遺傳繁育中國畜牧獸醫(yī)2007年第34卷第2期RNAi技術的應用王軍張以芳張曄云南農(nóng)業(yè)大學動物科學與技術學院昆明650201)摘要將雙鏈RNA導入細胞內(nèi)會引起與其同源的基因的沉默這種現(xiàn)象稱為RNA干擾( rNA interference rNai)〉作者從RNAi技術的歷史、作用機制、應用以及前景4個方面其中主要就其應用方面的研究作一綜述。關鍵詞雙鏈RNA;RNAi中圖分類號78文獻標識碼∶文章編號:671-72362007)2007603Guo等(1995)于試圖阻斷線蟲( C elegans)中這些片段可與該核酸酶的 dsRNA結合結構域結合par1基因的試驗中發(fā)現(xiàn)了一個意想不到的現(xiàn)象:并且作為模板來辨識 target mRNA;識別之后,此他們本來利用anti- sense rna技術,可達到特異性mRNA與 dsRNA sense chain發(fā)生鏈互換原先dsR阻斷par-基因的表達同時亦在其對照組試驗中,NA中的 sense chain被mRNA代替,而從 enzyme注射 sense rna到線蟲體內(nèi)預期可能觀察到此基 dsRNa complex中釋放出來,mRNA則位于原先因表達的增強。但得到的結果竟是二者都切斷了 sense chain的位置。同時此核酸酶亦在同樣位置對par-l基因的表達途徑。這與傳統(tǒng)上對anti- sense mRNA進行切割,這樣又產(chǎn)生了21~23bp長的RNA技術的解釋竟是正好相反。研究小組一直沒 dsRNA小片段再度與核酸酶形成復合物繼續(xù)對能把這個意外結果予以合理的解釋。直到1998年 target mRNA進行切割從而使目的基因沉默,無法2月華盛頓卡耐基研究院的 Andrew和馬薩諸塞大作用進而產(chǎn)生RNAi現(xiàn)象學醫(yī)學院的 craig才首次揭開這個懸疑之謎。通過2RNAi的應用大量艱苦的工作他們證實、Guo等遇到的 sense2.1高通量研究基因功能基因功能研究現(xiàn)在已RNA抑制基因表達的現(xiàn)象,以及過去的anti- sense經(jīng)明確雙鏈RNA干擾(RNAi)技術不僅可抑制體RNA技術對基因表達的阻斷都是由于體外轉錄所外細胞中特定基因的表達而且也可抑制體內(nèi)特定得的RNA中污染了微量雙鏈RNA( dsRNA)而引起基因的表達。在功能基因組研究中需要對特定基的。當他們將體外轉錄得到的單鏈RNA純化后注因進行功能喪失或降低突變以確定其功能?？梢陨渚€蟲時發(fā)現(xiàn)基因抑制效應變得十分微弱而經(jīng)過預見RNAi作為一種快速靜默基因的途徑將會越純化的雙鏈RNA卻正好相反其能夠高效特異性阻來越多地用于哺乳動物基因研究。將功能未知的基斷相應基因的表達。該小組將這一現(xiàn)象稱為RNA因的編碼區(qū)(外顯子)或啟動子區(qū),以反向重復的方T#i RNA interference RNAi)式由同一啟動子控制表達。這樣在轉基因個體內(nèi)轉隨后在短短一年中RNA現(xiàn)象被廣泛發(fā)現(xiàn)于錄出的RNA可形成 dsrnA產(chǎn)生RNA干擾使目的真菌、阿拉伯芥水螅( Lohman等1999渦蟲、錐基因沉默從而進一步研究目的基因的功能。根據(jù)蟲斑馬魚mha等2001)等多數(shù)真核生物中。這所選用序列的不同可將其分為編碼區(qū)RNA和啟種存在機制揭示了RNA很可能出現(xiàn)在生命進化的動子區(qū)RNA早期階段。隨著研究的不斷深入RNAi的機制正逐由于RNAi能高效特異的阻斷基因的表達因步被闡明同時亦成為功能基因組研究領域中的有而RNA成為研究基因功能的很好工具。 