934生物學(xué)通報(bào)2007年34(5)合成乙醇重組乳桿菌的研究夏子芳王正祥(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和江南大學(xué)生物工程學(xué)院無錫214122)摘要:將含有 Zymomonas mobilis乙醇合成途徑的關(guān)鍵酶基因的片段 Ptac-pde和 Ptac-adh,分別/同時(shí)接入phy3 300PLK pBBRIMCS載體中,得到了phy-pAB-等重組質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)化入幾株乳桿菌。在42℃下進(jìn)行乙醇發(fā)酵試驗(yàn),結(jié)果表明:在 Lactobacillus plartanum CICIM0080中同時(shí)引入基因pdc、adhB有效地將碳代謝流導(dǎo)向了產(chǎn)乙醇方向,重組B0080(pY-P)發(fā)酵6.7%葡萄糖60h分別產(chǎn)生0.4%(VV)乙醇,為原始B0080的67倍;而將pdc、adhb基因同時(shí)引入. amylowonu112和 acidophilus0068,能檢測到相當(dāng)于原始菌2倍的乙醇產(chǎn)出在重組菌發(fā)酵過程中,仍有大量的乳酸產(chǎn)出,在引入產(chǎn)乙醇基因的同時(shí)敲除乳酸脫氫酶基因,將有可能使乳桿菌的代謝流向更有效地轉(zhuǎn)向產(chǎn)乙醇途徑。關(guān)鍵詞:乳桿菌,乙醇,Ptac-pdc,Ptac-adhB中分類號:Q78文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:02532642075-0934-05 Recombinant Lactobacilli for Ethanol Production' XIA Zi-Fang WANG Zheng-Xiang" Key Laboratory of Inadustrial Biotechnology, Ministry of Educarion and School of Biotechnology, Wuxi 214122) Abatrac: Recombinant plasmids pHY-PA, pBBR-PA were constructed in which genes pde and adh B were placed under the control of tac promoter, ated into Lactobacillus strains for ethanol production. Preliminary ethanol fermentation nsing these Lactobacillus strairs and their recombinants was carried out using 42C ae fermentation temperature. The results indicated that introducing pdc and adhB. athanologe was succesafully constructed in L. plantanum CICIM B0080. 0.4% (VIY) ethanol wen detected at end of fermentatin with 6.7% slucose, and that is 67-fold an the wild-type B0080. Two fold of athanol production was detected in L. amylowonus B0I12 pHY-PA) and L. acidophilw B0068 (PBBR-PA). Introducing both pde and adh B, and mecanwhile knock-outing the lanctate dehydrogmase gene may better convert carbon fluax to ethanologenic direction. Key words: Lactobacillus, Ehanol, Ptac-pde, Ptac-adhB乳桿菌是一類革蘭氏陽性兼性厭氧菌,適宜生產(chǎn)條件。因此,對乳桿菌的代謝途徑進(jìn)行改造,有長溫度高達(dá)40℃~50℃,能在較低的pH和較高鹽望獲得新型乙醇發(fā)酵菌株。另一方面,乳桿菌作為濃度的環(huán)境下生長;其中大多數(shù)能夠代謝包括五碳發(fā)酵乳制品的主要生產(chǎn)菌種,適量乙醇的產(chǎn)出有利糖和六碳糖在內(nèi)的多種糖類能產(chǎn)生具有抑菌或殺于食品風(fēng)味的改善,能與酸類物質(zhì)形成特有的香菌作用的細(xì)菌素,在發(fā)酵生產(chǎn)中能起到抑制其他細(xì)味,給人以提神刺激的感受發(fā)酵乳制品中的微量菌的作用。同時(shí),乳桿菌是目前基于酵母菌的乙醇乙醇能促進(jìn)消化腺機(jī)能增強(qiáng),刺激腸胃蠕動,促進(jìn)發(fā)酵中的主要污染菌21,與酵母競爭性利用培養(yǎng)有機(jī)體的代謝?；械奶荚春透鞣N營養(yǎng)成份,其代謝產(chǎn)物能影響酵乳桿菌中,代謝產(chǎn)生的大量丙酮酸經(jīng)乳酸脫氫母的生長,以致酒精產(chǎn)量的降低;但這也從另一個(gè)酶(D;1.1.1.27)催化而轉(zhuǎn)化為乳酸,通過強(qiáng)化細(xì)側(cè)面反映出乳桿菌能夠適應(yīng)乙醇發(fā)酵過程中的生胞內(nèi)的丙酮酸脫羧酶(PDC EC4.1.1.1)和乙醇脫氫酶(ADH;EC1.1.1.1)的活性來擴(kuò)增目標(biāo)途徑,是新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(No.net-04-9704)通訊作者E-mail zwarg sytu.d.cn收日期:2007-01-19修回日期:2007-04-02007年34(5)微生物學(xué)通報(bào)935構(gòu)建產(chǎn)乙醇乳桿菌的主要策略。