第21卷第2期生物學(xué)雜志Vol.21 No.22004 年4月JOURNAL OF BIOLOGYApr ,2004文章編號: 1008 - 9632(2004)02 - 0020- 03聚乙二醇修飾重組人生長激素的初步研究王榮海' ,魏練平2 ,戎隆富',宋禮華'(1.安徽省生物研究所,合肥230088;2.安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,合肥230039)摘要:目的探討聚 乙二醇(MW20kD)修飾重組人生長激素(GH)的反應(yīng)條件以及修飾產(chǎn)物的純化方法。方法在不同條件下,將聚乙二醇活性酯與hGH反應(yīng),以單個PEG- GH的比例為指標(biāo),用SDS- PACE和薄層掃描方法,確定其在反應(yīng)產(chǎn)物中所占的比例;采用CM - Sepharose F離子交換和Sephacry IS- 200分子篩凝膠層析法對修飾產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。結(jié)果聚乙二醇修 飾rhGH的反應(yīng)條件為pH8.0、rbGH與聚乙二醇的比例1:2(mg:mg)反應(yīng)時(shí)間2.0h;反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)兩步純化,所得的單個PEG- GH純度大于95%。結(jié)論初步確定了 聚乙二醇修飾hCH的反應(yīng)條件和修飾產(chǎn)物的純化方法。關(guān)鍵詞:重組人生長激素(hGH);聚乙二醇(MW20kD);化學(xué)修飾中圖分類號:Q575*11文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A重組人生長激素(hCH)具有調(diào)節(jié)代謝、刺激蛋白所);DYY- I型電泳儀(北京六一儀器廠);薄層掃描質(zhì)合成和加速脂肪降解等生理功能,能促進(jìn)骨骼和肌儀( Phamacia Biotech公司產(chǎn)品);LC - 10AD高效液相肉組織的生長發(fā)育,是目前治療兒童因內(nèi)源性生長激色譜(島津公司產(chǎn)品)。素缺乏或不足導(dǎo)致的身材矮小的特效藥。又因能促1.2 方法進(jìn)傷口的愈合,也用于損傷、嚴(yán)重?zé)齻闹委熀屯饪?.2.1單甲 氧基聚乙二醇( mPEG, MW20kD)活性酯手術(shù)中。由于它是蛋白質(zhì),受體液中酶的隆解和腎臟的合成及性質(zhì)鑒定活性酯的合 成按文獻(xiàn)方法進(jìn)的排泄,在體循環(huán)中半衰期較短,需要長期注射才能行[2-3] ,最終產(chǎn)物經(jīng)冷凍干燥保存。采用紅外光譜法維持療效。聚乙二醇(PEG)是一種無毒、無免疫原性和核磁共振('H - NMR, CDCl3)法測定PEG活性酯中的水溶性高分子物質(zhì),可以通過共價(jià)結(jié)合方式修飾蛋相關(guān)基團(tuán)的特征吸收峰。另取mPEG活性酯0. 5mg,白質(zhì),延長蛋白質(zhì)分子在體內(nèi)循環(huán)半衰期。利用低分溶于200μ1超純水中,用分子篩HPLC鑒定產(chǎn)物純度,子量的PEG( MW5kD)修飾rhGH已有文獻(xiàn)報(bào)道[1],本檢測波長為254nm。研究采用分子量為20kD的PEG修飾tGH,進(jìn)行了，1.2.2 PEG 修飾rhGH反應(yīng)pH的篩選取 rhGH凍PEG活性酯合成、修飾條件篩選、修飾產(chǎn)物分離純化干粉,分別用20mml.L-1 pH6.0,7.0,8.0,9.0的磷酸等研究。鹽緩沖液,按hCH: PEG = 1:2(mg: mg)比例加入PEG1材料與方法活性酯,室溫反應(yīng)2.0h。取樣作SDS - PAGE(濃縮膠1.1 材料5% ,分離膠15%),考馬斯亮藍(lán)#R-250染色。電泳tCH半成品,濃度為9.5mgml-' ,經(jīng)冷凍干燥后保膠用薄層掃描儀掃描。存?zhèn)溆?安徽安科生物工程股份有限公司產(chǎn)品;單甲1.2.3.修飾反應(yīng)時(shí)間的篩選取thGH凍干粉,溶于氧基聚乙二醇( mPEG, MW20kD)購于Sigma公司;CM20mmol. L-',pH8.0 PB溶液中,按rhGH: PEG= 1:2- Sepharose FF和Sephacryl S- 200為Phammacia 公司(mg:mg)的比例加入PEG活性酯,室溫反應(yīng),反應(yīng)時(shí)產(chǎn)品。.間分別為0.5,1.0,1.5,2.0,4.0h,每個時(shí)間點(diǎn)取樣,8823A-紫外檢測儀(北京市新技術(shù)應(yīng)用研究立即用冰乙酸終止反應(yīng),作SDS- PAGE,染色,電泳膠中國煤化工收稿日期:2003- 12-05作者簡介:王榮海,男.副研究員,碩士研究生導(dǎo)師。MHCNMHG基金項(xiàng)目:2001 ~ 2002年度安徽省優(yōu)秀青年科技基金資助(編號26)20第21卷第2期生物學(xué)雜志Vol.21 No.22004 年4月JOURNAL OF BIOLOGYApr,2004用薄層掃描儀掃描。的PBS,收集洗脫峰, SDS - PAGE鑒定。1.2.4 PEG 活性酯投料比的篩選取rhCH凍干粉1.2.6 純化產(chǎn)物的純度檢定 用SDS - PACE法進(jìn)溶于20mmol. L-',pH8.0 PB溶液中,按hGH: PEG活行,電泳膠用薄層掃描儀掃描。