中外醫(yī)療漂EGN MEDICAL TREATM∈NT基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)RNAi功能及應(yīng)用0林健澤李振字(南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市第二人民醫(yī)院脊柱外科廣東深圳518035)【摘要】RNA干涉( RNA interference,RNAi)是將雙鏈RNA( dsRNA)導(dǎo)入蛔胞引起特異基因mRNA降解的一種蛔胞反應(yīng)過(guò)程,它是轉(zhuǎn)錄后蕙因沉默(PIGS的一種這一過(guò)程已經(jīng)在包括擬南芥線蟲(chóng)和真菌等多種模式生物中得到揭示RNA具有高效性和高度特異性,在維持基因蛆穩(wěn)定基因表達(dá)調(diào)控保護(hù)基因蛆竟受外源橄酸侵入等方面發(fā)揮重要生物學(xué)作用。RNAi作為基因沉默的一個(gè)工具,RNAi作為基因沉默的一個(gè)工具,已被廣泛用于基因功能研究基因治療和新藥研究與開(kāi)發(fā)等方面【關(guān)鍵詞】RNA干涉小干涉RNA基因沉默【中圖分類號(hào)】Q421:R338文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1674-0742(2009)03(c)-0012-03RNAi研究的歷史過(guò)程等用 dsRNA轉(zhuǎn)染未經(jīng) dsRNA處理過(guò)的果蠅胚胎細(xì)胞的提取物,1990年, Jorgensen和Mol領(lǐng)導(dǎo)的研究小組在研究牽牛花合成全程監(jiān)測(cè)在這一無(wú)細(xì)胞體系中以放射標(biāo)記的 dsRNA和mRNA變色素基因時(shí),偶然發(fā)現(xiàn)在向牽?；ㄞD(zhuǎn)導(dǎo)色素合成基因時(shí),不僅是化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),不論mRNA是否存在, dsRNa都被分解成21轉(zhuǎn)入的基因未表達(dá),而且自身的色素合成也減弱了。相似的現(xiàn)象23nt的小片斷,而且不論標(biāo)記 dsRNA的正義鏈或反義鏈,都可檢還發(fā)生在真菌的研究中,當(dāng)把合成類胡蘿卜素的基因轉(zhuǎn)入到紅色測(cè)到這些小分子RNA的存在,說(shuō)明 dsRNA的兩條鏈均發(fā)生斷裂面包霉中時(shí),卻導(dǎo)致大約30%轉(zhuǎn)染細(xì)胞自身基因的失活,研究者當(dāng)只有在特異性 dsRNA存在的條件下mRNA才被降解,而且斷裂時(shí)把這種現(xiàn)象稱為“抑制( cosuppression)”,1995年Guo等在利的位置僅限于 dsRNA的相應(yīng)的序列,將其分成21~23nt的片斷用反義RNA技術(shù)研究秀麗新小桿線蟲(chóng)( C elegans)的par-1基因提示靶mRNA的斷裂是以 SiRNA作為模板的。更為詳盡的實(shí)驗(yàn)功能時(shí)發(fā)現(xiàn),將與目的基因mRNA互補(bǔ)的反義RNA導(dǎo)入線蟲(chóng)細(xì)表明,RNA降解過(guò)程涉及兩個(gè)步驟-9,第一步是雙鏈RNA被名胞,能夠阻斷par-1基因的表達(dá),但是奇怪的是,注入正義鏈RNA為 Dicer的核酸內(nèi)切酶Ⅲ( RNase Ill)樣蛋白加工成21-~25nt長(zhǎng)度作為對(duì)照,也同樣阻斷了基因的表達(dá)。這一奇特的現(xiàn)象直到3年的 siRNA。第二步,反義鏈RNA引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶復(fù)合體(RSC)去后才被闡明,1998年Fire等發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象是由于在制備正義/切除單鏈的同源mRNA.RISC在 SiRNA的引導(dǎo)下,切斷序列特反義RNA時(shí)混入了少量的 dsDNA,他們將unc2,feml、hhl、異性的mRNA,切斷部位大約在與反義小干涉RNA配對(duì)序列的myo3、gfp等基因的正義RNA、反義RNA、, dsRNA分別注射到中部,而后,mRNA進(jìn)一步降解線蟲(chóng)中,發(fā)現(xiàn) dsRNA所引起的基因沉默效應(yīng)要比單個(gè)正義RNA2.2RNA介導(dǎo)同源DNA甲基化(RdDM)RNA或者反義RNA都要強(qiáng)的多,如果將制備的RNA純化,正義RNA目前認(rèn)為RNAi在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用主要包括擴(kuò)增和催化反應(yīng)引起的基因沉默就會(huì)消失,反義RNA引起的基因沉默也會(huì)變得兩個(gè)主要步驟。