本研究以已實(shí)現(xiàn)植物乳桿菌( Lactobacillus plantanum)CM在E.coli中表達(dá)的重組質(zhì)粒ptac-A為基礎(chǔ),構(gòu)B0080、噬淀粉乳桿菌(L. amylovorus)B0112、嗜酸乳建了phy -PA- pBBR--p系列質(zhì)粒在此基礎(chǔ)上構(gòu)建桿菌(L. acidophilus)B0068,克隆宿主菌大腸桿菌乳桿菌重組菌,探索重組乳桿菌的乙醇合成能力。( Escherichia coli)JM109,由江南大學(xué)中國高校工業(yè)微生物資源和信息中心 (cicim-cu, http ://cicim-cu.1材料和方法ytu.edu.cn)保藏。本研究中所使用及構(gòu)建的菌株1.1菌株和質(zhì)粒和質(zhì)粒見表1表1株和質(zhì)粒 Strain or plasmid Characteristies and description Source or reference Strains lactobacillus plantanum B0080 Wild-type strain Isolated from pickle fermentation facility L. amylowor B0112 wild-type strain, capeble of raw starch degrading7] L. acidophilus B0068 wild-type strain, low pH tolerance CICIM-CU Escherichia codi JM109 Cloning strain CICIM-CU Etac-PA Kanr: hartboring pde and adh B that were placed under the control of [6] tac promoter, reepectively pHY300PLK Amp', Tet'; E. oodi- Bacillu sp, shuttle vector CICIM-CU pHY.pdeA mp', Tet'; harboring Ptac-pdc This work pHY-adh Amp', Tet': harboring Plac-adh B This work pHY-PA Ampr, Tetr: harboring both Ptac-pde and Puac-adhB This work pBBR1MCS-5 Gn': board-bot-range vector CICIM-CU pBBR-PA Cm'; harboring both Ptac-pde and Ptac-adhB This work1.2培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件1.4DNA操作技術(shù)乳桿菌的培養(yǎng)采用MRS培養(yǎng)基(每升含有10gDN片段膠回收產(chǎn)物純化用華舜試劑盒進(jìn)牛肉膏,10g蛋白胨,5g酵母抽提物,20g葡萄糖,1g行質(zhì)粒DNA的提取、酶切、連接、轉(zhuǎn)化等參照文獻(xiàn)吐溫80,2gk2HPO4,5g乙酸鈉,2g檸檬酸二銨,0.2g[8]進(jìn)行。Mg4.7h20,0.055g MnSO4.H2O,pH6.2~6.5)在1.5轉(zhuǎn)化方法42℃靜置培養(yǎng)24h~48h。含1.3%瓊脂的固體MRS乳桿菌的電轉(zhuǎn)化按照文獻(xiàn)[進(jìn)行大腸桿菌培養(yǎng)基(含相應(yīng)抗生素)用于轉(zhuǎn)化子的篩選和計(jì)數(shù)。的轉(zhuǎn)化按照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。大腸桿菌的培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基(每升含有10g胰1.6酶活測定蛋白胨、5g酵母浸提物、0gNaC1),37℃下培養(yǎng)。含重子用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜,離心收集菌1.3%瓊脂的培養(yǎng)基(含相應(yīng)抗生素)用于轉(zhuǎn)化子的體,以磷酸鹽緩沖液(pH6.5)洗滌懸浮,超聲波破篩選。壁。酶活測定參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。1.3酶與試劑1.7發(fā)酵試驗(yàn).牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)、T4DNA連接酶、各以含有6.7%葡萄糖的MRS培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)種限制性內(nèi)切酶和蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)均為晶美生基,50mL三角瓶中裝液量為50mL,每瓶加入2g物工程有限公司產(chǎn)品;膠回收試劑盒為上海華瞬生CaC3發(fā)酵于42℃下進(jìn)行。發(fā)酵液中葡萄糖和乳物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。