性酯(mg:mg)分別為1:0.5,1:1,1:2,1:3,1:4,1:6,1:2結(jié)果8,1:10的比例投料,室溫反應(yīng),反應(yīng)時(shí)間2.Oh,冰乙2.1 PEG 活性酯的合成酸終止反應(yīng),作SDS - PAGE,染色,電泳膠用薄層掃描合成的PEG活性酯,經(jīng)紅外光譜測定,有如下特儀掃描。征峰:1934(C= 0,琥珀酰亞胺);1734(C=0,羧基);. 1.2.5 修飾產(chǎn)物的純化 按選定的反應(yīng)條件,將1112(CH20CH2);經(jīng)核磁共振光譜('H - NMR, CDCI3)PEG活性酯與thGH室溫反應(yīng),用冰乙酸終止反應(yīng),反測定,有如下特征峰:4.2(m, 4H, CH20CH2);3. 61(s, .應(yīng)液用20mmol. L-', pH5.0的NaAC- HAc緩沖液稀- 500H, PEG);2.58(s, 8H, CH2C=0),可以確定合成釋1倍,上CM-SepharoseFF柱,將柱充分平衡洗滌的PEG活性酯為ss - PEG,即單甲氧基聚乙二醇琥珀后,用250mmol. L-I NaC, NaAC - HAC pH5.0緩沖液酰亞胺琥珀酸酯。PEG活性酯經(jīng)分子篩HPLC鑒定，洗脫,收集洗脫峰,濃縮。濃縮液上Sephacryl S- 200為單一峰,未見其它雜峰。柱,柱體積2.6 x 100cm,流動相為20mmol.L-1 ,pH7.42.2修飾反應(yīng)的條件KD97.466●662一43.043031.05291--20.12011234567團(tuán)1不同pH條件對PEC修飾tICH的影響圍2不同反應(yīng)時(shí)間對PEC修飾dGH的影響Fig# 1.Non.rdhued SDS-PAGE(15% I pruliles ter uhCHFg# 2,Ner rdued SDS PAGE(15%) preilea for d.CHmodibed by PEG略diferen pHmolifed by PEC t difee macticn time1.p19.0 2.pH8.0 3.pH7.01. sandard marker 2.MCH 3.0.5h4.pl6.0 S.ICH 6.standarde murker4.1.0h 5.1.5h 6.2.0h 7.4.0h97414412345678923圖3不同PEG投料比PEG修飾hGH的影響圄4 mPEG CH純度檢定Fig# 3.Non-reduced SDS-PACE(15%) proiles for hCHmodifed by PEG a dferent mss ratioesFig# 4. Reducedl SDS-PAGE(15% ) profiles for purified mPEC-GH1. rhGH 2.1:0.5 3.1:1 4.1:2 5.1:31. standard manker 2. rhGH 3. mPEG-CH.1:4 7.1;6 8.1:8 9.1:10在本實(shí)驗(yàn)條件下,PEG與hCH發(fā)生反應(yīng)后的產(chǎn)接-中國煤化工帶及相對分子質(zhì)量大物,經(jīng)SDS - PAGE,主要出現(xiàn)分子質(zhì)量22kD的未修飾于5HCNM H G條帶。其中分子質(zhì)量的rhGH條帶、相對分子質(zhì)量57kD每個hGH分子連57KD的單個PEG - GH為研究的目標(biāo)產(chǎn)物。在選定21第21卷第2期生物學(xué)雜志Vol.21 No.22004年4月. JOURNAL OF BIOLOGYApr,2004修飾反應(yīng)條件時(shí),以單個PEG-GH在修飾產(chǎn)物中所(見圖4)。占的比例高低作為指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果表明，在pH6. 0, .3討論.7.0,8.0,9.0的條件下,單個PEG - CH所占的比例分rhGH在臨床上主要用于治療兒童因內(nèi)源性CH別為17. 9%、36.2% .46.0%、22.8%。其中以pH8.0缺乏所導(dǎo)致的身材矮小癥。由于在體內(nèi)的半衰期短,時(shí)PEG-GH所占的比例最高。當(dāng)pH為9.0時(shí),修飾為了達(dá)到療效,需要每日注射,一個療程需要注射180效率和單個PEG - GH所占的比例下降(見圖1)。反次,患兒非常痛苦。利用PEG對其進(jìn)行修飾,可以延應(yīng)時(shí)間從0.5,1.0,1.5,2.0,4.0h,單個PEG- GH所長體內(nèi)半衰期。有研究表明,在分子質(zhì)量15KD至占的比例分別為36. 8%、40.2%、43. 0%、45. 9%、70KD的范圍內(nèi),腎臟清除小分子蛋白質(zhì)的速率與相39.0%。反應(yīng)時(shí)間2.Oh時(shí),單個PEG-GH所占的比.對分子質(zhì)量大小呈負(fù)相關(guān)[4]。隨著用于修飾的PEG例最高。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于2.0h時(shí),單個PEG - GH在.的增大,蛋白質(zhì)分子通過腎臟的排泄減少,在體內(nèi)的整個修飾產(chǎn)物中所占的比例下降,分子質(zhì)量大于半衰期延長。為此,我們采用20KD的PEG對rhCH57KD的多個PEG - CH的比例增加(見圖2)。PEG活進(jìn)行修飾。