廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)VoL 462007年3月Journal of Xiamen University( Natural Science)lar.2007烯丙胺等離子體處理聚丙烯膜的酶固定化朱建明(廈門邁克制藥有限公司,福建廈門361022)摘要:以烯丙胺等離子體對聚丙烯膜表面進(jìn)行處理后,利用表面生成的氨基功能基團(tuán)進(jìn)行過氧化物酶的固定化,所采用的固定化方法主要有吸附法、戊二醛交聯(lián)法和分子識別法.結(jié)果表明通過等離子體處理后聚丙烯膜表面的氨基基團(tuán)可以有效地提高酶固定化效率,其中分子識別法可以得到具有最高酶活和酶穩(wěn)定性的固定化酶膜關(guān)鍵詞:烯丙胺等離子體;聚丙烯膜;辣根過氧化物酶;酶固定化中圖分類號:TQ426.97文獻(xiàn)標(biāo)識碼文章編號:0438-0479(2007)020213-04酶作為生物體內(nèi)由活性細(xì)胞產(chǎn)生的具有催化功其揮發(fā)),在50Pa、50W的條件下處理一定時間.將能、活性可調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì),其催化功能具有高效、功能膜繼續(xù)在烯丙胺氣氛中保持半小時,最后抽真空至5專一、作用條件溫和等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于制藥、環(huán)保、Pa,引入氮?dú)庵脸?開啟等離子體發(fā)生器并取出聚食品等領(lǐng)域.以高分子分離膜作為載體的固定化酶膜,丙烯膜,將其分別以乙醇和水清洗多次,然后真空干可以將酶的催化功能和膜的優(yōu)良分離功能有機(jī)結(jié)合,燥成為近些年來的研究熱點(diǎn).但是常規(guī)高分子分離1.3改性聚丙烯微孔膜的表征膜表面由于生物相容性差,在用于酶固定化時與酶蛋以 HITACHI S4500I型掃描電鏡觀察膜表面的白的非生物特異性相互作用通常使酶蛋白變異甚至失微觀形貌紫外吸光值在 UVIKON923紫外可見光活.本文采用等離子體表面改性法,將具有氨基功能基譜儀上測定.以G2Krus接觸角儀測定膜改性前后的團(tuán)的烯丙胺固定到具有優(yōu)異化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械性能的接觸角以茚三酮法來確定改性后膜表面的氨基濃度,聚丙烯微孔膜表面,利用氨基的特殊作用采用不同方正辛基胺作為標(biāo)準(zhǔn)物法將過氧化物酶固定到膜上,得到了一種具有良好分4過氧化物酶在膜表面的固定化離性能和催化功能的酶膜反應(yīng)器.(1)物理吸附法:4C下將膜浸入0.15mg/mL的實(shí)驗部分HRP/PBS(0.1mol/L,pH7.0)中,4.5h后取出膜以2 mL PBS溶液清洗多次,并將清洗液收集.最后將1.1實(shí)驗原料膜放入PBS(0.1mol/L,pH7.0)溶液中4C下保存.辣根過氧化物酶(HRP,EC1.11.1.7, Sigma),聚測試酶溶液在浸入膜前后和PBS清洗液在403nm處丙烯微孔膜( Membrana gmbh, Germany)平均孔徑的吸光值用于計算固定化酶的量m,孔隙率75%烯丙胺來自 acros.PBS緩沖溶(2)戊二醛交聯(lián)法:將膜剪碎后浸入10mL由液由NaH2PO4/Na2HPO4及KCl按標(biāo)準(zhǔn)配成.生物25%戊二醛、PBS(0.1mol/L,pH9.0)、乙醇按體積比素一琥珀酰亞胺( biotin succinimide)、親和素( avidin)1:7:2構(gòu)成的混合溶液,室溫、磁力攪拌下反應(yīng)3h.購自 Sigma.其它常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品然后將膜取出,以大量去離子水清洗,將膜小心以濾紙1.2聚丙烯微孔膜表面的等離子體處理擦干后浸入0.1mg/mL的HRP/PBS(0.1mol/L采用RF等離子體發(fā)生器(13.56MHz)將聚丙pH7.0),在4C下保持24h.最后將膜取出.以2mL烯膜固定在等離子體發(fā)生器內(nèi)直徑為12cm的鋁電極PBS溶液清洗多次,并將清洗液收集.最后將膜放入上.兩電極間距為3cm.將發(fā)生器內(nèi)部抽真空至5 Pa PBs(0TH中國煤化衛(wèi)4C下保存后,引入氬氣并開啟等離子體發(fā)生器對膜進(jìn)行預(yù)處理CNMHG碎卒后漫入0.4mg/mL(50Pa,25W,5min).隨后導(dǎo)入烯丙胺氣體(低壓下使生物素一琥珀酰亞胺/PBS(0.1mol/L,pH8.0)中,室溫下磁力攪拌12h.然后以大量去離子水清洗膜.