綜述·200年11月第45卷第20期RNA千擾技術(shù)的應(yīng)用應(yīng)彩云1鐘鳴2(1南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院2004級醫(yī)學(xué)影像學(xué)專業(yè);2南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2004級醫(yī)學(xué)檢驗(醫(yī)學(xué)實驗技術(shù))傳專業(yè)廣州520515)[摘要]RNA干擾是自然界生物中廣泛存在的一種保守的自我保護現(xiàn)象。隨著對RNAi發(fā)生機制的深入研究RNA正作為一種成熟的技術(shù)被研究工作者廣泛應(yīng)用于功能基因組的研究,如基因功能的檢測、基因治療腫瘤多藥耐藥研究、藥物開發(fā)等。[關(guān)鍵詞]RNA干擾;雙鏈RNA;RNA降解;基因治療;腫瘤多藥耐藥中圖分類號R392-3[文獻標識碼]A[文章編號]1673-9701(2007)20-152-03RNA( RNA interference,NAi)干擾是指在生物體細胞內(nèi)由種ATP結(jié)合蛋白(ATP- binding cassette,Bc)轉(zhuǎn)運體有著密切于外源性或內(nèi)源性雙鏈RNA誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生序列特異的RNA關(guān)系。2006年, Parker等報道,RDE4是RNAi干擾產(chǎn)生過程降解的自然現(xiàn)象,是自然界生物中廣泛存在的一種保守的自我中的另一個必需蛋白,RDE4D的二聚體對細胞內(nèi)出現(xiàn)的內(nèi)源保護現(xiàn)象。RNA干擾技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一種基因研究工性或外源性長的dsNA具有高度的親和力并可以優(yōu)先結(jié)合到具,被廣泛地用于功能基因組的研究,如基因功能的檢測、基因 dsrNa上。利用特異的抗體將RDE4進行免疫沉淀,檢查治療腫瘤多藥耐藥研究和藥物開發(fā)等。RNAi產(chǎn)生的主要原因RDE4的免疫沉淀復(fù)合物時發(fā)現(xiàn),RDE4的免疫沉淀復(fù)合物是:在大多數(shù)的生物細胞內(nèi),由于外源性或內(nèi)源性雙鏈RNA中只有dRNA的存在,并沒有檢查出 siRNA的存在,因此,( Double stranded RNA, dsrna)的存在,在多種酶的作用下,RDE4在 siRNA介導(dǎo)的基因沉默的后續(xù)過程中并非必須產(chǎn)生與dRNA的序列相特異的mRNA分子降解使目的基因的的,可能只起到優(yōu)先結(jié)合并傳遞 dsrNa給Dcer酶的作用,但表達量降低甚至消失,但并沒有破壞或改變原來的目的基因,關(guān)于RDE4如何去辨別長的dRNA和iRNA的機制目前尚不即誘導(dǎo)產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄后基因沉默( Posttranscriptional gene silencing,清楚。PTGS)。12RNA干擾誘導(dǎo)特異性基因沉默的特點作為一種新的功能基因研究工具,RNAi有著傳統(tǒng)的基因研1RNA誘導(dǎo)特異性基因沉默的機制研究與特點究工具無法比擬的優(yōu)點,傳統(tǒng)上對一個基因的功能研究主要是1.1RNAi誘導(dǎo)特異性基因沉默的機制研究通過向細胞內(nèi)引入需研究的靶基因的反義寡核苷酸,誘導(dǎo)靶基1998年,Fme等呵研究證明利用已知序列的 dsRNa能夠特因的沉默,利用反義寡核背酸沉默目的基因不僅花費大操作復(fù)異性地阻斷秀麗隱桿線蟲( Caenorhabditis elegans)體內(nèi)的目的基雜而且周期長,不利于廣泛地被利用。而利用RNAi降解mRNA因表達,RNAi開始廣泛引起研究工作者的注意,并被用于多領(lǐng)使靶基因沉默,不僅花費少周期短操作簡單同時具備其特有域的科學(xué)研究中但對于RNA的發(fā)生機制目前仍沒有確切的報的優(yōu)點。(1)高效性大量的研究發(fā)現(xiàn),極少量的 dsrna進入細道普遍認為RNA現(xiàn)象的產(chǎn)生機制類似于細胞的“免疫應(yīng)答”胞內(nèi)就可引起細胞內(nèi)靶序列的高度的表達沉默,通過對其深入機制四。 dsRNA進人細胞內(nèi)被一種具有類似RNaeⅢ活性的核研究發(fā)現(xiàn),細胞內(nèi)存在著類似于“聚合酶鏈式反應(yīng)”的機制。