而在植物中,發(fā)現(xiàn)RNAi也能引發(fā)DNA甲基化,很微弱。他們把這種 dsrna介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象稱為從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄沉默現(xiàn)在證明sRNA可能通過(guò)直接DNA甲基RNAi。后來(lái)的實(shí)驗(yàn)表明 dsrNA不單可以特異性阻抑靶基因表化和在其他一些基因組中的共價(jià)修飾來(lái)完成轉(zhuǎn)錄過(guò)程。在植物達(dá),而且還會(huì)導(dǎo)致其第一代子代的同源基因沉默。中,這一活性可能由另外一類 SiRNA介導(dǎo)完成。介導(dǎo)同源DNA2RNAi的作用機(jī)制序列中胞嘧啶甲基化作用,需要在PTGS/RNA中引導(dǎo)同源RNA雖然遺傳學(xué)和生物化學(xué)方法已用于探索RNAi的機(jī)制,但真降解的sRNA的產(chǎn)生,只有與引導(dǎo)RNA序列互補(bǔ)的DNA序列才正的機(jī)理目前尚未明了,下面是RNAi的一些可能機(jī)制能被修飾,表明RNA與DNA直接發(fā)生相互作用。短至30bp的2.1 siRNA介導(dǎo)同源RNA降解DNA序列能夠作為甲基化的目標(biāo),胞嘧啶是甲基化位點(diǎn),且在胞1999年, Ham ilton等在植物基因沉默的研究中發(fā)現(xiàn),21~漿中產(chǎn)生的誘導(dǎo)PTGS的RNA能從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核,產(chǎn)生對(duì)細(xì)5nt的 dsRNA的出現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因?qū)е禄虺聊种匾?而在轉(zhuǎn)基胞核的反饋?zhàn)饔?激發(fā)同源DNA的甲基化,這種RNA指導(dǎo)的因正確表達(dá)的植物中則未出現(xiàn)。隨后, Hammond5和 Tuschl等6DNA甲基化擴(kuò)大了原來(lái)有限的甲基化,從而進(jìn)一步加強(qiáng)了基因沉也進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究證明了這些小分子RNA在RNAi中的作默。研究證實(shí)RdDM可能在啟動(dòng)或維持基因沉默中起作用,DNA用。因此提出了RNAi的模式:即 dsRNA被處理加工產(chǎn)生出21~甲基化缺陷將引起PTGS緩解。RNA觸發(fā)RdDM可能與DNA甲23nt的RNA,后者通過(guò)序列互補(bǔ)介導(dǎo)mRNA的剪切降解。另MYH中國(guó)煤化工部分解鏈的DNA以形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了 siRNA在RNAi過(guò)程中的存在和作用。 Zamore RNCNMHGRNA2DNA三分子螺旋①基金項(xiàng)目:深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(200602043)12中外醫(yī)療 CHINA FOREIGN MEDICAL TREATMENTCHINA FOREIGN MEDICAL T提中外醫(yī)療基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)這些異常結(jié)構(gòu)可能吸引 MTase靠近,經(jīng)過(guò)充分循環(huán),催化同源顯微注射、浸泡或喂養(yǎng)的方法導(dǎo)入線蟲(chóng),然后用解剖顯微鏡或微DNA甲基化1-12l最近有報(bào)道,在粟酒裂殖酵母( s Pom be)中分干涉差顯微鏡觀察RNAi表型變化, ahringer)小組應(yīng)用喂食RNAi機(jī)制在合成和維持高度有序的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能中發(fā)揮至的方法完成了預(yù)測(cè)基因86%的RNAi分析。 Hyman小組根據(jù)染色關(guān)重要的作用。缺失RNAi過(guò)程中關(guān)鍵基因?qū)е轮行牧NA和體I的每個(gè)可讀框,用PCR擴(kuò)增基因組片段,將合成的 dsRNA其他類型的異染色質(zhì)的表觀遺傳沉默現(xiàn)象缺失。這些改變伴隨注射入線蟲(chóng)體內(nèi)誘導(dǎo)了系統(tǒng)的RNA反應(yīng),并記錄了胚胎突變表著有這些區(qū)域的甲基化狀態(tài)改變進(jìn)而中心黏合作用喪失導(dǎo)致核型。Pano和 Kemphues小組分析了350個(gè)卵細(xì)胞cDNA基因,其分裂過(guò)程中染色體的錯(cuò)誤分離。