刑事技術(shù)2012年第6期氣相色譜法同時(shí)測定血清中甲醇、乙醇、正丙醇郝紅霞,杜然,陳新明,趙敬真2(1.中國政法大學(xué),證據(jù)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京10040;2.公安部物證鑒定中心,北京100038)摘要:目的建立氣相色譜同時(shí)測定血清中甲醇、乙醇、正丙醇含量的方法。方法改變氣相色譜條件,以異戊醇為內(nèi)標(biāo),采用氣相色譜氫火焰離子化檢測器對血清直接進(jìn)行檢測。并通過待測組分與內(nèi)標(biāo)物的響應(yīng)值比進(jìn)行定量。結(jié)果GC/FID法檢測血清中的甲醇、乙醇、正丙醇含量,得到了良好的線性關(guān)系。乙醇濃度從1~100mg/100mL的線性關(guān)系式為Y=0.4145X+0.0232(R2=0.9974)、濃度從100~100mg/100mL的線性關(guān)系式為Y=0.4511X+0.0746(R2=0.991),甲醇濃度從1~200mg/100mL的線性關(guān)系式為Y=0.2778X+00493(R2=0.9983)。結(jié)論該方法操作簡便快速,重現(xiàn)性妤,通過檢測正丙醇還可以推斷腐敗血樣自身產(chǎn)生的乙醇量,是一種較為理想的血醇檢測方法。關(guān)鍵詞:甲醇;乙醇;正丙醇;血清;測定中圖分類號:DF795.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1008-3650(2012)06-000805Simultaneous determination of methanol, ethanol and propanol in blood by GC/FIDHAO Hong-xia, DU Ran, Chen Xin-ming, et al. (Key Laboratory of Evidence Science(CUPL), Ministry of education, Beijing 100088, ChinaABSTRACT: Objective To develop a method for simultaneous determination of methanol, ethanol and propanol in blood byGas Chromatography. Methods Conditions of gas chromatography were optimized and then blood serum samples were analyzedquantitatively by GC/FID. Results Linear relations of ethanol were Y=0. 4145X+ 0. 0232(R2=0. 9974)for the concentrationranged from 1 to 100mg/100mL and Y=0.4511X+0. 0746(R2=0. 9911)for the concentration ranged from 100 to 1000mg/100mL Linear relation of methanol was Y=0. 2778x-+0. 0493(R2=0. 9983)for the concentration ranged from 1 to 200mg/100mL. Conclusion This method can be applied in clinical diagnosis of poisoning and forensic analysis of alcohol in blood.KEY WORDS: Methanol; Ethanol; Propanol; Serum; Detection乙醇(分子式C2HO)俗稱酒精,是酒的主要成上2。以BAC值作為酒后駕駛和醉酒程度的判定分,乙醇進(jìn)入空胃后,可于3min~90min內(nèi)在胃及依據(jù),已廣泛為交警等執(zhí)法部門采用并被多個(gè)省市納腸道內(nèi)被完全吸收人血,15min~9omin內(nèi),血液中酒道路安全地方性標(biāo)準(zhǔn)。早期由于科技不發(fā)達(dá),采用精濃度值( blood alcohol concentration,BAC)可達(dá)的多是化學(xué)法23進(jìn)行檢測,隨之迅猛發(fā)展的是氣相到峰值凵]。