法將過2mm篩的土壤樣品500g,裝入培養(yǎng)缽中加水至田間持水量的65%,于28℃下培養(yǎng)1周,加入不同濃度的cdC2溶液,使土壤鎘濃度分別為10,30,50,100,200 d".kg",于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),各處理均重復(fù)3次,每天稱重以保持土壤含水量不變,并攪拌土壤,保持土壤通氣性,分別于培養(yǎng)的1,3,6,10,15,30d進(jìn)行取樣分析,測定土壤脲酶活性嗎。分別稱取上述不同培養(yǎng)時(shí)間的土樣500g,加入1mL甲苯15min后添加10mL不同濃度(001,0.025,0.05,0.1,0.2molL)尿素溶液和20mLpH67檸檬酸緩沖液,37℃培養(yǎng),培養(yǎng)結(jié)束后,濾液中被脲酶水解成的氨氮用靛酚蘭比色測定脈酶活性,并計(jì)算脲酶動力學(xué)參數(shù)。13模型的建立和數(shù)據(jù)處理131動力學(xué)參數(shù)的計(jì)算米氏方程:v=mSL式中:V為酶促反應(yīng)初始濃度;v=為最大反應(yīng)速度;S為底物濃度;Kn是為米氏常數(shù)。方程經(jīng)過數(shù)學(xué)變換,變形為:用 Sigmaplot軟件進(jìn)行擬合即可求得K和V=。132模擬方程 SPEIR從米氏動力學(xué)方程推導(dǎo)出砷抑制土壤酶活性的兩種模型:(1)y=/(1+bx)和(2)y=c(1+ax)(1+bx)(圖1),可以用來擬合外源污染物(x)與土壤酶活性(y)之間的關(guān)系,兩種擬合方程分別賦予其重要的信息,即反映的作用機(jī)理分別為完全抑制(包括完全競爭抑制或完全非競爭性抑制)和部分抑制(包括部分競爭抑制和部分非競爭性抑制)mac+c。b作用:其中a,b,c為在一定底物濃度下受到抑制常數(shù)K、最大反應(yīng)速度和米氏常數(shù)以及抑制類型等共同作用下形成的復(fù)合參數(shù),c為污染物濃度為0時(shí)土壤酶活性理論值,a,b,c均為正數(shù),且b>d1。由兩種模型的擬合方程可計(jì)算生態(tài)劑量( ecological dose,ED)EDo、ED、ED值,其分別代表土壤酶活性被抑制10%、圖1分別用模型(1)-)和模型(2)(……表示土壤50%和90%時(shí)所需要的污染物濃度或劑量。通常人們將EDs酶活性(v)與污染物濃度(i)之間的關(guān)系作為土壤污染的一個(gè)臨界濃度。由模型(1)計(jì)算的EDo為土壤 Figure 1 Relationships between enzyme(v)酶活性理論值(c)降低到50%時(shí)的污染物濃度,即ED=1;模 activies and inhibitor concentration (i)descri型(2)中土壤酶活性沒有降低到0,而是降低到漸進(jìn)值(平行于x軸,但在x軸之上),因此由模型(2)計(jì)算的EDs為土壤酶活性降低到理論值(c)與漸進(jìn)值之間的一半時(shí)的污染物濃度,即ED=(1-ab)/(b-a)。13.3土壤酶活性的影響率的計(jì)算為了定量描述不同濃度鎘對土壤酶活性的影響,采用土壤酶活性影響率對其進(jìn)行描述土壤酶活性的影響率=CUYH中國煤化工CNMHG式中:U為各處理土壤酶活性3次重復(fù)平均值;U為對照(鎘濃度為0mgkg4的處理)土壤酶活性為3次重復(fù)平均值。土壤酶活性的影響率包括兩種:如果其值為正,則為激活率;如果為負(fù),則為抑制率。第3期張昀等:鎘對土壤脲酶動力學(xué)特征的影響2結(jié)果與分析襄2不同培養(yǎng)時(shí)間不同濃度鎘處理土壤脲酶活性Table 2 Soil urease of different Cd concentrations in21鎘對土壤脲酶活性的影響different incubation time由表2可見,在整個(gè)培養(yǎng)期間內(nèi)對照處理的土壤脲酶活性 Soil urease脲酶活性無明顯變化,添加鎘的各處理脲酶活性3d6d10d均隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢,并在第6天出現(xiàn)一個(gè)最低峰,各處理的土壤脲4.14C408E3013.854c455C454C酶活性分別為301,242,2.04,171,1,26μg·g同0003953.574242403.25:3963.96培養(yǎng)時(shí)間內(nèi),隨著鎘濃度的增加,土壤脲酶活性3.83301c204c3.I1k3.793.78呈現(xiàn)降低的趨勢,到培養(yǎng)結(jié)束時(shí),各處理的土壤脲27211.729183.283.28A酶活性趨于穩(wěn)定262673.163.6注:小寫字母表示p005水平差異顯著大寫字母表示p<001水平差異顯2.2鎘對土壤脲酶影響率的動態(tài)影響著同一列中相同字母表示各處理間差異不顯著,不同字母表示各處理為了定量描述不同濃度鎘對土壤脲酶活性的間差異顯著。