有研究者據(jù)此提出理論解釋了中81個(gè)基因在胚胎生成中有重要作用。在野生型細(xì)胞中,中心粒重復(fù)序列的表達(dá)導(dǎo)致 dsRNA甲基化。也3.2基因治療有報(bào)道 SiRNA介導(dǎo)染色體結(jié)構(gòu)跟大的改變,在四膜蟲(chóng)中程序性基RNAi的作用具有高效率和高特異性的特點(diǎn),它能使目標(biāo)蛋因組重排導(dǎo)致特異性DNA序列的切除白的mRNA發(fā)生特異性的降解。因此,RNAi是基因沉默療法的23RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)模型理想工具。目前,人們已經(jīng)證明在培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,RNAiDNA甲基化能引起轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄的提前終止,從而產(chǎn)生異?？捎糜诳共《竞涂鼓[瘤等的基因治療及神經(jīng)系統(tǒng)疾患的治療。RNA,轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞核中表達(dá)也導(dǎo)致了高水平的異常RNA轉(zhuǎn)錄。 Novena等發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染針對(duì)CD4受體合成的 SiRNA能使HV-1感當(dāng)異常RNA的量超過(guò)一定閾值時(shí),就會(huì)被存在于細(xì)胞質(zhì)中的某染Magi-CCR5細(xì)胞的能力降低75%沉默gag能使p24表達(dá)下降體系所感知并激活細(xì)胞質(zhì)中的RdRp,于是RdRp以異常RNA75%,nef- sirna則能使nef轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物減少為原水平的10%,p24水為模板轉(zhuǎn)錄出小片段互補(bǔ)DNA(cDNA),這些cD2NA與核糖核酸平下降為原水平的4%。這些實(shí)驗(yàn)都能大大降低游離病毒水平。酶形成一個(gè)序列特異的復(fù)合物RISC,CDNA處于復(fù)合物的中心。 Brisibe等指出,在HIV-1基因組中nef基因可能是最重要的調(diào)該復(fù)合物能與mRNA雜交,捕獲并降解與轉(zhuǎn)基因序列相同或互補(bǔ)控基因。Nef是HⅣ早期表達(dá)產(chǎn)物,幾乎占早期mRNA的80%,作的RNA,從而成為專一性作用于雙鏈RNA的RNA降解酶底物,用包括下調(diào)CD4、細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和非CD4細(xì)胞萎縮,與引起低水平轉(zhuǎn)基因RNA的積累。體外實(shí)驗(yàn)證明該酶能以RNA為L(zhǎng)TR有一定重疊。Xia等用重組腺病毒相關(guān)病毒(AAV)對(duì)轉(zhuǎn)基因模板合成cDNA,他們?cè)隗w內(nèi)雜合到相應(yīng)mRNA上,并被特異作小鼠進(jìn)行腦內(nèi)注射, shrnA使SCA1小鼠蒲肯野細(xì)胞中異常用于雙鏈RNA的RNA降解酶降解。 RdRp cDNa模型可以很好 ataxin蛋白和其mRNA降低了50%~60%, Calbi2ndin染色顯示神地解釋PTGS很強(qiáng)的序列特異性。非正常RNA能作為RdRp的經(jīng)元死亡大大減少,核內(nèi) ataxin包涵體減少50%,且 rotarod運(yùn)動(dòng)底物,從而激活了RNA降解機(jī)制,導(dǎo)致外源基因轉(zhuǎn)錄后水平上的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)小鼠的運(yùn)動(dòng)功能明顯改善。亨廷頓舞蹈病是外顯子沉默,脫腺苷化的mRNA作為異常RNA或RNA指導(dǎo)下的RNA1中HD基因引起多谷氨酰胺擴(kuò)增,生成了毒性 huntingtin蛋白聚合酶模板,在細(xì)胞質(zhì)中作為潛在的基于同源降解機(jī)制的激活(htt)。理論上,沉默 huntingtin基因能減輕神經(jīng)毒性緩解舞蹈癥劑,只要有足夠的宿主編碼RNA指導(dǎo)下RNA聚合酶的底物,反狀。 Harper等將htt- shRNA質(zhì)粒以AAV為載體轉(zhuǎn)染小鼠,htt義RNA就能被合成。如果相關(guān)mRNA的3′端特定部分降解,就mRNA被抑制55%~85%,包涵體基本消失,對(duì)正常的內(nèi)源性htt會(huì)引起轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默12沒(méi)有影響。 