刑事技術2012年第6期氣相色譜法同時測定血清中甲醇、乙醇、正丙醇郝紅霞],杜然,陳新明,趙敬真2(1.中國政法大學,證據(jù)科學教育部重點實驗室,北京100040;2.公安部物證鑒定中心,北京100038)摘要:目的建立氣相色譜同時測定血清中甲醇、乙醇、正丙醇含量的方法。方法改變氣相色譜條件,以異戊醇為內標,采用氣相色譜氫火焰離子化檢測器對血清直接進行檢測。并通過待測組分與內標物的響應值比進行定量。結果GC/FD法檢測血清中的甲醇、乙醇、正丙醇含量,得到了良好的線性關系。乙醇濃度從1~100mg/100mL的線性關系式為Y=0.4145X+0.0232(R2=0.9974)、濃度從100~100mg/100mL的線性關系式為Y=0.4511X+0.0746(R2=0.9911),甲醇濃度從1~200mg/100mL的線性關系式為Y=0.2778X+00493(R2=0.9983)。結論該方法操作簡便快速,重現(xiàn)性妤,通過檢測正丙醇還可以推斷腐敗血樣自身產(chǎn)生的乙醇量,是一種較為理想的血醇檢測方法。關鍵詞:甲醇;乙醇;正丙醇;血清;測定中圖分類號:DF795.1文獻標識碼:A文章編號:1008-3650(2012)06-0008-05Simultaneous determination of methanol, ethanol and propanol in blood by GC/FIDHAO Hong-xia, DU Ran, CHEN Xin-ming, et al. (Key Laboratory of Euidence Science(CUPL), Ministry of education, Beijing 100088, China)ABSTRACT: Objective To develop a method for simultaneous determination of methanol, ethanol and propanol in blood byGas Chromatography. Methods Conditions of gas chromatography were optimized and then blood serum samples were analyzedquantitatively by GC/FID. Results Linear relations of ethanol were Y-0. 4145X+ 0. 0232(R=0. 9974)for the concentrationranged from 1 to 100mg/100mL and Y=0.4511X +0.0746(R2=0.9911)fored from 100 to 1000100mL Linear relation of methanol was Y=0. 2778x-+0. 0493(R=0. 9983)for the concentration ranged from 1 to 200mg100mL. Conclusion This method can be applied in clinical diagnosis of poisoning and forensic analysis of alcohol in bloodKEY WORDS: Methanol; Ethanol; Propanol; Serum; Detection乙醇(分子式C2HO)俗稱酒精,是酒的主要成上2。以BAC值作為酒后駕駛和醉灑程度的判定分,乙醇進入空胃后,可于30min~90min內在胃及依據(jù),已廣泛為交警等執(zhí)法部門采用并被多個省市納腸道內被完全吸收入血,15min~9omin內,血液中酒人道路安全地方性標準。早期由于科技不發(fā)達,采用精濃度值( blood alcohol concentration,BAC)可達的多是化學法23進行檢測,隨之迅猛發(fā)展的是氣相到峰值1。