西北植物學(xué)報2001,21(6):1142- 1146Acta Bot. Boreal. -Occident. Sin.文章編號:1000-4025- (2001)06- 1142-05聚乙二醇(PEG)對杜仲胚乳愈傷組織莖芽分化的影響朱登云,蔣金火,田慧琴,李浚明(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院,北京100094)商要:實驗中發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)基中加入適量PEG可以顯著提高杜仲胚乳愈傷組織分化頻率。PEG這種促進分化的效果既與PEG的分子量和所用的濃度有關(guān),也與培養(yǎng)基中無機離子的.強度和蔗糖濃度有關(guān)。效果最佳的培養(yǎng)基配方是:在激素組成為BA(2.0~2.75 mg/L)+NAA 0. 15 mg/L)的基本培養(yǎng)基(MS無機鹽+Bs有機物+ 3%蔗糖)中,添加濃度為4%~6%PEG4000或4%~5%PEG6000。在這種培養(yǎng)基上杜仲胚乳愈傷組織的分化頻率均超過50%，最高可達70%以上,而在同樣的條件下不加PEG時分化頻率不到10%。然而,經(jīng)PEG處理分化出來的胚乳再生植株中,部分苗玻璃化現(xiàn)象嚴重。關(guān)鍵詞:杜仲;聚乙二醇;愈傷組織分化中圖分類號:Q943.35文獻標識碼:AThe effect of polyethylene glycol (PEG) on shoot redifferen-tiation of endosperm-derived callus in Eucommia ulmoidesZHU Deng- yun,JIANG Jin-huo,TIAN Hui-qin,LI Jun- ming(College of Biological Science ,China Agricultural University ，Beijing 100094 ,China)Abstract:It was found in the present study that redifferentiation frequency of callus inE. ulmoides could be raised remarkably by adding an appropriate concentration of PEG inthe basal medium. In doing so,what's worth particular attention was as follows:the ef-fect of PEG on promoting shoot redifferentiation was closely related to the molecularweight of PEG ,and the concentration o中國煤化工was also related to thestrength of inorganic ions ,and the conce:TYHCNMHGmedium. The most ef-fective recipe of basal medium was MS inorganic salt十Bs organic supplements + 3% su-crose ,with phytohormones being BA (2. 0~2.75 mg/L)+NAA (0. 15 mg/L) and with。收稿日期2994-21;修改稿收到日期:2001-08-12基金項自?國家然科學(xué)基金資助項目的-部分(39570463)。作者簡介:朱登云(1962- ),男(漢族),副教授,博士。6期朱登云等:聚乙二醇(PEG)對杜仲胚乳愈傷組織莖芽分化的影響11434%~6% PEG 4 000 or 4%~5% PEG 6 000 added in. In such a medium,over 50% ofshoot redifferentiation frequency was achieved , while under the same condition exceptfor the absence of PEG,the frequency turned out to be less than 10%. Unfortunately,many of shoots redifferentiation on the PEG-containing medium suffered from vitrifica-tion,the solution to which is under our investigation.Key words : Eucommia ulmoides ;polyethylene glycol (PEG) ;shoot redifferentiation杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)是我國特有的經(jīng)濟林樹種，也是最具開發(fā)前景的溫帶膠源植物。其樹皮、樹葉、果實所含的杜仲膠具有廣闊的工業(yè)開發(fā)前景1。然而,由于作為主要提膠器官的葉片含膠量低,直接限制了杜仲膠的開發(fā)利用。