其他試劑藥品為國產(chǎn)或進(jìn)酸含量用生物傳感儀測定。乙醇濃度采用氣相色口的分析純和生化試劑。譜法測定,色譜參數(shù)為:汽化室溫度200℃,檢測器936微生物學(xué)通報(bào)2007年34(5)(D)溫度260℃,傳輸線溫度130℃。載氣壓力上,構(gòu)建ph-pdc、phy-adhphy-pa,和pbbr-pao58.8kpa,流量2mlmin;助燃?xì)饪諝饬髁?00mL/min;首先以 BamHI和Sal酶切質(zhì)粒 pEtac--pa同時(shí)回收燃?xì)釮2流量47m/min。頂空瓶平衡溫度:70℃,平Ptac-pdc(約2.3kb)和tac-adhB(約1.6kb)片段。將衡時(shí)間:30min。前者插入pHY300PLK的 BamHI位點(diǎn),得到pHYpdc;將后者插入以BamH和Sal酶切的2結(jié)果phy3pl載體,得到phy-adh;再將Ptac-pdc片2.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建段插入py-adh的 BamHI位點(diǎn),得到pHy-A(圖在本實(shí)驗(yàn)室先期構(gòu)建的質(zhì)粒 pEtac--A的基礎(chǔ)1)采用相似方法構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒pbbrpa all adh /Kan(R) Ptac BamHI mHI pEtac-PA BamH, 9.2kb pdc BamH I BamH Ic BamHI SalI Ptac-adh BamHI Ptac-udh BamHI Instrt Sal ORI ORT Plac-adh pHY-pde /AP69kb Ptac pHY-adh RamH I Haml I ori-pAMal6.4kb ori-pAMal ori-pAMal TCr OR] -adh Pac pHY-PA8.4kb ri-pAMal Cr圖】重組質(zhì)粒phy-pdc、phy -adh- pHY--pA的構(gòu)建過程2.2重組乳桿菌PDC、ADH酶活測定2.3重組菌的初步酒精發(fā)酵對重組菌中的C和ADH酶活進(jìn)行了測定挑取各重組菌及原始菌單菌落接種于10mL含(表2)。酶活測定的結(jié)果表明,pdc、adhB基因在有相應(yīng)抗生素的MRS培養(yǎng)基中,42℃靜置培養(yǎng)過夜. plantanum B0080中成功實(shí)現(xiàn)達(dá)對后,將其作為種子液,以1%(VV)接種到50mL含約. acidophilus B0068、l. amyloworus0112及其相應(yīng)6.7%葡萄糖的MRS培養(yǎng)基,其中加入了2 g CaCo,,3,重組菌進(jìn)行DC和ADH酶活測定,結(jié)果同樣表明:42℃靜止發(fā)酵。發(fā)酵6.7%葡萄糖60h:l. plantanum重組菌的C和ADH酶活均相對于其原始菌株有B0080、B0080(phy-pdc)只能產(chǎn)生約0.006%()所提高(表2),pdc、adB基因在這兩株乳桿菌中同的乙醇;重組菌B0080(phy-adh)、0080(phy-pa)分樣實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。別產(chǎn)生0.33%、0.4%(VV)乙醇(圖2)2007年34(5)微生物學(xué)通報(bào)·937表2重組菌中PDC和ADH酶活 Specific activities(U/mg) Enrymes L. plantanum L. acidophilu L.amyloworu B0080 B0080( PHY.) B0080( pHY-adh) BO080( PHY-PA) B0068 B0068( PBBR-PA) BO112 B0112( PHY-PA)DC0.15820.20380.27300.30710.38420.72680.05140.3011ad0.32300.34602.73023.31630.09880.490600.501805450.2010.00122436486001201224364860h墨12243648 thh +Lplarntarsan, -Lplantantm *pHY-pde, -o-Lpluntamum+pHY-adh,+pHY-PA圖2 Lactobacillus plantanum及重組菌的酒精發(fā)酵根據(jù)酶活測定和乙醇發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果,各重組菌3討論的PDC的酶活為原始菌的1.3~1.9倍,重組菌的乙乳桿菌能代謝多種糖類,能在較為嚴(yán)峻的環(huán)境醇產(chǎn)量和ADH酶活成正相:B0080(phy-pc)和條件下生長,是發(fā)酵產(chǎn)乙醇的合適改造選菌。但原始菌相近,只能產(chǎn)生約0.006%(VV的微量乙在乳桿菌中,代謝產(chǎn)生的大量丙酮酸都經(jīng)乳酸脫氫醇;在B0080(phy-adh)、b0080(phy-Pa)中能檢測酶(LDH;1.1.1.27)的催化而轉(zhuǎn)化為乳酸,僅有極少到約為原始菌10倍的ADH酶活,同時(shí)兩重組菌發(fā)量的乙醇經(jīng)異型乳酸發(fā)酵產(chǎn)生。將“產(chǎn)乙醇基因”酵6.7%葡萄糖60h分別產(chǎn)生0.3%、0.4%(VV)引入乳桿菌是構(gòu)建產(chǎn)乙醇的乳桿菌的主要策略。