影響,采用土壤脲酶活性影響率對其進(jìn)行描述(圖 Note little letters indicated significant diference af005 level, big letters indi-2)。添加10,30,50,100,200mg·kg2鎘的處理在試cated significant diference at 0.01 level, the different letters in same驗(yàn)培養(yǎng)期間內(nèi)對土壤脲酶活性的抑制率分別為columns indicate significant difference between means.0.72%-42.09%,447%~52.24%,8.23%~60.88%培養(yǎng)時(shí)間Ineubation time d1146%-67.29%,1063%-7539%。且均表現(xiàn)為在第6天達(dá)到對土壤脲酶活性的最大抑制作用,不同濃度鎘處理的抑制率分別為4209%、5224%60.88%、6729%、7539%,隨后各處理土壤脲酶活性逐漸恢復(fù)?？?0分別用模型(1)y=c(1+bx)和模型(2)y=c(130ax)(1+bx)兩種模型進(jìn)行擬合(表3),由擬合方程可口100計(jì)算生態(tài)劑量( ecological dose,ED) EDoEDs、ED值,其分別代表土壤酶活性被抑制10%、50%和圖2不同濃度鎘對土壤脲酶的影響率90%時(shí)所需要的污染物濃度或劑量。通常人們將 Figure2 The effect ratio of different Cd concentrations onEDx作為土壤污染的一個(gè)臨界濃度。soil neutral phosphatase表3土壤脲酶活性與不同濃度鎘的模擬方程Table 3 The fit models betweeen concentration of Cd and soil urease型參數(shù)培養(yǎng)時(shí)間 Incubation time/dModel模型(1)00069002700002700031y=c/(1+bx)4.080846934457214.56160927142986113050007100259001200122y=c(l+ar(1+bx) b4.70345.106451415485574.834709870.99208853.668中國煤化工332.397漸進(jìn)值 Asymptote2296aL,.CNMHG7Z2 2.756注:*表示P0.05水平差異顯著表示R001水平差異顯著,漸進(jìn)值為土壤酶活性譯世為對于模型沒有意義的數(shù)值Note:* indicated significant diference at 0.05 level, **indicated significant diference at 0.01 level, Asymptote values are presentde as maximum(unin-hibited)activity;-indicates no fit of the date to the model沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)第41卷由模型(1)擬合的決定系數(shù)為0623-0927,而由模型(2)擬合的決定系數(shù)為0893~0992,模型(2)的決定系數(shù)大于模型(1)的決定系數(shù)模型(2)比模型(1)更能表示不同培養(yǎng)時(shí)間不同濃度鎘與土壤脲酶活性之間相關(guān)關(guān)系。從側(cè)面表明了鎘對土壤脲酶的作用為部分抑制,其中包括部分競爭抑制和部分非競爭性抑制由模型(2)計(jì)算出的EDo值在5-263mg·kg之間,而由模型(1)計(jì)算出的EDs在37-1429mg·kg4之間,由模型(2)計(jì)算出的EDs明顯小于由模型(1)計(jì)算出的EDsEDo值表征土壤受到了極為嚴(yán)重污染時(shí)的濃度,此時(shí)土壤已經(jīng)基本喪失了生產(chǎn)的功能,由模型(2)計(jì)算出的ED為432mgkg2,此時(shí),土壤就達(dá)到了極其嚴(yán)重污染的程度,從土壤生化角度來講,土壤已經(jīng)不能完成物質(zhì)轉(zhuǎn)化、能量代謝等功能。