因此,通過遺傳改良以提高杜仲單株產(chǎn)葉量及葉片含膠量已成為當(dāng)務(wù)之急。胚乳培養(yǎng)是建立杜仲三倍體新類型的一條值得探索的育種途徑2。迄今為止,雖然由杜仲成熟干胚乳和未成熟胚乳培養(yǎng)都已獲得完整再生植株,并已移栽成活[2.3]。但胚乳愈傷組織分化頻率低,特別是正常苗的分化頻率極低(0.01%~0.1%),且分化所需時間長。因此,如何提高胚乳愈傷組織的分化頻率,縮短分化所需時間,以獲得數(shù)量較多且倍性穩(wěn)定的胚乳再生植株,是杜仲三倍體育種中亟待解決的問題。研究發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)基中加入適量的聚乙二醇(PEG)可以顯著提高杜仲胚乳愈傷組織的分化頻率。PEG是一種惰性的高分子聚合物,分子式為HOCH2(CH2 OCH2)nCH2OH。聚合程.度不同,則分子量也不同。在組織培養(yǎng)中應(yīng)用較多的是PEG 4 000和PEG 6 000;與一些小分子滲壓劑如蔗糖和甘露醇相比,PEG的最大特點是本身不能穿越細胞壁進入細胞質(zhì),因而不會引起質(zhì)壁分離,使植物組織和細胞處于類似干旱的水分脅迫之中4]。PEG的這一特性被廣泛應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)的若干領(lǐng)域,如抗旱突變體的篩選[5]、通過對外植體的預(yù)處理以提高愈傷組織誘導(dǎo)頻率[6.7]、促進愈傷組織生長[8]、促進胚狀體的發(fā)生和成熟[9~13],以及提高試管苗移栽成活率[14~16]等。但利用PEG促進愈傷組織不定芽分化的研.究還未見報道。1材料與方法1.1材料杜仲成熟干胚乳愈傷組織,其來源見朱登云等以前的報道[2]。中國煤化工1.2培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件所用的基本培養(yǎng)基(BM)為MS無MYHCN M H Gp酵母浸提物(YE)800mg/L和蔗糖30 g/L,用瓊脂7 g/L固化,在高溫滅菌前將pH調(diào)至5.8。培養(yǎng)條件:培養(yǎng)室溫度25C士2C ,光照時間16 h/d,光照強度1 000~1 500 lx。1.3愈傷組絹鮑翁化將愈傷組織培養(yǎng)于補加BA(1.2 mg/L)和NAA(O.15 mg/L)的基本培養(yǎng)基中繼代1144西北植物學(xué)抵21卷增殖21 d后，再將其切成小塊,轉(zhuǎn)接到含有BA(2. 0~2.75 mg/L)和NAA(0.15 mg/L)以及不同濃度PEG的培養(yǎng)基上。每項處理接種愈傷組織98~256塊,30d后統(tǒng)計各處理愈傷組織的分化頻率。2結(jié)果鑒于培養(yǎng)基的滲透壓是影響愈傷組織生長和分化的重要因素之一。在實驗初期,為了通過增加滲透壓以達到提高分化頻率的目的，曾在激素組成為BA(2. 0~2.75 mg/L)和NAA(O.15 mg/L),蔗糖濃度為3%的分化培養(yǎng)基中再添加3%~9%的葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇等小分子滲壓劑以及提高培養(yǎng)基中的瓊脂濃度,但皆無助于分化頻率的提高。特別是添加甘露醇或山梨醇后,愈傷組織的生長受到嚴重抑制,導(dǎo)致大量愈傷褐化死亡。然而,在進一步的實驗中卻發(fā)現(xiàn),在激素組成不變的情況下,添加一定濃度的PEG,可使分化頻率由原來的不足10%驟增到70%以上(圖1);但PEG的這種促進分化的作用受以下幾個因素的影響。。對照(CK)PEG處理(PEG treatment )圖1分化培養(yǎng)基中添加6%PEG4000后顯著提高了杜仲胚乳愈傷組織的分化頻率Fig. 1 The redifferentiation frequency of endosperm- derived callus in E. ulmoidesraised remarkably by adding 6% PEG 4 000 in the redifferentiation medium2.1PEG濃度和分子量對其促進分化作用的影響PEG促進莖芽分化的效果與培養(yǎng)基中國煤化工有關(guān)。濃度過低,效果不YHCNMHG明顯;濃度過高,引起培養(yǎng)基不凝固并造n..nn。PEG 6 000的濃度超過6%或PEG4000的濃度超過10%時,培養(yǎng)基就不能凝固。圖2表示在BM+BA(2.0mg/L)+NAA(0.15mg/L)的培養(yǎng)基中添加不同濃度和不同分子量的PEG對分化頻率的影響。在相同朐激秦組合中,未加PEG的培養(yǎng)基中分化頻率不超過6%(未包括在圖2內(nèi))。6期朱登云等:聚乙二醇(PEG)對杜仲胚乳愈傷組織莖芽分化的影響.114520006000ol40007.8PEG%圖2PEG的濃度和分子量對杜仲胚乳愈傷組織分化頻率的影響Fig.2 The effect of concentration and the molecular weight of PEG on redifferentiationof endosperm- derived callus in E. ulmoides由圖2可看出,PEG在2.0%~7.5%的濃度范圍內(nèi),PEG 4 000和PEG 6 000的效果明顯優(yōu)于PEG 2 000。