第27謄第8期吳麓清等:丹寧_秦乙二醇法提取纖維崠酶的研究4:丹寧_聚乙二醇法提取纖維素酶的研究吳慧清黃小茉李劍英吳清平(廣東省微生物研究所,廣州, 510070)摘要木幕經(jīng)圃態(tài)發(fā)醇剿成纖維素霹濕曲,按曲水體積比1:5加入40匯去離子水,保溫60min后,過濾獲得粗纖維素瞬液。在廊話為FPasee 22.6w/mL的稀酶液中,加入丹寧至5.0g/L時(shí),粗解液中纖維素酶接近完全沉淀下來,將沉淀分敝于pH4.6的0.1mol/L檸襟酸綆沖液中,加入分子質(zhì)量為6000u的聚乙二醇(PEG)至丹寧含量的1.6-4.0倍,障活回收率達(dá)到210%~245%，可將纖維素獬濃縮7~8倍。PEG對(duì)纖維素酶有教活作用,采用丹寧作為纖維素脾的沉淀劑,PEG可將纖維素睥從酶~丹寧復(fù)合物中解析出來。丹寧、PEG的用量與降液中的蛋白質(zhì)含量有關(guān),PEG超過解析酶用量的一定范圍,因熬合纖維素廨使酶活回收率超過100%,過多PEG會(huì)使系統(tǒng)發(fā)生相改變,從而使降失活,使得霹活回收率急劇降低。關(guān)鍵詞纖維素酶丹寧藁乙二醇提取法丹寧是一種多酚類物質(zhì)!"),能與蛋白質(zhì)丹寧酸(簡(jiǎn)稱丹寧):分析純,中國(guó)遵義市結(jié)合生成不落于水的復(fù)合物。在找到一種將第二化工廠,貴州;聚乙二醇(PEG):分子質(zhì)酶或蛋白質(zhì)從這種復(fù)合物中解析出來的方法量8000 u、6000u,進(jìn)口分裝;羧甲基纖維素以前,丹寧對(duì)酶來說是一種失活劑。因此丹鈉(CMC):上海長(zhǎng)虹塑料廠產(chǎn)品，粘度(pH .寧沉淀法作為酶的提取方法，- -直未能獲得6.1)0.3~0.6Pa.s; 濾紙:新華1號(hào)定性濾大規(guī)模的工業(yè)應(yīng)用。后來,人們找到了幾種紙;纖維素酶曲:木霉菌種,經(jīng)固態(tài)發(fā)酵制成。將酶從丹寧與酶的復(fù)合物中解析出來的物1.2 纖維素酶活力的測(cè)定質(zhì),這些物質(zhì)主要為聚乙二醇(PEG)、聚乙烯纖維素酶活力單位定義為:60 min水解氮戊酮(PVP)、聚氧化乙烯或山梨糖醇的甘生成1 mg葡萄糖的酶量為1個(gè)活力單位。油油酸酶(POE.S. M0)或硬脂酸(POE.S.1.2.1羧甲基纖維素 酶(CMCase)活力測(cè)MS)[2],這為丹寧沉淀法的工業(yè)應(yīng)用開辟道定[12,13]路。用丹寧沉淀法制備的酶制劑不含鹽,純?nèi)〈郎y(cè)稀釋酶液0.5 mL,加入5g/L度高,不但符合食用的要求,而且可以作為口CMC溶液1.5mL,50七酶解30min,加入3服藥用廊制劑[3),亦可用于紡織加工和發(fā)酵mL DNS試劑(43],佛水浴10min,在波長(zhǎng)530工業(yè)等[4~9]。迄今為止,丹寧沉淀法已用于nm比色測(cè)定還原糖的含量。a-淀粉酶、酸性蛋白酶、糖化酶、脂肪酶、果膠. 1.2.2 濾紙耪酶(FPase)活力測(cè)定[4,5]酶等水解酶的提取,但酶活損失大[3.10]。本.1 mL稀釋的待測(cè)酶液，加入0.05 mol/L研究在利用丹寧沉淀纖維素酶后,采用聚乙pH4.6的檸檬酸緩沖液1mL和1條1cmX6二酵解析和激活纖維素酶,可以有效地提取cm新華 1號(hào)濾紙, 50C酶解60 min,加入3粗酶液中的纖維素酶。mLDNS試劑,沸水浴10min,在波長(zhǎng)530nm比色測(cè)定還原糖的含量,扣除空白后計(jì)算酶1材料和方法活力。1.1材料1.3制備濃縮液態(tài)纖維素酶制劑的工藝過第一作者:碩士,工程種。收藕時(shí)間:2000- 11 - 20,改回時(shí)間2001 -04-06中國(guó)煤化工MYHCNMHG42食品與發(fā)酵工業(yè)Food and Fermentation Industries Vol.27 No.82.2丹寧酸對(duì)纖維素酶的沉淀作用將固態(tài)的纖維素酶浸提液經(jīng)壓榨或離心取6份100mL經(jīng)浸提離心后FPase為制得粗酶液,加丹寧酸將酶沉淀下來,離心，22.6u/mL的稀酶液，按稀酶液量加入1.0,棄去上清液,將沉淀用介質(zhì)將其分散,加入適2.0,3.0,4.0及5.0g/L的丹寧酸，攪拌后,量的解析劑,攪拌均勻,作用-定時(shí)間后,離在室溫下放置3h,離心，收集上清液和沉淀心,收集上清液,加防腐劑、穩(wěn)定劑，制得濃縮物,測(cè)量上清液中的酶活力。