23鎘對土壤脲酶動力學(xué)參數(shù)的影響在試驗(yàn)培養(yǎng)期間,各處理土壤脲酶的K值基本保持不變(表4),鎘的加入并未使土壤脲酶的K。值增大無明顯影響,并沒有隨著鎘濃度的加大,土壤脲酶的Kn值增大,說明鎘的加入沒有影響酶與底物的親和力減小,屬于典型的非競爭性抑制。在試驗(yàn)培養(yǎng)期間,各處理土壤脲酶的V。值呈現(xiàn)升高-降低的趨勢(圖3a),并在培養(yǎng)的3-6d出現(xiàn)一個(gè)最高峰,鎘加入使土壤脲酶的V。降低,并隨著鎘濃度的加大,土壤脲酶的V值逐漸減少,說明鎘的加入,減弱了酶-底物復(fù)合體形成產(chǎn)物的能力。表4不同濃度鎘處理在不同培養(yǎng)時(shí)間下K。值Table 4 Effect of different of Cd concentrations on soil urease K, in different incubation days鎘濃度/ mg.kgd concentration0.03500340037峽100036003803300340.035M在試驗(yàn)培養(yǎng)期間,各處理土壤脲酶V。/K的變化趨勢與V的變化趨勢相似,即呈現(xiàn)升高-降低的趨勢圖3b),并在培養(yǎng)的3~d出現(xiàn)一個(gè)最高峰,鎘加入使土壤脲酶的V-/K降低,隨著鎘濃度的加大,土壤脲酶的V。/K值逐漸減少,說明鎘的加入,減弱了土壤脲酶在催促反應(yīng)過程中的催化強(qiáng)度。ng·k圖3不同濃度鎘對土壤脲酶V和v。Kn的影響Figure 3 Effect of different of Cd concentrations on soil urease Va and V-K, in different incubation days3結(jié)論與討論中國煤化工本研究結(jié)果表明,脲酶活性隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而降低,THCNMH同一培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)隨著鎘濃度的增加,土壤脲酶活性呈現(xiàn)降低的趨勢,這與胡著邦等的研究結(jié)果較為相似。目前國內(nèi)外公認(rèn)的重金屬對土壤酶活性的抑制機(jī)理可能包括兩個(gè)方面:一方面,重金屬加入土壤后與酶分子中的活性部位巰基和含第3期張昀等:鎘對土壤脲酶動力學(xué)特征的影響303·咪唑的配位體等結(jié)合形成較穩(wěn)定的絡(luò)合物,產(chǎn)生了與底物的競爭性抑制作用鳴;另一方面,重金屬抑制了土壤微生物的生長和繁殖減少微生物體內(nèi)酶的合成和分泌,最后導(dǎo)致土壤酶活性下降鎘對土壤脲酶活性的抑制作用隨時(shí)間的變化先增加而減小,可能與鎘的形態(tài)轉(zhuǎn)化有關(guān),并且土壤具有保護(hù)酶的能力,且這種保護(hù)容量常是一相對恒定的值。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)“抗性酶活性”現(xiàn)象認(rèn)為當(dāng)重金屬在土壤中達(dá)到一定濃度時(shí),大部分微生物死亡而一小部分微生物在有毒物質(zhì)污染下能生存下來,自行繁殖從而產(chǎn)生抗性酶活性,表觀上酶活性值降低后又增大兩種模型擬合結(jié)果表明模型y=c(1+ax)1+bx)擬合效果較好,說明鎘對土壤脲酶活性的抑制為部分抑制。從土壤性質(zhì)分析,由于土壤酶受到有機(jī)質(zhì)和粘粒的保護(hù)作用,所以在一個(gè)較寬的污染物濃度范圍內(nèi),其酶活性的變化一般不會總是以直線形式改變,而游離態(tài)酶有可能是以直線形式變化因此從這個(gè)角度來講模型y=c(1+ax)(1+bx)計(jì)算得到的生態(tài)劑量更合理。隨著鎘的增加Kn值不變,V—和V。/K呈降低趨勢,說明鎘對土壤脲酶的作用為非競爭型抑制,即抑制作用為部分非競爭型抑制。研究表明,K。受土壤粘粒含量和有機(jī)質(zhì)含量影響較大,一般粘粒和有機(jī)質(zhì)含量高的土壤Kn較大,本研究中有機(jī)質(zhì)含量和粘?？梢砸暈楣潭ú蛔?由于V-值是總酶量的量度,其值減小說明重金屬鎘對脲酶活性的抑制作用習(xí),從而進(jìn)一步驗(yàn)證了前面的結(jié)論。