其代謝主要是在肝臟內(nèi)被氧化分解,少色譜法,有頂空氣相色譜法,標(biāo)準(zhǔn)曲線色譜法),部分以原形經(jīng)呼吸道、尿、汗直接排出體外。過量飲直接進(jìn)樣色譜法012,酶檢測法31,分析儀器檢測用含酒精類飲料不僅可引起心腦血管、消化、神經(jīng)系法等。本文建立的氣相色譜同時(shí)測定血清中甲統(tǒng)等多種病癥,還可致駕駛員酒后動作失常、判斷思醇、乙醇、正丙醇含量的方法,是一種較為理想的血醇維能力下降,成為誘發(fā)道路交通事故的主要原因之檢測方法報(bào)道如下。據(jù)相關(guān)部門統(tǒng)計(jì)2001年中國酒后駕車造成的死1材料和方法亡人數(shù)占到了道路交通事故總死亡人數(shù)的30%以l1儀器TP2100氣相色譜儀,配有火焰離子化檢測器和基金項(xiàng)目:中國政法大學(xué)青年教師學(xué)術(shù)(創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目;中國色譜數(shù)據(jù)工作站。政法大學(xué)省部級合作項(xiàng)目(№201123210044,2011-23211191.2試劑作者簡介:郝紅霞(1976—),女,內(nèi)蒙古人,博士,主要從事毒空白抗凝血,甲醇、乙醇、正丙醇、異戊醇(內(nèi)標(biāo))物分析工作。儲備液配制,所用標(biāo)準(zhǔn)均為優(yōu)級純,采用重蒸餾水或Tel:010-68645052:E-mail;haohx(@126.com去離子水。刑事技術(shù)2012年第6期1.3色譜條件表1甲醇、乙醇混標(biāo)系列色譜柱: DM-WAX30m X025m×0.2m彈單祖標(biāo)種關(guān)甲靜標(biāo)液4mm性石英毛細(xì)柱。加標(biāo)液0.250.751.25752.252.50進(jìn)樣口溫200℃,檢測器溫FID220℃,柱溫95℃體積(mL)(5min)→5/min→110c(omin)→30℃/min→220℃(0.5~1min),載氣高純N299.999呈現(xiàn)濃度0.20.61.01.41.82.0(mg/mL)柱流速lmL/min,恒壓,分流比10:1,尾吹氣混標(biāo)種類乙醇標(biāo)液2.0mg/mL29mL/min;H230mL/min;空氣300mL/minl.4儲備液配置加標(biāo)液0.250.751.251,7體積(mL)用移液器分別準(zhǔn)確吸取無水甲醇1.26mL、(相對密度0.7913)無水乙醇1.26mL(相對密度0.7893)呈現(xiàn)濃度0.10.20.40.60.81.0正丙醇1.240mL(相對密度0.8037)于50mL容量瓶(mg/mL)中,異戊醇1.230mL(相對密度0.8110)于250mL容量瓶中,用重蒸水稀釋至刻度,混勻,分別得濃度為(4)各標(biāo)準(zhǔn)系列儀器分析試樣制備:準(zhǔn)確吸取各20.0mg/mL的甲醇、乙醇、正丙醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液,標(biāo)準(zhǔn)系列200L,加0.4mg/mL異戊醇內(nèi)標(biāo)液80uL4.0mg/mL異戊醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液,置4C冰箱保存(可混勻,備檢做標(biāo)準(zhǔn)曲線保存1年)。1.6.2乙醇1~10mg/mL和正丙醇0.8~4mg/mL1.5醇混標(biāo)溶液的配制混標(biāo)系列(1)乙醇和正丙醇單標(biāo)液準(zhǔn)備:直接用1.5.1甲醇、乙醇、正丙醇泥標(biāo)液準(zhǔn)確吸取甲醇20mg/mL·乙醇單標(biāo)儲備液和20mg/mL正丙醇單標(biāo)儲液1.。mnL,乙醇儲液1.omnL,正丙醇儲液儲備液配制。0.50mL同于10mL容量瓶中,加去離子水至刻度混2)混標(biāo)系列配制:取5mL的容量瓶6個(gè),從低勻,即得甲醇2.0mg、乙醇2.0mg、正丙醇1.0mg/mL濃度到高濃度編號后備用。分別取乙醇20mg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用期3個(gè)月。