在細酸內(nèi)切酶Dier結(jié)合,并被酶切成19~23nt的小干擾RNA胞內(nèi)存在著一種可以在無需引物存在的情況下,直接以RNA為模( small interference RNA,iNA),在ATP的作用下,iRNA與由板指導(dǎo)RNA合成的RNA聚合酶( RNA-directed RNA polymerase,多種蛋白質(zhì)結(jié)合形成且具有活性的RNA沉默復(fù)合物(RNA- - in- RdRP),當結(jié)合有 SiRNA反義鏈的RSC根據(jù) Watdon-Crick的duced silencing complex,RIsC)結(jié)合,RC具有解螺旋酶的功基配對原則結(jié)合與反義鏈特異性互補的mNA后在降解能使與其結(jié)合的siNA雙鏈解螺旋成單鏈釋放正義鏈,保留NA的同時激活RdRP,激活的RdRP以RNA為模板合成新的反義鏈,隨后識別并結(jié)合細胞內(nèi)與其反義鏈相互補的 mrna dsrNa,新合成的 dsRNA再次被Dcer酶剪切成 siRNA, siRNA鏈。RSC將mRNA剪切成sRNA雙鏈降解mRMA,使靶基因重復(fù)著上一過程,使sRNA的降解mRNA的效應(yīng)起到放大的作表達沉默隊。最近在秀麗隱桿線蟲研究中發(fā)現(xiàn)RNA的發(fā)生與用大大增強了sRNA沉默目的基因的效率。(2)高特異性Brj Nurs,2005,14{4):205-210.中國煤化工阿宗土香老年患者失眠的護理措施及體會臨床誤診誤治,2000{8孫CNMHG失眠因素調(diào)查分析及護理19(5):84-85.對策生休健,以,3):38-59Birkholz G, Gibson JM, Clements PT. Dying patients' thoughts of ending(收稿日期:2007-09-30)lot study of rural New MexicoU]. J Psychosoc NursMent號獸生2007年11月第45卷第20期綜述種 siRNA分子只對與其反義鏈特異性互補的mRNA起降解作后用Der或 RNaseⅢ體外消化長 dsRNA,得到各種不同的siR用如果去除 siRNA分子,基因沉默也隨即消失。(3)可傳遞性NA片段混合物除掉未被消化的 dsRna后,混合物可以直接轉(zhuǎn)RNA的效應(yīng)可在生物體內(nèi)不同的細胞之間傳遞甚至可隨細胞染細胞。但利用Dier或RNaeⅢ消化體外轉(zhuǎn)錄形成的 siRNA轉(zhuǎn)的分裂而傳給子代細胞,使子代細胞同樣具有對靶基因沉默的染細胞后較容易引起細胞內(nèi)干擾素樣反應(yīng),引發(fā)細胞內(nèi)非特異的效能叫?；虺聊?導(dǎo)致細胞凋亡。(4)DNA載體體內(nèi)制備 SiRNA目前,用于RNA干擾研究的質(zhì)粒載體有很多種,但它們驅(qū)動2 siRNA的設(shè)計與產(chǎn)生方法shRNA表達所用的啟動子大多相同,一般為 RNA polymeraseⅢ2.1 SiRNA的設(shè)的某些基因啟動子如H和U6啟動子,啟動子的自身元素均位正確的設(shè)計和選擇 siRNA靶序列可以有效地提高 siRNA沉于轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游,且有明確轉(zhuǎn)錄的起始點、終止點,轉(zhuǎn)錄出的默目的基因的效能。目前sRNA靶序列設(shè)計主要是以Tuch的RNA無pyA尾,DNA載體可以帶有cF、RF的報告基因,以siRNA用戶指南以及 Ambion公司的 siRNA設(shè)計手冊為指導(dǎo)的:監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率同時可以帶有表達抗生素的抗性基因,以篩選穩(wěn)(1)在目的基因DNA中選擇以AA(包括AA)起始的2nt序列,定轉(zhuǎn)染細胞株DNA載體一次制備可多次使用,實驗主要是在因為實驗研究發(fā)現(xiàn)3'端帶有UU的sRNA沉默目的基因的效率DNA水平上操作,對 RNase free的環(huán)境要求相對較寬但實驗一更高而且可以更好地抵抗 RNase的降解;(2)避免選擇起始密般需要較長的時間,且轉(zhuǎn)染效率低。(5)慢病毒制備 siRNA碼下游50-1004終止密碼上游100以內(nèi)的區(qū)域,避免選擇( shrNA)a2目前主要是由 lentivirus介導(dǎo)的RNA干擾。5’或3非編碼區(qū)域以及避免選擇內(nèi)含子區(qū)域;(3)避開4個或以 Lentivirus是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒,可以整合入宿主細胞并長期表達,上的多囊A或多聚T的連續(xù)序列,以免轉(zhuǎn)錄過程的提前中斷;但比一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒擁有更高的滴度,不僅可以感染分裂期(4)針對目的基因選擇2~4個的靶sRNA序列以便篩選能高細胞還能感染非分裂期細胞。利用 lentivirus構(gòu)建的 shrNA表效沉默目的基因的sRNA序列,并盡量控制sRN序列中GC達載體,可以代替瞬時表達載體使用,而且 lentivins-shRNA載的含量在35%~55%;(5)選擇合適的實驗對照。最后,利用體經(jīng)過包裝系統(tǒng)包裝成假病毒顆粒后,可以用于感染依靠傳統(tǒng)BLAST對所選擇的序列進行特異性分析圍目前已經(jīng)有許多轉(zhuǎn)染試劑難于轉(zhuǎn)染的細胞如原代細胞、懸浮細胞等,并且在感染網(wǎng)站可以提供 siRNA序列設(shè)計的免費在線服務(wù)如Ami公司的后可以整合到受感染細胞的基因組中進行長時間的穩(wěn)定表達,在線分析軟件?？