其代謝主要是在肝臟內被氧化分解少色譜法,有頂空氣相色譜法,標準曲線色譜法7,部分以原形經(jīng)呼吸道、尿、汗直接排出體外。過量飲直接進樣色譜法012,酶檢測法31,分析儀器檢測用含酒精類飲料不僅可引起心腦血管消化、神經(jīng)系法以等。本文建立的氣相色譜同時測定血清中統(tǒng)等多種病癥,還可致駕駛員酒后動作失常、判斷思醇、乙醇、正丙醇含量的方法,是一種較為理想的血醇維能力下降,成為誘發(fā)道路交通事故的主要原因之檢測方法,報道如下。據(jù)相關部門統(tǒng)計2001年中國酒后駕車造成的死1材料和方法亡人數(shù)占到了道路交通事故總死亡人數(shù)的30%以1,1權器P2100氣相色譜儀,配有火焰離子化檢測器和基金項目:中國政法大學青年教師學術(創(chuàng)新團隊資助項目;中國色譜數(shù)據(jù)工作站。政法大學省部級合作項目(Na201123210044,2011-2321119)1.2試中國煤化工作者簡介:郝紅霞(1976—),女,內蒙古人,博士,主要從事毒空白卻CNMH(、異戊醇(內標)物分析工作。儲備液配制,所用標準均為優(yōu)級純,采用重蒸餾水或Tel:010-68645052;E-mail:haohx(@126.com去離子水刑事技術2012年第6期1.3色譜條件表1甲醇、乙醇混標系列色譜柱: DM-WAX30m×0.25mm×0.25m彈混標種類甲醇標液4.0mg/mL性石英毛細柱。加標液0.250.751.251.752.252.50進樣口溫200℃,檢測器溫FID220℃,柱溫95℃體積(mL(5min)→5C/min→110C(omin)→30℃/min→呈現(xiàn)濃度0.21.01.4220C(0.5~1min),載氣高純N299.999(mg/mL)柱流速1mL/min,恒壓,分流比10:1,尾吹氣混標種類29mL/min;H230mL/min;空氣30mL/min乙醇標液2.0mg/mL4儲備液配置加標液0.250.751.251.752.252.50體積(mL)用移液器分別準確吸取無水甲醇1.26mL、(相對密度0.7913)無水乙醇1.26mL(相對密度0.7893)、呈現(xiàn)濃度0.10.20.40.60.81.0正丙醇1.240mL(相對密度0.8037)于50mL容量瓶(mg/mL),異戊醇1.230mL(相對密度0.8110)于250mL容量瓶中,用重蒸水稀釋至刻度,混勻,分別得濃度為(4)各標準系列儀器分析試樣制備:準確吸取各20.0mg/mL的甲醇、乙醇、正丙醇標準儲備液,標準系列200L,加0.4mg/mL異戊醇內標液80L4.0mg/mL異戊醇標準儲備液,置4℃冰箱保存(可混勻,備檢做標準曲線。保存1年)1.6.2乙醇1~10mg/mL和正丙醇0.8~4mg/mL1.5醇混標溶液的配制混標系列(1)乙醇和正丙醇單標液準備:直接用1.5.1甲醇、乙醇、正丙酶混標液準確吸取甲醇20mg/mL乙醇單標儲備液和20mg/mL正丙醇單標儲液1.oonL,乙醇儲液1.00mL,正丙醇儲液儲備液配制。0.50mL同于10mL容量瓶中,加去離子水至刻度混(2)混標系列配制:取5mL的容量瓶6個,從低勻,即得甲醇20mg、乙醇2.0mg、正丙醇1.0mg/mL濃度到高濃度編號后備用。分別取乙醇2mg/mL混合標準溶液。使用期3個月。臨用時將該混標液和正丙醇20mg/mL單標儲備液一定量于系列容量按比例稀釋10倍后,得濃度甲醇0.2mg、乙醇瓶中,最后加去離子水至刻度混勻后備用。各系列濃0.2mg、正丙醇0.1mg/mL混標液,供儀器的定性分度所用乙醇和正丙醇單標液見表2析用表2乙醇、正丙醇混標系列1.5.2含內標異戊醇的醇混標液準確吸取混標種類乙醇標液20mg/mL4.0mg/mL異戊醇儲備液1.0mL于10mL容量瓶加標液751.251.752.252.50中,加去離子水至刻度,混勻后得0.4mg/mL異戊醇體積(mtL)內標液(使用期1個月)。