Gonczy等力工具RNAi也越來越為人們所重視(2000和 fraser氰2000)利用RNAi手段分別進行1RNAi的作用機制了這方而的學討C灬w等堅線蟲3號染色體2232當dRNA導入細胞后,可被一種dRNA特個基中國煤化工并注射到線蟲性腺異的核酸內(nèi)切酶識別切割成21~23bp的小片段內(nèi)CNMHG出現(xiàn)的異常表型結果發(fā)現(xiàn)了133個基因與細胞分裂異常有關其中104收稿日期200607-26個基因以前沒有發(fā)現(xiàn)有這種功能找到了6個與已作者簡介汪軍1982-)男江蘇人碩士生主要從事動物微通你石與免疫學方向的研究。知的與早期胚胎細胞分裂相關的基因(共7個)這個試驗結果證明了RNA方法的有效性與可靠性中國畜牧獸醫(yī)2007年第34卷第2期遺傳繁育Fraser等將線蟲1號染色體上的2416個基因?qū)罢＜毎?。隨著這一研究結果近日的公布另一個的 dsRNA構建到細菌文庫中,然后將細菌喂給線小組的研究人員正設計這一技術在世界上的第1次蟲觀察形態(tài)學的異常、性別比例的變化、不孕的情臨床試驗將在一組艾滋病患者中進行。由于雙鏈況結果將與這些表型有關的基因從70個增加到RNA干擾通過使有害的基因靜默”而奏效因而科378個。這2個研究小組的研究極大地擴展了對線學家認為可用其來靜默感染的病毒基因或已轉為惡蟲基因組中已知序列但功能未知的基因的認識同性的腫瘤細胞從而使他們變得無害。時研究提示在進化中保守的基因更傾向于具有2.4基因改造據(jù)報道英國劍橋大學分子病毒學RN蛀ⅰ相關的表型而43%具有RNAi表型的線蟲基家泰利與蘇格蘭羅斯林研究所的桑博士進行有關研因在果蠅中找到了同源序列這無疑也將為不同物究證明雞只細胞可通過注入少量基因物質(zhì)產(chǎn)生抵種中同源基因的研究工作提供重要的參考資料抗禽流感的能力。研究小組目前使用3個方法同步研究人員對該技術在植物中旳應用亦開始探索進行研究其中一種是制造細小的核糖核酸分子利其可能性。加州理工大學的 Chuang等使用此技術用RNAi技術,影響病毒的正常運作。除了H5N研究擬南芥"的AG、CLV3、 API PAN4個與開花型禽流感這種方法還可以防范其它傳給人類的禽相關的基因。結果表明:使用RNAi技術可以產(chǎn)生流感病毒例如2003年導致荷蘭一個農(nóng)場爆發(fā)疫情功能喪失或降低的突變體而其表型與以前使用其的H7型病毒,它方法鑒定的突變體類似。使用RNA原位雜交方2.5基因敲除早期,雖然傳統(tǒng)的基因敲除技術被式可表明在RNAi突變體的 target mRNA顯著降廣泛用于一些功能基因的研究但在實際應用中存在低。該結果說明RNAi技術亦可成為植物功能基因一些不容忽視的問題①它不利于在短期內(nèi)研究數(shù)量組研究中的有力工具。較多的基因若希望一次性敲除2個或多個基因?qū)?.2研究信號轉導通路由于RNAⅰ能高效特異于傳統(tǒng)的基因敲除非常困難若希望研究某一突變的阻斷基因表達,它成為研究信號傳導通路的良好致死基因在特定胚胎發(fā)育階段的功能傳統(tǒng)的基因敲工具。在線蟲體內(nèi)胰島素和受體結合后可以活化除無法滿足研究的需要因為胚胎可能在早期就因為Dsorl他是Mek的類似物, Dsorl活化后可以激活缺失此基因而死亡③3在某些制造基因敲除動物模型EekA他是ERK的類似物。用以 Sort為靶目標的分困難或因倫理學原因根本不可能進行的物種中dsRNA可以阻斷Dorl的表達雖然總的FkA表達(如大型動物及人)傳統(tǒng)的基因敲除也無法應用(陳不受影響但由于υsorl表達被抑制從而胰島素受吉剛等2004 )o RNAi可以有效地彌補傳統(tǒng)基因敲除刺激后ErkA不能活化。的上述缺點它可以在短時間內(nèi)對多個基因進行研2.3基因治療用RNAi特異性地抑制如艾滋病究。對于哺乳動物RNAi能在體外培養(yǎng)的細胞中達病毒基因、肝炎病毒基因、癌基因、癌相關基因或突到基因敲除的效果對于一些敲除后的小鼠在胚胎時變基因的過度表達使這類基因保持在靜默或休眠就會死亡的基因,可以在體外培養(yǎng)的細胞中利用狀態(tài)從而有望用這種新的手段治療各種病毒性疾RNA技術研究它的功能。 Elbashir等2001)使用21病和惡性腫瘤等疑難病癥。