梢酝ㄟ^NCB網(wǎng)站查找感興趣的目的基因的是目前制備穩(wěn)定表達 shRNA細胞株和進行體內(nèi)實驗最為理想的mRNA序列登錄 Ambion公司網(wǎng)站按照網(wǎng)站的指示操作,網(wǎng)手段站可設(shè)計出多個 BiRNA序列可供選擇,最后可根據(jù)設(shè)計原則選擇最合適序列3RNAi技術(shù)的應(yīng)用與應(yīng)用前景22sRNA的產(chǎn)生當病毒基因、人工轉(zhuǎn)入基因、轉(zhuǎn)座子等外源性基因隨機整合研究發(fā)現(xiàn), siRNA直接轉(zhuǎn)染動物細胞后通?？梢哉T導(dǎo)細胞內(nèi)到宿主細胞基因組內(nèi),并利用宿主細胞進行轉(zhuǎn)錄時,宿主細胞內(nèi)目的基因產(chǎn)生3~7d的高度的沉默,隨后 siRNA隨時間的延長常產(chǎn)生 dsrNa,隨即引發(fā)RNA沉默現(xiàn)象。最初RNA沉默現(xiàn)象是逐漸地被降解靶基因的沉默現(xiàn)象逐漸得到恢復(fù)基因沉默的效從植物的轉(zhuǎn)基因研究中發(fā)現(xiàn)的,被稱為“共抑制(co- upper-率主要取決于細胞增殖速度和 SiRNA的效能叫。目前, siRNA主simn)”現(xiàn)象。后來研究發(fā)現(xiàn)“共抑制”現(xiàn)象主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后的要是通過下面的五個途徑來獲得:(1)化學(xué)合成 SiRNA目前,RNA水平四。在研究粗糙紅色鏈孢霉菌時也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象,被以化學(xué)合成方法合成的 sirnA主要被用于體外培養(yǎng)細胞的短暫命名為阻抑作用( quelling)"。在研究線蟲的特異性基因時發(fā)現(xiàn)實驗。直接通過化學(xué)方法合成兩條互補的21~23mRNA單鏈,突也具有同樣的RNA沉默現(xiàn)象被命名為“RNA干擾”現(xiàn)象。隨后出端為DNA堿基,增加了 siRNA對RNae降解的耐受性,兩條RNA干擾倍受關(guān)注,廣泛的被研究應(yīng)用。在正常的生物體內(nèi)互補單鏈經(jīng)過退火形成雙鏈 siRNA或發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA,通過電轉(zhuǎn)RNA干擾起到抗病毒、抑制基因過量表達的作用。目前,RNA導(dǎo)或質(zhì)脂體的方法轉(zhuǎn)染給細胞,擁有效率高和對細胞毒害作用干擾技術(shù)被廣泛地用于功能基因的研究、腫瘤基因研究、藥物小的優(yōu)點轉(zhuǎn)染率通常可以超過70%,且實驗操作簡潔,利用化篩選等領(lǐng)域。對一個感興趣的基因的研究目前通常是通過兩種學(xué)合成 siRNA對靶基因沉默的維持時間也較為短暫,一般72h途徑:觀察感興趣基因的突變株的表型的變化或通過敲除或沉之內(nèi),但合成費用高,同時RNA較易被環(huán)境中的RNA酶所降默感興趣的目的基因觀察細胞表型的改變。在RNA被提出前,解所以對合成的條件和轉(zhuǎn)染時的操作有嚴格的要求,目前主要對感興趣的基因的沉默主要是通過反義技術(shù)來進行,但利用反用于已找到最有效的 siRNA情況下的實驗研究。(2)體外轉(zhuǎn)錄合義技術(shù)對目的基因進行沉默,不僅操作復(fù)雜、特異性差效率成 siRNA在體外,利用RNA聚合酶的T3或T7啟動子轉(zhuǎn)錄低。使用RNA技術(shù)沉默目的基因不僅操作較簡單,且有特異性合成兩條互補的21-23mRNA單鏈經(jīng)過退火形成雙鏈 siRNA,強效"發(fā)展,利用DNA載體和再轉(zhuǎn)染給細胞,同樣具有維持時間短暫的缺點,但較化學(xué)合成慢病中國煤化工建靶基因沉默穩(wěn)定株方法的費用較低,目前主要被用于最有效的 SiRNA的篩選。成為CNMH數(shù)2在腫瘤的研究方(3)用Dcer或RNaⅢ消化體外轉(zhuǎn)錄形成的dRNA選擇面RNA技術(shù)被廣泛地用于新的腫瘤治療靶基因的尋找新的200~1000mt的靶mRNA序列,體外轉(zhuǎn)錄制備長片段 dsrNa,然腫瘤藥物的研發(fā)、新的腫瘤藥物的作用靶點尋找和提高腫瘤細CHINA MODERN DOCTOR中國現(xiàn)代醫(yī)生153綜述·年11月第45卷第20期胞對抗腫瘤藥敏感性研究等口測。RNAi在抗病毒的研究中也有short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells[JI Proc著重要的意義目前RNA技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用于HⅣV研究和肝 Natl Acad Sci USA,20029996047-6052炎研究到。在藥物篩選方面,RNA被用于尋找新的藥物粑7 Yang D, Buchholz F, Huang Z et al. Short RNA duplexes produced by點和研發(fā)新的藥物等。