準確吸取甲醇0.2mg、乙醇0.2mg、正丙醇0.1mg/mL混標液200μL,加0.4mg/系列濃度1.026.010.0(mg/mL)mL。異戊醇內標液800μL混勻獲得。本混標液供考查儀器的穩(wěn)定性和靈敏度使用,臨用時配制混標種類正丙醇標液20mg/mL1.6定量曲線標液系列的配制加標液0.200.400.600.800.901.001.6.1甲醇0.2~2.0mgmL和乙醇0.1-1.0mgmL體積(mL)混合標準系列(1)甲醇、乙醇單一標準液:準確量取系列濃度0.801.602.403.203.604.00甲醇、乙醇儲備液一定量,用去離子水稀釋后獲得甲mgm)醇4.0mg/mL和乙醇2.0mg/mL的備單標液(2)混標系列配制:取5mL的容量瓶6個,從低(3)0.4mg/mL異戊醇內標液:配制方法見1.6.1。濃度到高濃度編號后備用。分別吸甲醇4.0mg/mL(4)各標準系列儀器分析試樣制備:準確吸取各和乙醇2.0mg/mL單標液各一定量于系列容量瓶標準系列200L,加0.4mg/mL異戊醇內標液800L中,最后用去離子水至刻度混勻后備用,各系列濃度混勻,備標中國煤化工所需甲醇、乙醇單標液體積見表1。17檢血訂CNMHG(3)0.4mg/mL異戊醇內標液:取4.0mg/mL異1.7.1檢最取送橙皿秤1~zmL,于300/min下戊醇儲備液一定量稀釋10倍獲得,臨用時稀釋。離心5min,上清液備用。刑事技術2012年第6期l.7.2配樣準確吸取檢血離心5min后的上清液中乙醇的濃度(mg/mL)。200L于1~2mL的試管中,加0.4mg/mL異戊醇內相對相差計算公式如下:標液800uL,混勻后供儀器分析。每一個檢材必須配相對相差(%)=⊥C1=C2×100制2~3份試樣,求各試樣的定量數(shù)據(jù)的平均值作為C檢材的定量值式中:C、C2為兩份檢材平行定量結果,C為兩1.73空白血添加乙醇試樣的制備取加過抗凝劑份檢材平行定量結果的平均值,即.(C1=C2)的空白血4.0mL,加人20mg/mL乙醇儲備液1.omL,輕搖混勻30min以上得血中乙醇濃度3結果與討論4.0mg/mL添加標準血樣。取該血樣一定量配制成3.1線性關系0.20,0.50,0.80mg/mL乙醇濃度血樣。各標準的保留時間參考值及定量曲線見表3及取上述0.2,0.5,0.8mg/mL乙醇濃度血樣于圖1~圖4。乙醇的定量限為0.10m300/min離心5min,上清液取200L,加入800L表3各醇在GC/FID上的Rt值(0.4mg/mL)異戊醇內標液混勻供儀器分析,以準確序號藥物名稱保留時間(Rt值,min)定量檢材中乙醇用量。添加血試樣必須做2份以上甲醇重復,以保證定量數(shù)穩(wěn)定。乙醇5.072方法5.802.1進樣異丙醇8.20設定乙醇優(yōu)化后的分析條件,待儀器處在 Ready狀態(tài)時,連續(xù)進樣乙醇0.2mg、甲醇0.2mg、正丙醇0.1mg/mL混標液,考查儀器靈敏度狀態(tài)和穩(wěn)定性,般進行3~4次重復考量。之后再以乙醇0.5mg、甲醇0.5mg、正丙醇0.2mg/mL混標液200L,加人800L0.4mg/mL異戊醇內標液混勻制成的試樣,進樣3~4次,依各醇與內標的峰面積比值是否一致考查儀器的穩(wěn)定狀態(tài)。2.2標準曲線的制作當儀器處于優(yōu)化后的最佳狀態(tài)時,將配制好的標準系列依次分析,每次進樣1L,每個試樣進樣2~3次,以甲醇、乙醇、正丙醇各自濃度下的峰面積與內標峰面積比值的平均值為縱坐標,以繪制該醇的濃度為圖14種醇的分GC/FID分離圖橫坐標,繪制各定量醇的標準曲線。