將收稿日期:2006-03-2膜放入1mg/mL的親和素/PBS(0.1molL,pH7.4)Emil:右數(shù)據(jù) a hotmail. co中,4C下反應(yīng)3h然后以大量PBS(0.1mol/L,pH廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)2007年7.0)溶液清洗膜.同時,向Ⅰmg/ mL HRP/PBS(0.1丙胺等離子體在5oW下處理10min,膜表面的接觸mol/L,pH8.0溶液中加入大量生物素一琥珀酰亞胺角從未改性前的147°下降到82°,說明經(jīng)改性后膜表室溫下磁力攪拌反應(yīng)3h.最后加入10mg氨基乙酸面的親水性顯著提高.膜表面氨基濃度的測試結(jié)果也使其與未反應(yīng)的生物素反應(yīng)以 Sephadex g25型柱說明經(jīng)過烯丙胺等離子體處理后,膜表面氨基濃度可利用不同大小分子在柱中流出速度的差異對得到的溶以增大到38.20gmol/液進(jìn)行分離,收集大分子量的生物素標(biāo)定的酶.將上述以掃描電鏡對烯丙胺等離子體處理前后聚丙烯膜經(jīng)過處理的膜浸入4℃生物素標(biāo)定的酶/PBS(0.1的表面形貌進(jìn)行觀察,結(jié)果如圖1所示對于未改性聚mol/L,pH7.0)溶液中(濃度約0.3mg/mL)進(jìn)行酶丙烯膜(圖la),其表面存在大量微孔.經(jīng)過烯丙胺等的固定化(4C,24h)離子體處理后(圖1b),發(fā)現(xiàn)膜表面已經(jīng)覆蓋了一層物1.5酶活性測試質(zhì),膜表面的微孔尺寸及數(shù)量大量減少.從膜橫截面的采用氨基安替比林/苯酚( amino antipyrine-phe掃描電鏡圖來看,經(jīng)氬等離子體及50W、10min烯丙hol)法,通過對產(chǎn)物在505m處的紫外吸光值的變胺等離子體處理后,膜表面新引入的物質(zhì)厚度可以達(dá)化速度來測定固定化酶的活性.1個酶活性單位U定到約30nm(圖1c)義為室溫下每分鐘形成1mol的產(chǎn)物.比活性(spe綜上所述,經(jīng)過烯丙胺等離子體處理后,膜表面的cific activity./mg)定義為每mg酶所能產(chǎn)生的活性按觸角由高度疏水性的14降低到弱親水性的82,單位膜活性(U/g)定義為每g固定化酶膜所產(chǎn)生的膜表面的氨基濃度則隨著等離子體處理強(qiáng)度的增大而活性單位固定化酶的儲存穩(wěn)定性(%定義為一定時述漸提高而膜表面形貌的分析也證明經(jīng)過等離子體后剩余酶活與初始酶活的百分比值.處理后膜表面引入了新的物質(zhì),其厚度可以達(dá)到幾十納米.這些結(jié)果都說明經(jīng)過烯丙胺等離子體處理可以2結(jié)果與討論成功地在聚丙烯膜表面引入氨基功能基團(tuán).從而為膜表面進(jìn)行酶固定化提供了多種可能2.1烯丙胺等離子體處理聚丙烯膜的表面性2.2烯丙胺等離子體處理聚丙烯膜的過氧化能表征物酶固定化經(jīng)烯丙胺等離子體處理后,分別測試了膜表面的分別以物理吸附法、戊二醛交聯(lián)法和分子識別法接觸角及氨基濃度如表1所示,當(dāng)以氬等離子體及烯將辣根過氧化物酶固定在經(jīng)烯丙胺等離子體處理的聚表1烯丙胺等離子體處理前后聚丙烯膜表面的接觸角及氨基濃度測試結(jié)果Tab 1 Allylamine plasma treatment on surface properties of polypropylene membranes膜等高子體條件接觸角()氨基量/(mol·g1 native PP147±3.22, low levelArgon plasmat allylamine plasma(50 W, 2 min)114±4.519.32Middle levelArgon plasma t allylamine plasma(50 W,5 min)103±2.13. high levelArgon plasma +allylamine plasma(50 W, 10 min) 82+3. 038.20中國煤化工CNMH圖1聚丙烯微孔膜在等離子體處理前后的掃描電鏡圖(a)未改性聚丙烯膜表面;(b)經(jīng)氫等離子體及50W、10min烯丙胺等離子體處理后的聚丙烯膜表面c)處理后的聚丙烯膜的橫截面方數(shù)據(jù) M photos of different polypropylene membranes第2期朱建明:烯丙胺等離子體處理聚丙烯膜的酶固定化153.03.0采用戊二醛法和基于生物素/親和素( biotin- avidin)間immobilized amount2.51 8283 membrane activity圖255相互作用的分子識別法來固定辣根過氧化物酶結(jié)果己2020分別如圖3所示從圖3a可以看出,與圖2中的物理吸附法相比,戊二醛法能有效提高固定化酶的含量和1。酶的比活性,從而使固定化酶膜的活性得到顯著提高1.0橡|10】對于氳等離子體及Wn的烯丙胺等離子體處理后的聚丙烯膜,其表面固定化酶的量為2.78mg/g比物理吸附法有大幅度的提高;固定化酶的特性活性10.0也有所提高.