隨著對RNAi的深入研究,RNAi的強hydrolysis with Escherichia coli RNase l mediate effective RNA inter-大的潛能正在被逐漸地發(fā)現(xiàn)和認識,盡管其目前仍存在較多ference in mammalian cells[]. Pmc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(15):的問題,如轉(zhuǎn)染效率低、穩(wěn)定性不高等,但隨著對其研究的深人,RNA技術(shù)將必定成為人類戰(zhàn)勝胂瘤、HV等疾病的強有18DhmE. Silver PA. Retrovinug-delivered siRNAJ)力的武器。2002,2(1:15.[19] Tiscomia G. Singer 0, Ikawa M, et al. A general method for gene參考文獻interfering RNA[. Proe Natl Acad Sci USA, 2003, 100(4): 1844-1848,[I] Fire A, Xu S, Montgomery MK, et al. Potent and specific genetic interfer- [20]Li M, Rossi JJ. Lentiviral vector delivery of siRNA and shRNA encodingce by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[]. Nature, 1998.genes into cultured and primary hematopoietic cells[]. Methods Mol Bi-391(6669)806-81ld,2005,309(1)261-2722]Plasterk RH. RNA silencing: thestem/Jl Science, [21] Fish R, Kruithof EK. Short-term cytotoxic effects and long-term insta-20022965571)1263-1265bility of RNAi delivered using lentiviral vector[I. BMC Mol BioL, 2004.[3] Sijen T, Fleenor J, Simmer F, et al. On the role of RNA amplification indsRNa -triggered gene silencingdJl. Cell, 2001, 107(4): 465-476[22] Napoli C, Lemieux C, Jorgensen R. Introduction of a chimeric chalcone[4] Lipardi C, Wei Q, Paterson BM. RNAi as random degradative PCR: siR-synthase gene into petunia results in reversible cosuppression ofNa primers convert mRNA into dsRNAs that are degraded to generatehomologous gene in trans[ Plant Cell, 1990, 2(4): 279-289new siRNA“cel2001,1073297-307[23] Cogoni C, Romano N, Macino G. Suppression of gene expression by ho-[5] Sundaram P, Echalier B, Han W, et al. ATP-binding cassettetransportersmologous transgenes[J) Antonie Van Leeuwenhoek, 1994, 65(3): 205-209Molecular Biology of the Cell, 2006, 17(8): 3678-3688.interfering RNAs in mammalian cells[l Science, 2002, 296(5567): 550-[6] Parker GS, Eckert DM, Bass BL, et al. RDE-4 preferentially binds longdsrna and its dimerization is neceasary for cleavage of dsRNA to siRNA[). [25] Harborth J, Elbashir SM, Bechert K, et al. Identification of essentialRNA,2006,12(5):807-818genes in cultured mammalian cells using small interfering RNAs J Cell[7 Tabara H, Sarkissian M, Kelly WG, et al. The rde-l gene, RNA