結(jié)果表明,當(dāng)?shù)ひ后w酶制劑。寧加量達(dá)到5.0 g/L時(shí),粗酶液中纖維素酶幾乎可以完全沉淀下來(表2)。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果喪2丹寧加對(duì)纖緒素制沉淀的影響2.1纖維素酶浸提工藝參數(shù)測(cè)定 .丹寧加量/L- 01.0 2.0 3.0_ 4.0 5.0稱取120g含水量在500~ 700 g/kg纖上清被酶活.8 13.5 6.3 2.5 0.5 0.0曲3份,分別按曲水體積比為1:3、1:5、1:7Pse/u*mL.-I加入40C無離子水,于40七水浴中保溫602.3解析過程中介質(zhì)的選擇min,另取同量的濕曲，按1:5的比例加入室在解析實(shí)驗(yàn)中選擇pH4.6的0.1 mol/L溫下(16C )的冷水，于室溫下提取60 min,作檸檬酸緩沖液、純水、0.1 mol/L碳酸鈉溶液為對(duì)照。選擇1:5的曲水比,40C提酶溫度作為分散介質(zhì)。結(jié)果表明:(1)以pH4.6的做為提酶工藝參數(shù)(表1)。若提酶材料為干0.1 mol/L檸楝酸縵沖溶液和純水為分散介曲粉,則應(yīng)加大水與曲的比例1:9~10。質(zhì)效果較好,說明了酶解析試驗(yàn)適合在中性表1不同加水比例和浸提溫度對(duì)提酗 效果的影響和弱酸性介質(zhì)中進(jìn)行。(2)聚乙二醇的分子曲水體職比:31:51:授提溫度/心401質(zhì)量為6000~ 8000 u,對(duì)酶解析試驗(yàn)中的酶壓祚后酶體積/mL.9050880 65得率影響不大(表3)。.FPe/u"mL-I20.44 13.99 10.99 11.42.4聚乙二酵對(duì)纖維素酶沉淀的解析作用總FPae/u7971.6 9093.5 9671.2 7410.0取6份550mLFPase為22.6u/mL的過程撅失Pe/so-812.5 +309.4 +887.1 -137.4FPae損失/x10~-9.3 +3.5 +10.09 -15.6稀酶液,加入5.0g/L丹寧,攪拌,離心后,將注: 120g曲總FPRs為8784.1u。.獲得的沉淀物用分散介質(zhì)分散,按稀酶液量加入1~8g/L分子質(zhì)量為6000u的PEG,賽3分散介質(zhì)對(duì)酶解析的影響丹寧加量PEG分子PEG加t分散介質(zhì)酶液總體積儂墉酶液酶活力/g.L"1質(zhì)量/u/g.L-1(酸、堿依度0.1 mo/L)/mL_FPase/u. ml" 18000檸楝酸鹱沖液01156000檸據(jù)膠縵沖榷02155擰檁膠媛沖液001918碳酸鈉溶液攪拌,于冰箱中放置過夜,離心,收集上清酶體纖維素酶,加質(zhì)量百分含量為0. 5%的丹液,測(cè)定其FP酶活力。試驗(yàn)表明隨著PEG寧于4C冰箱過夜沉淀,于10000r/min, 4C用量的增加,濃縮酶液中酶活增加,并且具有冷凍離心10 min,收集沉淀,加4 mL純水分-種較強(qiáng)的激活趨勢(shì)(表4,圖1)。散,加不同量PEG6000于4C冰箱解析過2.5增加 PEG用北對(duì)纖維素酶解析效果的夜,第2天采用轉(zhuǎn)速10000 r/min, 4C冷凍影響.離心10min,收集濃縮液并補(bǔ)充純水至體積取10份40mLFPase為38.0u/mL液均為7.5mL,測(cè)量FPase酶活。中國(guó)煤化工HCNMH G第27卷第8期吳慧清等;丹寧.秦乙二醇法提取纖維隸酶的研究43表4解析劑聚乙二醉用量對(duì)纖維素酶解析效果8PEG加量/g:L10廊液體積/ml507477.酶活力/um156.0203.0219.8258.7391.3總FPese/u2430748111 5441502216 2651914328 956FPsxe 損失事/X 10-2-39.8-7.13+20.8+ 30.8+54.0+ 132.9酶活得事/x10~260.192.9120.8130.8154.0232.9依編倍數(shù)/倍_7.47.4出某一數(shù)值(本試驗(yàn)中為1:4)時(shí),纖維素酶的回收率急劇降低(表5,圖2)。