而腫瘤是多基因、多因 bp dsrna避免了干擾引起的細胞非特異性應激反素疾病單個癌基因的抑制往往很難達到治療效果。應實現(xiàn)了在一系列哺乳類細胞系中包括人類宮頸但RNAi技術能夠同時抑制多個不同基因而且抑癌細胞及胚胎性腎細胞系293中 dsRNA對特定基因制效果互不干擾。此外RNAi識別可以精確到一個表達的抑制作用。目前腺病毒是體內(nèi)轉基因的常用核苷酸對由野生型點突變形成的癌基因,如ras、載體Ⅻia等(2002)用腺病毒作載體在體內(nèi)和體外p53等能夠產(chǎn)生準確有效的封閉效果野生型基因表達 dsrNa并成功陽斷了基因的表達從而實現(xiàn)了則不受影響。試驗結果證明bcl-2、CDK-2、PIK-1和成體動物的基因敲除p53等腫瘤相關基因的RNAi能夠使人類宮頸癌細2.6基因表達調(diào)控 Bender等(2002)發(fā)現(xiàn)RNAi胞Hela)增生速度減慢惡性程度降低凋亡加快。在實肝瘋Hep3B)非小細胞肺癌H2頭頸部鱗狀胚胎中國煤作扮演重要角色。實驗達的改變而基因的細胞癒(C33A)骨肉瘤(U20s)及前列腺癒(LN編碼CNMH控的一種類型是染色CaP)白血病等細胞系中的試驗也發(fā)現(xiàn)類似效應。體的改變通過改變?nèi)旧w的形狀(更緊或是更此外將RNAi應用于 Wilson病等先天遺傳性疾病的松)決定那一個基因表達。但什么促進了染色體體外試驗也獲得令人滿意的成果?？茖W家采用這項形狀的改變以前并不清楚。 siRNA( small interfering技術完全清徐棼羅長在試管中的所有癌細胞而未傷RNA)在染色體形狀的改變中起著非常重要的作遺傳繁育中國畜牧獸醫(yī)2007年第34卷第2期用。這樣RNAi能永久的關閉基因表達而不僅僅是短期的抑制它。通過在發(fā)育過程中關閉或開放基參考文獻因的表達, siRNA可能指導著細胞的定向分化。I Bender J. Plant epigenetics[ J ]. Curr Biol -2002, 12( 12): 412RNAi已被證實能引導植物干細胞分化因而研究者認為RNAi也可能參與指導人的干細胞分化。由于2 Elbashir S M, Harboth J Lendeckel W,tl., Duplexes o21 nucleo-RNAi在基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要的作用對RNAitide rNAs mediate rNa interference in cultured mammalian cells微小的干擾就可能導致腫瘤的發(fā)生。J] Nature2001411(6836)a93問題與展望Fraser A G, Kamath R S Zipperlen P, et al. Functional genomic a-nalysis of C. eleans chromosome I by systematic RNA interference雖然此技術在非脊椎動物中的應用已取得一些[J]. Nature2000408(6810)325-330重要的成果但在哺乳動物中的應用才剛剛起步。4 Gonczy P Echeverri C Oegema K,eta. Functional genomic analysis在哺乳動物細胞中RNAi并不能完全阻斷基因的表of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosomelll達特別是表達異常高的基因淇次RNAi并不適應J] Nature2000A08(6810)331-336所有的基因如 dsRNA對一些在神經(jīng)細胞中發(fā)揮功Guo SKemphues K J. Par-1 a gene required for establishing polaritin C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is能的基因抑制作用不明顯湯外運載體系一直是體asymmetrical distributed[ J ]. Cell 1995 81(4)611-620內(nèi)基因治療的瓶頸如何將雙鏈RNA高效特異的轉6 ohmann J U Endl I Bosch TO. Silencing of developmental genes入體內(nèi)仍是一個難題。