Rotarod運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)證明,轉(zhuǎn)染 shRNA的小鼠的運(yùn)動(dòng)功3RNAi的應(yīng)用能明顯改善。腫瘤是一種多基因突變累積與相互作用形成的細(xì)3.1探索基因功能的有力工具胞異常增生。由于RNAi能沉默特定基因的作用,可能在誘導(dǎo)凋在功能基因組研究中,需要對(duì)特定基因進(jìn)行功能喪失或降低亡、增加藥物敏感性、抑制突變基因和血管生成等多方面成為突變,以確定其功能。由于RNAi可以使特異基因mRNA發(fā)生降新的腫瘤治療方法。p53變異發(fā)生在50%的人類腫瘤,變異的p53解,從而獲得特定蛋白功能喪失或降低的突變株。因此RNAi可會(huì)影響野生型p53的功能。因此,應(yīng)用RNAi沉默變異的p53可以作為一種強(qiáng)有力的研究工具,用于研究功能基因組。而與其他以恢復(fù)野生型p53的功能。Bcl22是調(diào)控凋亡的基因家族,高表達(dá)幾種進(jìn)行功能喪失的技術(shù)相比,RNAi技術(shù)具有明顯的優(yōu)點(diǎn),該技會(huì)引起腫瘤耐藥。業(yè)已證明,沉默Bc22可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,恢術(shù)高效、特異、低毒性、周期短、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)是傳統(tǒng)的基復(fù)對(duì)藥物的敏感性。Bcr/Abl是最早發(fā)現(xiàn)的融合基因,它的表達(dá)敲除技術(shù)和反義技術(shù)所無(wú)法比擬的。RNAi技術(shù)在線蟲(chóng)全基因是引起慢性粒細(xì)胞白血病CML)的主要原因。Bcr/Abl- siRNA組功能硏究及果蠅、錐蟲(chóng)研究中均有很廣泛的作用。線蟲(chóng)全基能明顯抑制CML細(xì)胞中Bcr/ abImRNA表達(dá),卻不影響c-abl和因組已于1998年測(cè)序完畢,RNAi的發(fā)現(xiàn)又為系統(tǒng)和高通量研究c-bcr表達(dá),Bcr/Abl2 esiRNA能使各種細(xì)胞株對(duì)y射線和STI571線蟲(chóng)全基因組功能提供了可能。許多小組應(yīng)用高通量的RNAi技(imat中國(guó)煤化工M細(xì)胞調(diào)亡術(shù)完成了功能基因組的分析,通過(guò)RNAi使預(yù)知的19427個(gè)基因4CNMHG中約95%的基因表達(dá)下調(diào),實(shí)驗(yàn)方法是:先用PCR方法或反轉(zhuǎn)錄Ax不明兒不L任亞研究領(lǐng)域引起了巨大反響,方法大規(guī)模獲得基因庫(kù),直接體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成 dsRNA,再用由于能夠快速而簡(jiǎn)便的制備某個(gè)基因的功能缺失表型,它已成為CHINA FOREIGN MEDICAL TREATMENT中外醫(yī)療13中外醫(yī)療MEDCAL THEATMENT基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)基因功能研究中最有效的工具但在實(shí)際應(yīng)用領(lǐng)域,一些問(wèn)題仍待解3191~3197決,如:如何選擇合適的載體;對(duì)于不同生物有效的sRNA的特征需要7] Zamore PD, et al. RNAi: double- stranded RNAdirects the AtP-de認(rèn);如何提高RNA的效率找到一種高效而低毒的適于人pendent cleavage of mRNAat 21 to 23 nucleotide intervals[J]體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng);如何避免脫靶效應(yīng);如何應(yīng)對(duì)新的突變。但無(wú)論如何cell,2000,101(1):25-33作為一種重要的研究基因功能的有效工具,隨著RNA研究的不斷完8] Elbashir S M, Lendeckel w, Tuschl T RNAinterference is mediated善和廣泛應(yīng)用,它將在生命科學(xué)的研究疾病的防御及治療中發(fā)揮重by 212and 222nucleotide RNAs[].Genes Dev, 2001, 15(2):要的作用。