培養(yǎng)基中添加濃度為4. 0%~6.0%的PEG 4 000 或濃度為4.0%~5.0%的PEG 6 000效果最好,分化頻率均高于50%,最高可達70%~80%,且同一塊愈傷組織上出現(xiàn)1個以上莖芽分化。2.2培養(yǎng)基中無機離子強度和培養(yǎng)基中蔗糖濃度對PEG促進分化效果的影響表1所列結(jié)果表明,PEG促進胚乳愈傷組織分化的效果與培養(yǎng)基中無機離子強度和蔗糖濃度有一定的關(guān)系。降低基本培養(yǎng)基中的無機離子強度或提高其中的蔗糖濃度,則PEG促進分化的效果亦隨之下降。表1培養(yǎng)基中無機離子強度和蔗糖濃度對PEG效果的影響'Table 1 The influence of the strength of inorganic ions and the concentrationof sucrose in the medium on PEG effect莖芽分化數(shù)愈傷分化頻率%.處理愈傷組織數(shù)No. ofRedifferentiationTreatmentsNo. of calliredifferentiationfrequency %3/4MS無機鹽+Bs有機物+3%蔗糖3/4 MS inorganic salts + B: organic compo-985556. 1nents十3% sucrose1/2MS無機鹽+Bs有機物+3%蔗糖1/2 MS inorganie salts + Bs organic compo-33. 7中國煤化工BM+3%蔗糖(對照)65.3BM+ 3% sucrose (control)MYHCNMHGBM+ 4%蔗糖BM+ 4% sucrose3232.7BM+5%蔗糖BM+5%sucrose!821.4*激素組成:BA(2.75 mg/L)+NAA(O.15 mg/L),添加5% PEG 4 000。綜上秀繡凝飲實驗結(jié)果證實,PEG確有促進杜仲胚乳愈傷組織分化的效果,尤其是當(dāng)以MS無機鹽+B。有機物+3.0%蔗糖為基本培養(yǎng)基、激素組成為BA(2. 0~1146西北植物學(xué)抵21卷2.75 mg/L)+NAA(0. 15 mg/L),添加4.0%~6.0% PEG 4 000或4.0%~5.0% PEG6 000的效果最顯著,分化頻率均高于50%,最高可達70%以上。然而,經(jīng)PEG處理分化出來的胚乳再生植株中,部分苗玻璃化現(xiàn)象嚴重,這-問題正在進一步研究之中。3.討論PEG作為一種高分子滲壓劑，會對愈傷組織細胞的生長和分化產(chǎn)生深刻的影響。在本研究中,PEG不僅具有促進分化的作用,而且還能刺激細胞生長,使愈傷組織生長速度加快,并改善其狀態(tài)。這與Bressan等8]在番茄組織培養(yǎng)研究中報道的結(jié)果相似。但同為滲壓劑的甘露醇、山梨醇等表現(xiàn)為對愈傷組織強烈的抑制作用,并造成愈傷組織大量死亡。造成這種現(xiàn)象的原因,目前還不清楚。另據(jù)報道,在一些裸子植物中,PEG是通過改變培養(yǎng)基的水勢,使培養(yǎng)物處于水分脅迫狀態(tài)來促進胚狀體的成熟,而且用其它小分子滲壓劑如蔗糖、甘露醇等或外源ABA代替PEG,也具有這種效果[17~19]。但在我們的研究中發(fā)現(xiàn),無論添加外源ABA或添加低分子滲壓劑都不能提高分化頻率?？梢奝EG促進愈傷組織分化和促進胚狀體成熟的機制不同,這一問題有待進一步研究。參考文獻:[1] 嚴瑞芳.杜仲膠研究新進展[].化學(xué)通報,1991,47;1-6.[2]朱登云,蔣金火,裴德清,等.由杜仲成熟干種子胚乳培養(yǎng)再生完整植株[].科學(xué)通報,1997,42(5):560-561.[3]朱登云,蔣金火,田慧琴.等.杜仲未成熟胚乳愈傷組織的誘導(dǎo)和植株再生[J].中國學(xué)術(shù)期刊文摘，1998.4(3);381-382.[4] ATREE S M.FOWKE L C. Embryogeny of gymnosperms :advances in synthetic seed technology of conifers[J]. Plant ell,Tissueand Organ Culture.1993.35:1-35.[5] LEUSTEK T.KIRBY E G. Seletion and physiology of cell cultures of douglas fir grown under conditions of water stess[J]. TreePhysiol, 1990,6:317-327.[6]潘向群,梁海曼.PEG浸種對成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J].植物生理學(xué)通訊,1990.2:31-33.[7]趙穎,華慧青,梁海曼.PEG礦質(zhì)元素和低溫對大麥無菌生長及葉片切段愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報,1993,9(1):14-19.