年150r00 ts 200PEG的用量/gL'100圖1 PEG 對(duì)丹寧酶復(fù)合物的解析效果試驗(yàn)表明,當(dāng)PEG和丹寧的比值在-PEG和amion的比值定范圍內(nèi)增加時(shí),纖維素酶的回收率增大,超圖2增加PEG對(duì)PEG-丹寧的解析效果裹5增加PEC對(duì)纖維素酶的解析效果PEG: tnnin1:11:1.61:3:41:FPrse/u*mL-11718814426172143112總FPse/u13351410235515912901072.584冀活得率/%87.392.8154.9210.255.32.6 PEG 對(duì)纖維素酶的激活作用2.7丹寧用和PEG用的相關(guān)性取6份10 mL FPase為38.0u/mL的液體取800 mL FPase 為22.6 u/mL的稀釋纖維素酶，分別加入0,0.25,0.5.1.0和3.0%酶液 4份,分別加4,5,6,8g/L的丹寧(按稀PEG6000(w/ v)測(cè)定其酶活(結(jié)果見表6)。釋酶液體積比加),攪拌并離心后,獲得的沉表6 PEG 對(duì)纖維素酶的激活作用淀物在分散介質(zhì)中再加與丹寧等量的PEG/90.25 0.5 1.0 3.0PEG6000解析,另外,取3份550 mL上述稀FPse3844.8 50.1 50.3 50.8酶液,加丹寧至5g/L攪拌離心后，獲得的沉/u.mL" 1淀物在分散介質(zhì)中再分別加4、5、8g/L的數(shù)據(jù)分析:幾次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間有一些差PEG6000解析,離心后，收集上清酶液,并測(cè)異,這是由于用于提酶的纖維素酶原液其蛋定其FPase活力。白含量不一致。丹寧、PEG和蛋白質(zhì)含量之表5結(jié)果表明,同樣的稀酶液,用相同的間應(yīng)還存在一種相關(guān)性,即蛋白質(zhì)含量大,用丹寧沉淀,不同量的PEG解析,隨著PEG的于解析的PEG需要的越多。PEG 在一定濃用量增加,得率也增大。另外,丹寧增加，度范圍內(nèi)可激活纖維素酶,但溶液中的PEGPEG不變時(shí),酶的得率減少，因此PEG用量含量太多時(shí)會(huì)使系統(tǒng)發(fā)生變化,使酶失活。和丹寧用量之間存在- - 種相關(guān)性。中國(guó)煤化工MHCNMHG444食品與發(fā)酵工業(yè)Food and Fermentation IndustriesVol.27 No.8表7丹寧用和PEG用的相關(guān)性丹寧加量PEG加量依酶掖體積_ 依廊液騰活/umL1 總 FPase酶活得率 依編倍數(shù) 原始廊液/g*L-1/g*L~1/mL_CMCaseFPase/u_1f/mL99174427420248.5177.11753317880800257104211166259.724602136x931 600303.8300766611 480156.812230985512 376219.817144385507818900391.3。30521注:稀騰液的房活，F(xiàn)Pue 22.6u/mL,體積800mL,總FPase為18080 uo若體積為550 mL,總FPase為12 430 uo參考文獻(xiàn)3討論1邱嫣巴洛夫T.K.著,徐德祥譯.植物鞣質(zhì)化學(xué)基礎(chǔ)(25).北京;科學(xué)出版社, 1960丹寧提取法用于制備纖維素酶制劑既濃2小林時(shí)夫. 日特公昭41 - 7833, 1966縮了酶液，同時(shí),在提取過程中不但沒有損失3張樹政主編.酶制劑工業(yè).北京:科學(xué)出版酶活,反而能徼活酶活。聚乙二醇既是解析社, 19844顧貸芳,卞殿明. 食品科學(xué), 1998, 19(7):27劑,同時(shí)也是酶的激活劑。該法比鹽析法簡(jiǎn)~305 Capek P etal. Int. J. Biol. Macromolecules,單,得率更高,且不含鹽,不用經(jīng)脫鹽處理。1995, 17(6),337~40因此,應(yīng)用此法制備纖維素酶較鹽析法有效。