臨用時(shí)將該混標(biāo)液和正內(nèi)醇20mg/mL單標(biāo)儲備液一定量于系列容量按比例稀釋10倍后,得濃度甲醇0.2mg、乙醇瓶中,最后加去離子水至刻度混勻后備用。各系列濃0.2mg、正丙醇0.1mg/mL混標(biāo)液,供儀器的定性分度所用乙醇和正丙醇單標(biāo)液見表2。析用。表2乙醇、正丙醇混標(biāo)系列1.5.2含內(nèi)標(biāo)異戊醇的醇混標(biāo)液準(zhǔn)確吸取混標(biāo)種類乙醇標(biāo)液20mg/mL4.0mg/mL異戊醇儲備液1.0mL于10mL容量瓶加標(biāo)液0.250.751.251.752.2中,加去離子水至刻度,混勻后得0.4mg/mL異戊醇體積(mt)內(nèi)標(biāo)液(使用期1個(gè)月)。準(zhǔn)確吸取甲醇0.2mg、乙醇0.2mg、正丙醇0.1mg/mL混標(biāo)液200μL,加0.4mg/系列濃度1.02.04.06.08.010.0(rmg/mL)mL。異戊醇內(nèi)標(biāo)液800μL混勻獲得。本混標(biāo)液供考查儀器的穩(wěn)定性和靈敏度使用,臨用時(shí)配制混標(biāo)種類正丙醇標(biāo)液20mg/mL1.6定量曲線標(biāo)液系列的配制加標(biāo)液0.200.400.600.800.901.001.6.1甲酶0.2-2.0m/mL和乙醇0.1-1.0mg/mL體積(mL)混合標(biāo)準(zhǔn)系列(1)甲醇、乙醇單一標(biāo)準(zhǔn)液:準(zhǔn)確量取系列濃度0.801.602.403.203.604.00甲醇、乙醇儲備液一定量,用去離子水稀釋后獲得甲mgm)醇4.0mg/mL和乙醇2.0mg/mL的備單標(biāo)液。(2)混標(biāo)系列配制:取5mL的容量瓶6個(gè),從低(3)0.4mg/mL異戊醇內(nèi)標(biāo)液:配制方法見1.6.1。濃度到高濃度編號后備用。分別吸甲醇4.0mg/mL(4)各標(biāo)準(zhǔn)系列儀器分析試樣制備:準(zhǔn)確吸取各和乙醇2.0mg/mL單標(biāo)液各一定量于系列容量瓶標(biāo)準(zhǔn)系列2001L,加0.4mg/mL異戊醇內(nèi)標(biāo)液800L中,最后用去離子水至刻度混勻后備用,各系列濃度混勻,備標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。所需甲醇、乙醇單標(biāo)液體積見表1。l.7檢血試樣的制備(3)0.4mg/mL異戊醇內(nèi)標(biāo)液:取4.0mg/mL異1.7.1檢血取送檢血樣1~2mL,于3000/min下戊醇儲備液一定量稀釋10倍獲得,臨用時(shí)稀釋。離心5min,上清液備用。刑事技術(shù)2012年第6期l.7.2配樣準(zhǔn)確吸取檢血離心5min后的上清液中乙醇的濃度(mg/mL)。200μL于1~2mL的試管中,加0.4mg/mL異戊醇內(nèi)相對相差計(jì)算公式如下標(biāo)液800μL,混勻后供儀器分析。每一個(gè)檢材必須配制2~3份試樣,求各試樣的定量數(shù)據(jù)的平均值作為相對相差(%)=⊥C-C2×100檢材的定量值。式中:C1、C2為兩份檢材平行定量結(jié)果,C為兩1.73空白血添加乙醇試樣的制備取加過抗凝劑份檢材平行定量結(jié)果的平均值,即:C=C的空白血4.0mL,加人20mg/mL乙醇儲備液1.omL,輕搖混勻30min以上得血中乙醇濃度3結(jié)果與討論4.0mg/mL添加標(biāo)準(zhǔn)血樣。取該血樣一定量配制成3.1線性關(guān)系0.20,0.50,0.80mg/mL乙醇濃度血樣各標(biāo)準(zhǔn)的保留時(shí)間參考值及定量曲線見表3及取上述0.2,0.5,0.8mg/mL乙醇濃度血樣于圖1~圖4。乙醇的定量限為0.10mg/mL300/min離心5min,上清液取200L,加入800L表3各醇在GC/FID上的Rt值(0.4mg/mL)異戊醇內(nèi)標(biāo)液混勻供儀器分析,以準(zhǔn)確序號藥物名稱保留時(shí)間(Rt值,min)定量檢材中乙醇用量。添加血試樣必須做2份以上甲醇4.90重復(fù),以保證定量數(shù)穩(wěn)定。