[8] BRESSAN R A.HASEGAWA P M,HANDA A K. Resistance of culture higher plant cells to polyethylene glycol induced waterstress[J]. Plant Science Letters, 1981,21:23- 30.[9] ATTREE s M, M0ORE D, SAWHNEY ,et al. Enhanced maturaion and desiccation tolerance of white spruce [Picea glauca(Moench) Voss ] somatic embryos effect of a non- plasmolysing water stress and abscisic acid[J]. Annals of Botany,1991 ,68:519-[10] GRUBOR K I,ATTREE S M.FOWKE L C. Induction of microspore -derived embryos of Brossica napus L. with polyethlene gly-col (PEG) as osmoticum in a low sucrose medium[J]. Plant Cell Reports,1998,17:329- 333[11] ATTRESS S M,POMEROY M K ,FOWKE L C. Development of white spruce [Pieea glauca (Moench) Voss] somatic embryosduring culture with abscisic acid and osmoticum,and their tolerance to drying and frozen storage[J]. Journal of ExperimentalBotany ,1995.46:433-439.[12] BROWN C ,BR00KS F J,PEARSON D,et al. Control of embryogenesis and organogenesis in immature wheat embryo cllus us-ing increased medium osmolarity and abscisic acid[J]. J Plant Physiol,1989,133:727-733. .[13] DENCHEV P,VELCHEVA M,ATANASSOV A. A new approach to direct embryogenesis in Medicago[J]. Plant Cell Reports,1991, 10;338 -341.[14] ZAID A,HUGHES H. Water loss and polyethylene glycol mediated aclimatization of in viro: grown seedlings of 5 cultivars ofdate palm (Phonix dactifera L. ) plantlets[J]. Plant中國煤化工，[15] DAMI I.HUGHES H. Leaf anatomy and water losse[J]。 Plant ell,Tissue and OrganCulture,1995,42:179-184. .THCN M HG,[16] IMED D.HARRISON G H. Effects of PEG induced waer sressu tm vuru uaueeig vI Valiant' grape[J]. Plant Cell Tsseand Organ Culture.1997.47:97-101.[17] KONG L.YEUNG E C. Efect of silver nitrate and polyethylene glycol on white spruce (Picea glauca) somatic embryo develop-ment :enhancing cotyledonary embryo formation and endogenous ABA content[J]. Physiologia Plantarum,1995 .93: 298- 304.[18] MISRA S,ATTREE S M,LEAL I,et al. Elfct of abscisic acid ,osmoticum and desication on synthesis of storage protein duringthe develeprente,wyhite spruce somatic embryos[J]. Annals of Botany,1993,71.1122.[19] XU N F,胞.對質(zhì)C, BEWLEY J D. Abscisic acid and osmoticum prevent germination of devloping alfalfa embryos . but onlyosmoticum maintains the synthesis of developmental proteins[J]. Planta, 1990, 182 :382- 390.