參考文獻(xiàn)[l]楊勁松張文昌鎘對細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)干擾作用研究進(jìn)展門福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),20064065}537-538[2] STUMM W, MORGAN J J. The solid-solution interface, aquatic chemistry chemical equilibria and rates in natural waters[MWiley interscience, USA, 19963]崔力拓耿世剛李志偉我國農(nóng)田土壤鎘污染現(xiàn)狀及防治對策門現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)20061184-185「4]周禮愷土壤酶活性的總體在評價(jià)土壤肥力水平中的作用土壤學(xué)報(bào)1983,20-413-417[5] BAATH E. Effects of heavy metals in soil on microbial processes and populations(a review)[]Water, Air Soil Pollution,198947:335-379[6 BARDGETT R. D, SPEIR T W, ROSS D J, et al. Impact of pasture contamination by copper, chromium, and arsenictimber preservative on soil microbial properties and nematodes[J]. Biol Fertil Soils, 1994, 18(7: 1-9.門7和文祥蔣新氽桂芬等.殺蟲雙對土壤脲酶活性的影響]土壤學(xué)報(bào)20340(5):750-755[8 PEREZ-MATEOS M, GONZALES-CARCEDO S. EHect of silver, cadmium and lead on soil enzyme activity []. ReviewEcology and Biology of Soil, 1987, 24: 11-18.9李西開土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)常規(guī)分析方法M北京科學(xué)出版社1984[10]關(guān)松蔭.土壤酶及其研究方法M北京:農(nóng)業(yè)出版社,1987[11] SPEIR T W, KETTLES H A, PARSHOTAM A, et al. Simple kinetic approach to determine the toxicity of As (v)to soilbiological properties[J]. Soil Biol Biochem, 1999, 31: 705-713[2】胡著邦汪海珍吳建軍等.鎘與芐嘧磺隆除草劑單一污染和復(fù)合污染土壤的微生物生態(tài)效應(yīng)卩漸江大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版200531(215l-156[13] MEGHARA K V M, SETHUNATUHAN N, NAIAIDU R. Bioavailability and toxicity of cadmium to microorganisms andtheir activities in soil: a review())Adv Environ Res, 2003, 8: 121-135[14]KANDERLER E, TSCHERKO D, BRUCE K D, et al. Structure and function of the soil microbial community inmicrohabitats of a heavy metal polluted soil[l. Bio Fert Soil, 2000, 32: 390-400.[15] MORENO J L HERNaNDEZ T, PeREZ A, et al. Toxicity of cadmium to soil microbialaddition to soil on the ecological dose[. Appl Soil EcoL,2002, 21: 149-158.[16]劉樹慶保定市污灌區(qū)土壤的PbCd污染與土壤酶活性關(guān)系研究土壤學(xué)報(bào)199332)175-182.[17η沈桂芹,廖瑞章重金屬、非重金屬、礦物油對土壤酶活性的影響農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)198763):24-2[18]和文祥朱銘茂陜西土壤脈酶活性與土壤肥力關(guān)系研究Ⅱ土壤脲酶中國煤化工42-45樊軍,郝明德早地農(nóng)田土壤脈酶與堿性磷酸酶動力學(xué)特征U千旱地和文祥,黃英鋒朱銘茂等汞和鎘對土壤脈酶活性的影響門土壤學(xué)報(bào)CNMHG責(zé)任編輯王娟]