乙醇5.072方法2.1進(jìn)樣異丙醇8.20設(shè)定乙醇優(yōu)化后的分析條件,待儀器處在 Ready狀態(tài)時(shí),連續(xù)進(jìn)樣乙醇02mg、甲醇0.2mg、正丙醇0.1mg/mL混標(biāo)液,考查儀器靈敏度狀態(tài)和穩(wěn)定性,一般進(jìn)行3~4次重復(fù)考量。之后再以乙醇0.5mg、甲醇0.5mg、正丙醇0.2mg/mL混標(biāo)液200L,加入800L0.4mg/mL異戊醇內(nèi)標(biāo)液混勻制成的試樣,進(jìn)樣3~4次,依各醇與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值是否一致考查儀器的穩(wěn)定狀態(tài)。2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作當(dāng)儀器處于優(yōu)化后的最佳狀態(tài)時(shí),將配制好的標(biāo)準(zhǔn)系列依次分析,每次進(jìn)樣1L,每個(gè)試樣進(jìn)樣2~3LL次,以甲醇、乙醇、正丙醇各自濃度下的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的平均值為縱坐標(biāo),以繪制該醇的濃度為圖14種醇的分GC/FID分離圖橫坐標(biāo),繪制各定量醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.3檢材血樣分析2.3.1定性和粗定量儀器在優(yōu)化穩(wěn)定狀態(tài),取檢Y=04145x+00232血試樣1L進(jìn)樣,每個(gè)試樣進(jìn)樣2~3次。計(jì)算檢血s中可疑組分的Rt值平均值,與標(biāo)準(zhǔn)的Rt值作比較以Rt值的一致性定性。求出檢血中乙醇與內(nèi)標(biāo)物異戊醇的峰面積比值平均值,查曲線計(jì)算出檢血中乙醇的濃度。其他甲醇或正丙醇含量依次類推。2.3.2準(zhǔn)確定量根據(jù)查標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的檢血中乙04醇的濃度,配制相應(yīng)濃度的添加血樣后制成儀器分析濃度(mg/m)試樣,再經(jīng)儀器分析、統(tǒng)計(jì),計(jì)算得出檢血中乙醇的標(biāo)圖2低濃度乙醇的定量曲線準(zhǔn)定量數(shù)據(jù)。23.3定量計(jì)算公式W乙=A檢/A×C標(biāo),式中:3.2定性定量結(jié)果判定W乙為檢血中乙醇的濃度(mg/mL),A幽指檢血中乙3.2.1定性(1)檢血中未見乙醇或甲醇的色譜峰,醇與內(nèi)標(biāo)異戊醇的峰面積比值,A指空白添加血中而見內(nèi)標(biāo)物的色譜峰,而且內(nèi)標(biāo)物的色譜峰的峰面積乙醇與內(nèi)標(biāo)異戊醇的峰面積比值,C標(biāo)為空白添加血值與往常相近,說明儀器狀態(tài)正常,可判定檢血中不刑事技術(shù)2012年第6期2份檢材試樣定量數(shù)據(jù)的相對相差不得超過10%,定y04511x·00746量結(jié)果的報(bào)出以2份試樣定量數(shù)據(jù)平均值為準(zhǔn)。超過10%相對相差的定量結(jié)果不準(zhǔn)確,需重新定量。(2)本方法采用血樣直接進(jìn)樣方法檢驗(yàn)甲醇和乙醇,因此,必須考慮送檢血樣是否加抗凝劑。加入抗凝劑的檢材血樣可以直接報(bào)告定量結(jié)果。未加抗凝劑的檢血樣定量結(jié)果代表著檢血中血清中的血醇濃濃度(mgmL)度,不能代表全血的濃度。根據(jù)人體中血清占全血的圖3高濃度乙醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線比例約在60%左右,因此報(bào)出血醇定量結(jié)果應(yīng)在定量數(shù)據(jù)上乘以80%的系數(shù),使血醇的濃度更加接近全血濃度3.3腐敗血中乙醇的判定y=02718x+00493(1)血液腐敗可生成乙醇,因此在測定腐敗血時(shí)積04注意:腐敗血生成乙醇的同時(shí),也平行的生成正丙醇,值03因此檢血中檢出乙醇,而未檢出正丙醇者,此時(shí)檢出的乙醇可以認(rèn)為非血液腐敗產(chǎn)生的乙醇(2)腐敗血液中檢出乙醇的同時(shí),也檢出正丙醇,此時(shí)對血液中乙醇含量評判為:第一,血液中乙醇的含量在正丙醇含量的20倍以下,此時(shí)應(yīng)考慮為血中圖4甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線乙醇由腐敗而產(chǎn)生,判為陰性。