2.3檢材血樣分析2.3.1定性和粗定量儀器在優(yōu)化穩(wěn)定狀態(tài),取檢Y=04145x+00232血試樣1L進樣,每個試樣進樣2~3次。計算檢血中可疑組分的Rt值平均值,與標準的Rt值作比較,P以Rt值的一致性定性。求出檢血中乙醇與內標物異戊醇的峰面積比值平均值,查曲線計算出檢血中乙醇的濃度。其他甲醇或正丙醇含量依次類推。23.2準確定量根據(jù)查標準曲線獲得的檢血中乙醇的濃度,配制相應濃度的添加血樣后制成儀器分析濃度(mg/mt)試樣,再經(jīng)儀器分析、統(tǒng)計,計算得出檢血中乙醇的標圖2低濃度乙醇的定量曲線準定量數(shù)據(jù)。233定量計算公式W乙那=A/AXC標,式中:3.2定性中國煤化工W乙根為檢血中乙醇的濃度(mg/mL),A指檢血中乙3.2.1定CNMHG或甲醇的色譜峰醇與內標異戊醇的峰面積比值,A指空白添加血中而見內標H,且囚懷徹的色譜峰的峰面積乙醇與內標異戊醇的峰面積比值,C標為空白添加血值與往常相近,說明儀器狀態(tài)正常,可判定檢血中不刑事技術2012年第6期2份檢材試樣定量數(shù)據(jù)的相對相差不得超過10%定y=04511x*D0746量結果的報出以2份試樣定量數(shù)據(jù)平均值為準。超R=0.9911過10%相對相差的定量結果不準確需重新定量(2)本方法采用血樣直接進樣方法檢驗甲醇和乙醇,因此,必須考慮送檢血樣是否加抗凝劑。加入抗凝劑的檢材血樣可以直接報告定量結果。未加抗凝劑的檢血樣定量結果代表著檢血中血清中的血醇濃濃度(mgmt)度,不能代表全血的濃度。根據(jù)人體中血清占全血的圖3高濃度乙醇的標準曲線比例約在60%左右,因此報出血醇定量結果應在定量數(shù)據(jù)上乘以80%的系數(shù),使血醇的濃度更加接近全血濃度3.3腐敗血中乙醇的判定(1)血液腐敗可生成乙醇,因此在測定腐敗血時注意:腐敗血生成乙醇的同時,也平行的生成正丙醇,03因此檢血中檢出乙醇,而未檢出正丙醇者,此時檢出的乙醇可以認為非血液腐敗產(chǎn)生的乙醇2)腐敗血液中檢出乙醇的同時,也檢出正丙醇,2.0此時對血液中乙醇含量評判為:第一,血液中乙醇的濃度,(mg/mL)含量在正丙醇含量的20倍以下,此時應考慮為血中圖4甲醇標準曲線乙醇由腐敗而產(chǎn)生,判為陰性。第二,血中乙醇的含量高于正丙醇含量20倍以上,此時則認為血中乙醇由血液腐敗和非血液腐敗兩部分組成,非血液腐敗的y=05161X*001750.9963乙醇含量計算,可將檢出乙醇的濃度值減去相當20倍正丙醇濃度的乙醇濃度值,余下值則是血中乙醇濃度的下限值。3.4定量結果的不確定度中國交通法規(guī)給出20mg/mL酒后駕車和0.180mg/mL醉酒駕車的評判閾值。因此當定量結果血030中濃度為0.2mg/mL和0.8mg/mL附近值時,必須給出定量結果的不確定度值。所以,在收到檢測血醇5正丙醇標準曲線含量的檢材后應立即實施檢驗,以保證血中乙醇含量檢測的真實性。含甲醇或乙醇成分。(2)以異戊醇為內標計算色譜3.5實驗室能力驗證結果評價峰的相對保留時間,與乙醇或甲醇對內標物異戊醇的本實驗室已經(jīng)連續(xù)兩年參加酒精的實驗室能力相對保留時間比較,誤差小于2%時,可以確定檢材驗證活動,均取得滿意的評價。能力驗證( Proficient中含乙醇或甲醇;大于2%時不可認定。(3)如果檢 cy Testing)是利用實驗室間比對來判定實驗室和檢血試樣中未出現(xiàn)內標物色譜峰或峰面積值不近似于查機構能力的活動,也是認可機構加入和維持國際相往常,檢驗結果無效,應檢查原因,重新檢驗。(4)本方互承認協(xié)議(MRA)的必要條件之一。以2011年為法檢測血液中檢出限:甲醇、乙醇均為0.05mg/mL,檢例,能力驗證提供方提供兩個待測血樣,要求對血液材中乙醇含量低于10mg/100mL時,建議不給出定中的乙醇含量進行檢測。依照上述方法,本實驗室就性定量數(shù)據(jù),檢驗結果判為陰性。