但RNA技術的運用對生命drtJ] Dey biol999214(1)211-~214.科學的深遠影響將不會低于PCR技術(胡迎春7 Xia H B ,Mao Q W Paulson H L et al. Si- RNA mediated gene silen-2004)RNAi技術體系的建立為人類基因功能研ing in vitro and in vivo[ J ]. Nat Biotechnol 2002, 20: 1006-1010究和疾病基因治療開辟了一個革命性的新領域。我8 Zhao Z Cao Y,LM,tal. A Double- stranded RAN injection pr們相信,該技術以其較其他多種技術的突出優(yōu)點和duces nonspecific defects in zebrafish[ J]. Dev Biol 2001 229(1)在各領域中的突出優(yōu)勢在未來將會有更多更廣闊的發(fā)展前景。The Application of RNA InterferenceWANG Jun, ZHANG Yi-fang, ZHANG YeCollege of Animal Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201 ChinaAbstract: Putting double-stranded RNA into cell could cause homologous genes silencing. This phenealled rNa interference. In this paper, the history mechanism of action application and perspective of RNA interference were summarized. Espe-cially summarized from the application of RNA interferenceKey words: double-stranded RNA RNA interference不同年齡和性別的快速生長雞氮維持需要和氮沉積潛能的研究Samadi等著劉蓓一周秋燕摘譯施壽榮校摘要本試驗是為了估測不同年齡和性別的快速生長雞毎日的氮維持需要NMR)和毎日氮沉積澘能( NDmaxt)在氮平衡試驗中用144只公雞和144母雞在4個連續(xù)的生長期做了相應的研究(Ⅰl0~25d;Ⅱ30~45d;Ⅲ50~65d;I085d)。試驗日糧由高蛋白質(zhì)大豆和氨基酸晶體作為蛋白質(zhì)來源又各設了6個梯度的蛋白質(zhì)水平(N1=6.6%N2=13.0%N3=19.6%N4=25.1%N3=31.8%N=37.6%)。通過食入氮和總氮排出量的指數(shù)函數(shù)來確定氮維持需要。氮維持需要的平均值22 emg N/BW,d)用于進一步計算NDmT即為食入到中國煤化工本試驗采用SPS.5Levenberg- Marquardt algorithm模型估測閾值相對應的得出公雞4個:CNMHG分別為359.27231702、1386mgN/BWa,d母雞的分別為3452、2604、1501、1286mgN/BN仔出的楔型李數(shù)是估測氨基酸需要的前提而估測氨基酸需要主要以氮利用指數(shù)模型為基礎再由生產(chǎn)性能和日糧氨基酸利用率而定。這個程序?qū)陔S后的文章中得到進一步的完善和應用。關鍵詞氮維持需要生長潛能氮沉積生長雞漒白質(zhì)代謝模型原載予有款據(jù)1:mc20105421-12