而且隨著等離子體處理強(qiáng)度的增大,固定Membrane化酶量增大的效果越明顯.但是,另一方面,與物理吸圖2不同聚丙烯膜經(jīng)物理吸附法固定化辣根過氧化物附法相比,經(jīng)過戊二醛處理后,得到的固定化酶的比活酶的結(jié)果(膜的編號見表1)性并沒有明顯提高.對于氬等離子體及50W.10minFig 2 Results of peroxidase immobilization by physica的烯丙胺等離子體處理后的聚丙烯膜,固定化酶的比adsorption onto different membranes活性僅為0.7lU/mg,比物理吸附法得到的酶活低,這可能是由于戊二醛與酶分子上的氨基化學(xué)鍵合后丙烯膜表面在酶固定化過程中,酶溶液的濃度及固定使得酶的構(gòu)象發(fā)生變化從而降低了活性化時間對固定效果影響較大.經(jīng)測試后確定較優(yōu)的固近些年來基于生物素一親和素之間的分子識別作定化條件為酶洛液濃度0.1mg/mL,固定化時間24用而進(jìn)行的酶固定化方法受到了廣泛的關(guān)注-8.利h.聚丙烯膜在烯丙胺等離子體處理前后,以物理吸附用生物素一親和素之間的識別作用,將生物素固定在法進(jìn)行酶固定化的結(jié)果如圖2所示對于未經(jīng)等離子載體上,進(jìn)一步利用它去識別固定親和素蛋白,最后通體處理的聚丙烯膜(1)經(jīng)過物理吸附后其表面固定過固定化的親和素上剩余的結(jié)合位點(diǎn)識別固定生物素的酶量僅為0.99mg/g,而且酶的活性也很低.當(dāng)經(jīng)過標(biāo)記的酶分子然后對酶進(jìn)行親和素標(biāo)記,可以得到具氬等離子體及50W.2min的烯丙胺等離子體處理有高酶活保留值和穩(wěn)定酶活的固定化酶.如圖3a所后膜上固定化酶的量及其比活性都得到明顯提高.而示,經(jīng)等離子體處理后的聚丙烯膜,采用生物素一親和且,隨著等離子體處理強(qiáng)度的增大,膜上固定化酶的量素的分子識別法,可以明顯提高固定化酶特性活性.對及其比活性可以分別達(dá)到2.35mg/g和1.13U/mg,于以氬等離子體及50W,10min烯丙胺等離子體處相應(yīng)的固定化酶膜的活性也得到提高.理后的聚丙烯膜,其固定化酶的量增大到3.30mg/g,對經(jīng)氬和烯丙胺等離子體處理的聚丙烯膜,分別固定化酶的比活性更高達(dá)2.36U/mg,從而使得固定mobilized amount(a)mbrane activitbo己620MembranesStorage time /d圖3戊二醛和分子識別法在等離子體處理后聚丙烯膜上固定化酶的結(jié)a)固定化酶量及其特比活性;(b)固定化酶儲存穩(wěn)定性:(○)中國煤化工寸法固定化酶的穩(wěn)定性;(●)改性聚丙烯膜上以物理吸附法固定化酶的穩(wěn)定性;(VCNMH固定化酶的穩(wěn)定性(▲)改性聚丙烯膜上以分子識別法固定化酶的穩(wěn)定性.所用改性聚丙烯膜均經(jīng)氬及50W,10mi烯丙胺等離子處理Fig 3 Results of peroxidase immobilization onto plasma-treated polypropylene membranes by glutaraldehyde and mo萬方數(shù)蟈 r recognition methods廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)2007年化酶膜的活性達(dá)到7.79U/g比未改性膜采用物理吸[1] Moore c m, Akerson l, HIlLA D,etal. Improving the en附法得到的結(jié)果提高近17倍ronment for immobilized dehydrogenase enzymes by固定化酶的儲存穩(wěn)定性也是評價酶固定化方法的modifying Nafion with tetraalkylammonium bromides[J]個重要指標(biāo),圖3b為固定化酶膜的儲存穩(wěn)定性.對Biomacromolecules 2004.5: 1241-1247于未改性的聚丙烯膜,物理吸附固定化酶的穩(wěn)定性很[2] Karyakin AA, Kotel'nikova E A, Lukachova L V, et alOptimal environment for glucose oxidase in perfluorosul差,80d后酶膜的活性幾乎消失.而對于氬及50W,10fonated ionomer membranes: improvement of first-generamin烯丙胺等離子體處理的聚丙烯膜,用三種方法固tion biosensors[J. Anal Chem, 2002, 74: 1597-1603定化酶后酶的儲存穩(wěn)定性都得到明顯改善.