性酯的投料比對修飾反應(yīng)影響較為顯著,在hGH:利用20KD的mPEG,合成ss - PEG修飾rhGH, 當(dāng)PEG活性酯(mg:mg)的投料比1:0.5,1:1,1:2,1:3,1:pH值為9.0時(shí),修飾效率和目標(biāo)產(chǎn)物的比例下降明4,1:6,1;8,1:10的情況下，單個PEG- GH所占的比顯,這主要是ss - PEG活性酯在高pH的情況下易產(chǎn)例分別為30. 1%、42.4%、46.2%、44. 9%、43.4%、生降解所致。我們另發(fā)現(xiàn),將純化的單個PEG - GH40.5%、41.4%、35.2% ,多個PEG - GH的比例分別為的pH調(diào)至9.0時(shí),原來連接于rhCH上的PEG會分解3.6%、7.2%、15. 0%、16. 3%、17. 2%、20. 0%、脫落。PEG與CH的投料比對反應(yīng)的影響最為顯著,18.8%、19.4% ,投料比為1:2時(shí),單PEG- GH所占的隨著PEG量的增加,修飾比例增高,當(dāng)投料比超過1:比例最高(%) ,隨著PEG量的增加，單個PEG- GH所2時(shí),多個PEG - CH增加非常明顯,這為后一步產(chǎn)物占的比例增加降低,多個PEG-GH的量則增加明顯的純化會帶來困難。在純化進(jìn)程中,由于PEG為線性(見圖3)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇rhGH: PEG活性酯分子,而rhGH為球形分子,當(dāng)兩者共價(jià)結(jié)合形成PEG(mg:mg)的投料比1:2, pH8.0,反應(yīng)時(shí)間2.0h作為-GH后,行為發(fā)生了改變,使修飾產(chǎn)物的分離變得困PEG修飾hCH的反應(yīng)條件。難。2.3修飾產(chǎn) 物的純化根據(jù)選定的條件,用PEG活性酯對rhGH進(jìn)行修參考文獻(xiàn):飾,終止反應(yīng),修飾產(chǎn)物稀釋后上CM - Sepharose FF[1] Ross C, Kenneth 0, Germaine F. Long acting growth hormones離子交換柱,其中未反應(yīng)的PEG和部分多個PEG -produced by conjugation with polyethylene gycol [J].J BiolChem, 1996,271 :21969.GH不被吸附而在穿柱中出現(xiàn)。經(jīng)過洗滌平衡后可以[2]Zalipsky s,Gilon C, Zilkha A. Attachment of dnugs to polyethylene將未反應(yīng)的PEG完全除去。用250mmol. L-1 NaCl,glycols[J]. Eur Palym J, 1983, 19:1177.NaAC-HAc洗脫,所出現(xiàn)的洗脫峰中,主要成分為單[3]Kodera Y, Matsushima A, Hiroto M, et al. Regulation of proteins個PEC-GH,另有少量多個PEG-GH和未反應(yīng)的and bioactive substances for medical and technical applicationGH。將此洗脫產(chǎn)物濃縮后,SephacrylS-200分子篩[J].J Prog polymer Sai;1998,23:1233.柱,可以除去多個PEG - GH和未反應(yīng)的CH。收集的[4] Feency RE. Chemical mdifcation of proteins: comments and主峰,經(jīng)SDS- PAGE檢定,顯示單一條帶,即單個perspectives[J]. Int Pep Prolein Res ,1987 ,29:145.PEG - GH。電泳膠用薄層掃描儀掃描,純度大于95%[5]田泫 ,姚文兵,吳梧棚,等.對干擾素a- 2b的初步化學(xué)修飾研究[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2000,31(1):74.Chemical modification of rhGH with activated polyethlene glycolWANG Rong-hail , WEI Lian-ping2 ,R中國煤化工i-hua'(1. Anhui Biological Institute, Hefei,2300CNMH G .2. School of Life Science, Anhui University, sdcs ,2wJJ , cuis,uiua,(下轉(zhuǎn)27頁)22第21卷第2期生物學(xué)雜志Vol.21 No.22004年4月JOURNAL OF BIOLOGYApr,2004MSCs;(3)用細(xì)胞刮收集細(xì)胞時(shí)可以直接挑選,得到的參考文獻(xiàn):MSCs純度高;(4)純化后的培養(yǎng)中加人- -定量生長因[1] Friedenstein AJ, Chailakhyan RK, Gerasimov UV. Bone marow子是必要的,否則會有一個緩慢的增殖期。osteogenic stem cells: inviro culivation and transplantation indifusion chambers[J]. Cell Tissue Kinet, 1987 ,20;263 ~ 272.到目前為止,MSCs還沒有特別的鑒定方法,主要[2]路艷蒙,傅文玉,樸英杰.