interfer-Sei,2001,1l4(p24)4557-4565ance, and transposon silencing in C. elegans[l Cell, 1999, 99(2): 123-[26] Katome T, Ohata T, Matsushima R, et al. Use of RNA interference-medi-encing and adenoviral over expression to elucidate the roles[8] Tabara H, Yigit E, Simi H, et al. The dsrNa binding pmtein RDE-4of AKt/protein kinase B isoforms in insulin actions[]. J Biol Chem, 2003,interacts with RDE-1. DCR-l, and a DExH-box helicase to direct RNAi25,278(30:28312-28323in C Elegans[J]. Cell,2002,1097:861-871.[27] Yoshinouchi M, Yamada T, Kizaki M, et al. In vitro and vivo growth[9] Nishikura K. A short primer on RNA: RNA-directed RNA polymerasesuppression of human papillomavirus 16-positive cervicalacts as a key catalyst[]. Cell, 2001, 107(4): 415-418.by E6 siRNAU] Mol Ther, 2003, 8(5): 762-768[10] Vu-Dac N, Gervois P, Jakel H, et al. Apolipoprotein A5, a crucial de- [28] Shen C, Buck AK, Liu X, et al. Gene silencing by adenovirus-deliveredterminant of plasma triglyceride levels, is highly responsive tosiRNA] FEBS Lett12003.539(1-3)11l-14.peroxisome proliferators-activated reeeptor alpha activators[J]. J Biol 29] Nieth C, Priebsch A, Stege A, et aL. Modulation pf the classical mulChem,2003,27820:17982-17985tidnug resistance (MDR) phenotype by RNA interference(RNAi)Ul FEBS[11]Hannon GJ. RNA interference J ]. Nature, 2002, 418(6894):244-251Let2003,545(2-3)144-150.[12]Schwarz DS, Hutvagner G, Du T, et al. Asymmetry in the assembly of [30] Gin L Karelsky S, Andno R. Short intering RNA confers intracellularthe RNAi enzyme complexdJ] Cell, 2003, 115(2): 199-2antiviral immunity in humman cells[]. Nature, 2002, 418(6896): 430-[13]Khvorova A, Reynolds A, Jayasena SD. Functional siRNAs and miRNAshibit strand bias[J) Cell, 2003, 115(2): 209-216.[31] Capodici J, Kariko K, Weissman D. Inhibition of HIV-l infection by[14]Tusch T. Expanding Amall RNA interference[J. Nat Biotechnol, 2002,mall interfering RNA-mediated RNA interference[J]. Immunology 2002,20(5)446448.[5] Katoh T, Susa M, Suzuki T, et al. Simple and rapid synthesis of siRNA [32] Liu J, Guo Y, Xue CF, e al. Effect of vector-expressed siRNA on HBVderived from in vitro transcribed shRNa[L Nucleic Acids Res Suppl,中國煤化工 d J Gastroenter20040132003,(3)249-250[16] Yu JY, DeRuiter SL, Tumer DL RNA interference by expression ofCNMHG稿日期:2007-09-30)舟囂匱生 CH