與物理吸Sarin VK, Kent S B H, Tam J P, et al. Quantitative mor附法相比,雖然經(jīng)過戊二醛鍵合后酶的特性活性不高但是穩(wěn)定性比物理吸附法有所提高.采用分子識別法reaction[J. Anal Biochem, 1981, 117: 147-157固定化酶后.酶膜的儲存穩(wěn)定性得到顯著改善,80d「4] Pahari I, Patel A B, Behere D v. Spectroscopic studiesαn后酶膜還可以保留約80%的活性tryptophan sensitized bound terbium (III) fluorescence3結(jié)論LJ. J Inorg Biochem, 1995, 60: 245--255[5 Amounas M, Magne V, Innocent C, et al. Elaboration and以烯丙胺等離子體處理聚丙烯膜表面,通過控制hemical reactivity of enzyme等離子體處理強(qiáng)度在聚丙烯膜表面引入了不同濃度的textiles[J]. Enzyme Microb Tech, 2002,31: 171-181氨基功能基團(tuán).分別以物理吸附法、戊二醛交聯(lián)法和分[6] NicellJ A, Wright H. A model of peroxidase activity with子識別法進(jìn)行辣根過氧化物酶的固定化,結(jié)果表明:與hibition by hydrogen peroxide [j]. Enzyme Microb物理吸附法相比,戊二醛交聯(lián)法可以提高膜表面固定ech,1997,21:302-310化酶的含量,但是固定化酶的特性活性沒有明顯改善;7 Fisherman A, Levy T, Cogan U,etal. Stabilization of而分子識別法則可以顯著提高固定化酶的特性活性horseradish peroxidase in aqueous-organic media得到具有高固定化酶膜活性的材料.經(jīng)過表面改性后,mobilization onto cellulose using a cellulose-binding-do-main[J. J Mol Catal B, 2002, 18: 121-131種方法得到的固定化酶儲存穩(wěn)定性都得到明顯提[8 Amounas M. Innocent C, Cosnier S, et al. A membrane高,其中分子識別法得到的固定化酶在80d后能保留based reactor with an enzyme immobilized by an avidin- bi80%的酶活,證明是一種非常有效的方法otin molecular recognition in a polymer matrix [J].J參考文獻(xiàn)Enzyme Immobilization on allylamine Plasma-treatedPolypropylene membranesZHU Jian-ming(Xiamen Mchem Laboratories LTD. Xiamen 361022. ChinaAbstract: Allylamine plasma was applied to the hydrophobic polypropylene microfiltration membranes to generate amino groupson membrane surface. These amino groups were later utilized to immobilize peroxidase onto membranes via various methods includingphysical adsorption, glutaraldehyde crosslinking and molecular recognition based on the interaction between biotin and avidin. The reult reveals that compared with native polypropylene membrane, the surfaceprove the amount and storage stability as well as the working stability of im中國煤化工plasma can effectively imethods the mo-lecular recognition method is proved to be the most efficient one.CNMHGKey words: allylamine plasma; polypropylene membrane; peroxidase; enzyme immobilization