大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)[].解根據(jù)其形態(tài)特點(diǎn)和貼壁特點(diǎn)鑒別。我們采用上述方法,所得MSCs貼附于培養(yǎng)皿度,細(xì)胞呈梭形,似成纖剖學(xué)雜志,000,23:160[3]Huang sC, Chen NJ,Hsich sL, e al. lsolation and characterization維樣細(xì)胞,培養(yǎng)的MSCs可進(jìn)行消化、傳代和凍存。of size sieved stem cells from human bone marow[J]. Stem cellsMSCs體外培養(yǎng)可自然分化為成骨細(xì)胞。由于2002;20:249 ~ 258.MSCs常作為-種實(shí)驗(yàn)工具,維持其長期增殖而不自[4] Deryugina E, Mulr-Sieburg CE. Stromal cells in longem然分化是很必要的,這方面的工作我們正在進(jìn)- -步 的cultures: keys to the elucidation of hematopoietic development研究中。[J].Cit Rev lmmunol, 1993, 13,115~ 150.Preparation and culture of murine bone marrow stromal stem cdllsRUAN Xu-zhil CHEN Xia-ping2 YAN Shi- rong' W ang Wei-min2(1.The Biology Teaching and Research Office, Yunyang Medical College , Shiyan, 442000;2. Intiute ofLife Science, Yunyang Medical College Attached Tai-He Hospital, Shiyan, 442000; 3. The BiochemistryTeaching and Research Office, Yunyang Medical College, Shiyan, 42000, Hubei ,China)Abstract: A method for isolating and culturing mouse bone marrow-detived mesenchymal stem cells ( mMSCs) wereestablished. MSCs were isolated from mouse thighbone marrow and cultured in Dulbecco' s modifed eagle' s medium with lowglucose and purified by wllsticking and colonies collection, and were prolferated through subculuring by adding epidermalgrowth factor (EGF) and pletelet-derived growth factor( PDGF - BB) .Cellular proliferation were observed and recorded underthe inverted microscope. Puifed MSCs were acquired and became fibroblast-like. EGF and PDCF-BB were efective agentsfor mMSCs proliferation in vitro.Key words: murine ; bone marrow stromal; stem cells; cell culture.(上接22頁)Abstract: The optimal reaction conditin of modifying hGH by activated polyethylene glycol (PEC) with relativemolecular weights of 20kD and the separation methods of the reaction mixture were studied . rhGH was modified with activatedPEG under various conditions, the ratio of mono-mPET-GH was determined by SDS-PAEG and thin layer scanning. Thereaction mixture was purified by ion- exchange and molecular size exclusion chromatography . The optimal reaction was pH8.0,1:2 for the mass ratio of rhGHand PEG, two hours for reaction time was selected. The punity of mono mPEG-GH isolated byion-exchange and molecular size exclusion chromatography was higher than95% .Key words: rhGH; polyethylene glycol( MW20kD) ; chemical moldifcation中國煤化工MYHCNMHG27