6 Kobayashi T et al . Macromolecules, 1996, 29丹寧沉淀法中丹寧用量,受酶液中蛋白(7),2698 ~2700質(zhì)含量、種類及pH等因素的影響,試驗(yàn)時(shí)應(yīng)7林開江,阮麗娟.王農(nóng)英.生物技術(shù)。1996,6(3):45~48當(dāng)根據(jù)實(shí)際測(cè)繪的沉淀曲線來決定其添加8賀志勇.印染, 1992, 18(3):40~42量。此外,利用丹寧沉淀纖維素酶,采用秦乙9莊梅芳,宗復(fù).印染，1993, 19(5):22~2510 陳駒聲主編,胡學(xué)智編.酶制劑生產(chǎn)技術(shù),二醇做解析劑的酶濃縮法,也有美中不足之北京:化學(xué)工業(yè)出版社.1994處。聚乙二醇將酶從丹寧-酶復(fù)合物中置換11張海,馮成刊等. 標(biāo)準(zhǔn)化報(bào)道, 1995, 16出來時(shí)，生成樹脂狀的復(fù)合物,附著在容器壁(4):37~38,44? Mandels M et al. Biotechnol. Bioeng.上,較難除去,雖可用洗潔精或酒精洗滌,但Symo. , 1976, (6):17如果能找到- -種解析劑避免形成這種樹脂狀13蔣傳葵等.工具酶活力測(cè)定. 上海:上?？茖W(xué)出版社, 1982. 82~87的物質(zhì),將會(huì)更好。Cellulase Extraction Using Tannin-PEG MethodWu Huiqing Huang Xiaomo Li Jianying Wu Qingping( Guangdong Institute of Microbiology, Guangzhou, 510070)ABSTRACT Cellulase was extracted from the solid state culture medium in which a strain ofTrichoderma was grown. After the culture medium was steeped in 40C ion-free water for 60minutes , the crude cellulase liquid was made by filtering the steeper, when the content of tanninin the enzyme liquid up to 5.0 g/L and the enzyme - tannin compound was dispersed in pH 4.6citrate buffer, cellulase could be liberated by putting PEG 6000 into the suspension, the enzymerecovery rate reached 245 percentage and the ellulase was concentrated 7~ 8 times. The experi-mental results proved that PEG had an activation to cellulase , if tannin was used as a precipitatorduring cellulase extraction, PEG could liberate the enzyme from the enzyme - tannin compound .The content needed of tannin and PEG was relative to the protein quantity in the liquor . Whenthe content of PEG exceeded the amount needed to liberate the enzyme, to some extent, the cel-lulase could be activated. If PEG s amount was too much it would make cellulase inactivated be-cause the system had been changed.Key words cllulase, tannin, polyethylene glycol, extraction method中國(guó)煤化工HCNMHG