參考文獻(xiàn)[9] Bernstein E, Caudy AA, Hammond S M, et al. Role for bidentate[1 Marx, JInterfering with gene expression[J]. Science, 2000, 288: 1ribonuclease in the initiation step of RNAinterference J]. Nature,370~3712001,409(6818):363~368[2] Guo S, Kemphues KJ Par2l, a gene required for establishing [10] Robin A RNAi and heterochromatin-a Hushed-up affair[]. Science,polarityin C elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase2002,297:1818~1819that is asymmetrically distributed[J]. Cell, 1995, 81(4): 611-620[ll] Jones L, Ratcliff F, Baulcombe DC. RNA2directed transcriptionalgene silencing in plants can be inherited ineinterference by double st randed RNAin Caenorhabditis elegans[J]RNAtrigger and requires Metl for maintenance[]. Curr Biol, 2001Nature,1998,391:806-810ll(10):747~757[4] Hamilton AJ, Baulcombe DC.Aof small antisense RNAin[12]孫建國(guó),座榮霞,陳正堂,RNA干涉分子機(jī)制研究進(jìn)展[].生posttranscriptional gene silencing in plants[]. Science, 1999, 286物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2002,29(5):678-68113] Fraser AG, Kamath RS, et al. Functional genomic analysis of C.[5] Hammond SM,et al. An RNA-directed nuclease mediates post-tran-elegans chromosome I by systematic RNAinterference[J]. Nature,scriptional gene silencing in Drosophila cells[J]. Nature, 2000, 4042000,408(6810):325-330(6775):293[6] Tuschl T, Zamore P D, Lehmann R, et al. Targeted mRNAdegrada【收稿日期】2008-12-13tion by doublestranded RNAinvitro[]. Genes Dev, 1999, 13(24)《科技創(chuàng)新導(dǎo)報(bào)》稿件要求及投稿說(shuō)明稿件要求1、稿件應(yīng)具有科學(xué)性、先進(jìn)性和實(shí)用性,論點(diǎn)明確、論據(jù)可靠、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、邏輯嚴(yán)謹(jǐn)、文字通順。3、所變題家在半位內(nèi),計(jì)學(xué)號(hào)國(guó)家標(biāo)學(xué)名詞及符號(hào)4、參考文獻(xiàn)按引用的先后順序列于文末6、正確使用標(biāo)點(diǎn)符號(hào),表格設(shè)計(jì)要合理,推薦使用三線表。7、圖片要請(qǐng)晰,注明圖號(hào)。1、來(lái)稿律使用Word排版且具有一定的學(xué)術(shù)水平,以2700宇左右為宜,并保證文章版權(quán)的獨(dú)立性,嚴(yán)禁抄襲,文責(zé)自負(fù),請(qǐng)勿一稿多投,歡迎投稿2、本刊已加入《中國(guó)學(xué)術(shù)期刊(光盤(pán)版)》、《中文科技期刊數(shù)據(jù)庫(kù)》、《數(shù)字化期刊群》等網(wǎng)絡(luò)媒體,本刊發(fā)表的文章將在網(wǎng)絡(luò)媒體上全文發(fā)布。3、本刊編輯部對(duì)來(lái)稿有修改權(quán),不愿改動(dòng)者請(qǐng)事先說(shuō)明。自收稿之日起1個(gè)月內(nèi)未收到刊用通知,作者可自行處理4、來(lái)稿請(qǐng)注明作者姓名、單位、通訊地址、郵編、聯(lián)系電話及5、本刊發(fā)表周期為10天,出刊后5天內(nèi)郵寄樣刊中國(guó)煤化工6、如有一稿多投、剽竊或抄襲行為者,一切后果由作者本人負(fù)責(zé)CNMHG14中外醫(yī)療 CHINA FOREIGN MEDICAL TREATMENT