乙醇(圖2);且B0080(pHY-PA)的乙醇產(chǎn)量比本研究中三菌株的最適生長溫度約為42℃,適B0080(phy-adh)略高,說明在L. plantanum B0080于目前發(fā)酵工廠中普遍使用的發(fā)酵培養(yǎng)溫度,同中同時(shí)引入基因pdc、adhB最有效地將碳代謝流導(dǎo)時(shí),較高的發(fā)酵溫度有利于乙醇的收集亦可防止染向了產(chǎn)乙醇方向。菌;且三菌株各具特點(diǎn),具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值L. acidophilus B00068、l. amyloworus B00112發(fā)酵和使用潛力。其中菌株L. plantanum B0080分離自6.7%葡萄糖60h僅產(chǎn)生0.6×10-(V乙醇,而蔬菜發(fā)酵工廠,生長速度快,代謝旺盛。本文研究重組菌B0068(pBBr-pa)bo112(phy-A)別合了在該菌株中分別引入pdc基因和/或adhB基因成1.2×10-、1.0×10-3(VV)的乙醇。時(shí),重組菌的乙醇發(fā)酵情況。酶活測定和乙醇發(fā)酵938微生物學(xué)通報(bào)2007年34(5)試驗(yàn)結(jié)果說明:在L plantanum B0080中同時(shí)引入方面,若利用本研究所構(gòu)建的重組乳桿菌進(jìn)行乳制基因pdc、adhB最有效地將碳代謝流導(dǎo)向了產(chǎn)乙醇品單一菌種發(fā)酵,產(chǎn)生的乙醇有利于改善乳品的口方向。菌株L. amyloworus BO0112于1981年由感不至于掩蓋乳酸菌發(fā)酵的風(fēng)味,又能刺激腸胃 Nakamura報(bào)道,能夠利用多種碳源且具有生淀粉蠕動,促進(jìn)新陳代謝。降解能力;菌株L. acidophilus B0068能夠適應(yīng)酸性的培養(yǎng)環(huán)境,其最適生長pH為4.5,自身代謝產(chǎn)生參考文獻(xiàn)的乳酸不易抑制菌體生長,且較低的pH環(huán)境有利 Narendranath N V, Hynes S H. Thomas C, al. Appl Environ于該菌株的純培養(yǎng)不易染其他雜菌。將pdc基因和 Microbiol,1997,63:4158-4163adhB基因同時(shí)引入上述兩菌株:檢測到的乙醇為kl408.原始菌的2倍。我們還考察了重組菌L. amylovorus3】楊具田草1996,1:37-39B0112(H-PA)直接利用4%玉米淀粉合成乙醇的4】劉振民,駱承摩食品工業(yè)2000:21-23情況:發(fā)酵終了能檢測到0.083%(VV)的乙醇產(chǎn)[5李華丘文周廣祥中牛1:3出,而原始菌B0112僅產(chǎn)生0.6×10-3(VV)乙醇。6孫金風(fēng),徐敏,張峰,等生物學(xué)報(bào),2004(5):60本研究還發(fā)現(xiàn),重組菌的丙酮酸代謝主要還是流向產(chǎn)乳酸途徑,我們正進(jìn)一步設(shè)計(jì),在引入pdc和 7] Nakamuza L. Int J Syat Bacterial, 1981, 31: 56-63. 8 Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. Molecular Cloning: a LaboratoryadhB基因的同時(shí),利用同源重組敲除乳酸脫氫酶 Manual, Ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Pree,基因,打斷乳桿菌中由丙酮酸代謝產(chǎn)生乳酸這一主1989流代謝途徑,以期獲得乙醇高產(chǎn)重組乳桿菌。另一】 Tpompon Cllis Micobiol Methods67-7新書推介科學(xué)出版社生命科學(xué)編輯部新書推介精編蛋白質(zhì)科學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(Short Protocols in Protein Science)[美]JE.科里根等編李慎濤等譯978-703-018086-0定價(jià):120.002006年12月出版本書是《最新蛋白質(zhì)科學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》( Current Protocols in Protein Science;CPP)一書的精編版本,內(nèi)容全部取材于該書和每季度更新的服務(wù)手冊,其詳細(xì)提供了多種實(shí)驗(yàn)方案,并包含實(shí)驗(yàn)材料、步驟和每種技術(shù)的參考文獻(xiàn)等信息,可使有經(jīng)驗(yàn)的研究人員將其作為獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室指南來使用。由于蛋白質(zhì)具有多樣性,其分析也必須包括很廣范圍的結(jié)構(gòu)和理化方法,因此每個(gè)研究人員都必須盡可能多的同時(shí)掌握最新方法和傳統(tǒng)方法。本指南中既包括特定的詳細(xì)方案,也包括使方法適應(yīng)手頭特定項(xiàng)目的策略,能夠幫助讀者進(jìn)一步深人進(jìn)行蛋白質(zhì)科學(xué)和相關(guān)領(lǐng)域的研究。歡迎各界人士郵購科學(xué)出版社各類圖書(免郵費(fèi))郵購地址:100717北京東黃城根北街16號科學(xué)出版社科學(xué)分社,聯(lián)系人:阮芯聯(lián)系電話:010-6403462(帶傳真)更多精彩圖書請登陸站: http: //www. lifescience. com. cn,.com.cn,歡迎致電索要書目