第二,血中乙醇的含量高于正丙醇含量20倍以上,此時(shí)則認(rèn)為血中乙醇由血液腐敗和非血液腐敗兩部分組成,非血液腐敗的y=05161x*00175=0.963乙醇含量計(jì)算,可將檢出乙醇的濃度值減去相當(dāng)202倍正丙醇濃度的乙醇濃度值,余下值則是血中乙醇濃度的下限值3.4定量結(jié)果的不確定度中國交通法規(guī)給出20mg/mL酒后駕車和80mg/mL醉酒駕車的評判閾值。因此當(dāng)定量結(jié)果血中濃度為0.2mg/mL和0.8mg/mL附近值時(shí),必須濃度(mg/mL)給出定量結(jié)果的不確定度值。所以,在收到檢測血醇圖5正丙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線含量的檢材后應(yīng)立即實(shí)施檢驗(yàn),以保證血中乙醇含量檢測的真實(shí)性。含甲醇或乙醇成分。(2)以異戊醇為內(nèi)標(biāo)計(jì)算色譜3.5實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證結(jié)果評價(jià)峰的相對保留時(shí)間,與乙醇或甲醇對內(nèi)標(biāo)物異戊醇的本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)連續(xù)兩年參加酒精的實(shí)驗(yàn)室能力相對保留時(shí)間比較,誤差小于2%時(shí),可以確定檢材驗(yàn)證活動,均取得滿意的評價(jià)。能力驗(yàn)證( Proficient中含乙醇或甲醇;大于2%時(shí)不可認(rèn)定。(3)如果檢 cy Testing)是利用實(shí)驗(yàn)室間比對來判定實(shí)驗(yàn)室和檢血試樣中未出現(xiàn)內(nèi)標(biāo)物色譜峰或峰面積值不近似于查機(jī)構(gòu)能力的活動,也是認(rèn)可機(jī)構(gòu)加入和維持國際相往常,檢驗(yàn)結(jié)果無效應(yīng)檢查原因,重新檢驗(yàn)。(4)本方互承認(rèn)協(xié)議(MRA)的必要條件之一。以2011年為法檢測血液中檢出限:甲醇、乙醇均為0.05mg/mL,檢例,能力驗(yàn)證提供方提供兩個(gè)待測血樣,要求對血液材中乙醇含量低于10mg/100L時(shí),建議不給出定中的乙醇含量進(jìn)行檢測。依照上述方法,本實(shí)驗(yàn)室就性定量數(shù)據(jù),檢驗(yàn)結(jié)果判為陰性。兩個(gè)待測組分進(jìn)行檢測,并監(jiān)控正丙醇的含量,以確3.2.2定量(1)檢材血應(yīng)平行制樣,測2份以上,保精確的測量乙醇,得到驗(yàn)證方的反饋結(jié)果見表4刑事技術(shù)2012年第6期表4實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證結(jié)果評價(jià)樣品編號測試實(shí)驗(yàn)室結(jié)果中位值樣品均值與中位值實(shí)驗(yàn)室間實(shí)驗(yàn)室內(nèi)(mg/mL)(mg/mL)相對偏差(%)z比分?jǐn)?shù)(ZB)z比分?jǐn)?shù)(zw)樣品1測試1測試2平均值樣品2測試18.000.14測試20.23綜合評價(jià):樣品1和樣品2的實(shí)驗(yàn)室間z比分?jǐn)?shù)(ZB)和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)z比分?jǐn)?shù)(ZW)絕對值均小于等于2,且測試數(shù)據(jù)平均值與中位的相對偏差絕對值小于等于10%綜合評價(jià)結(jié)果:滿意參考文獻(xiàn)hy with direct on-column injection [J. 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