兩個待測組分進行檢測,并監(jiān)控正丙醇的含量以確3.2.2定量(1)檢材血應平行制樣,測2份以上,保精確的測量乙醇,得到驗證方的反饋結果見表4中國煤化工CNMHG刑事技術2012年第6期表4實驗室能力驗證結果評價樣品編號實驗室結果測試中位值樣品均值與中位值實驗室間實驗室內(mg/mL)(mg/mL)相對偏差(%)z比分數(shù)(ZB)z比分數(shù)(zW)樣品1測試10.64測試2平均值樣品2測試10.238.000.14測試20.23平均值綜合評價:樣品1和樣品2的實驗室間z比分數(shù)(ZB)和實驗室內z比分數(shù)(Zw)絕對值均小于等于2,且測試數(shù)據(jù)平均值與中位的相對偏差絕對值小于等于10%。綜合評價結果:滿意參考文獻phy with direct on-column injection [J]. Journal of[1]白璐,廖林川,顏有儀等.乙醇相關問題的綜合探討[JChromatography, 1991, 570: 406-411刑事技術,2004(2):25-27.[12]周華芳胡勇,王鳳,等,直接進樣毛細管柱氣相色譜[2]李世杰,鄭雯,馮其光.血液中乙醇濃度檢測方法[J].法快速測定全血中乙醇含量[J.中國衛(wèi)生檢驗雜志預防醫(yī)學情報雜志,2007,23(1):124-1262007,17(9):1568-1569[3]左保林.人血中乙醇含量的分光光度法檢測[J]J.刑事[13]王向陽,乙醇氧化酶法測定血清中乙醇含量[J].臨床技術,1995(2):12-13.檢驗雜志,2002,20(4):208-210.[4]金念祖,趙人玲,戴建國,等,頂空氣相色譜法同時測定[14]伏建峰,史清海,路西春,等.乙醇脫氫酶法測定血漿血中乙醇和乙酸基[·南京醫(yī)科大學學報,1994,14中乙醇[]西北國防醫(yī)學雜志,2005,26(5):345-347(2):146-148.[15]胡云良,劉曉琴,沈財成,等.乙醇氧化酶兩點速率法[5]雷紅偉,高鐵祥,田先翔,等,頂空氣相色譜法測定小鼠測定血清微量乙醇[].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2006,16血液中乙醇的濃度[]湖北中醫(yī)學院學報,2007,9(2)(9):1054-105637-38.16]胡云良,王慧燕,張立,等,改良乙醇脫氫酶法測定血[6]周枝鳳陳凌云,沈梅,等.自動頂空氣相色譜質譜法清中微量乙醇[].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2008,18(1):測定血液中乙醇含量[J].理化檢驗化學分冊,2010,4647-49.(1):2224.[17]彭又生,蔡平金,陳思穎,等,多層膜干片法測定血清[7]黃誠,盧麗明,劉國平.內標法和外標法測定血液中乙酒精濃度的方法學探討[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學,2007,34醇含量的比較分析[N].生命科學儀器,2008,(3)(7):1341-1343.[8]賀東霞.內標曲線法測定血中乙醇含量的優(yōu)勢[J].中[18]周方滿,趙筆輝,吳建平,等.干化學法檢測血乙醇濃國衛(wèi)生工程學,2010,9(2):142-144度的影響因素分析[].現(xiàn)代實用醫(yī)學,2010,22(12):[9]劉軍生,杜書明,錢義.血清中甲醇和乙醇的氣相色譜1347-1348法測定[.中國勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志,2005,23(1):69-19] Hitoshi Biwasaka, Takuya Tokuta, Yoshitoshi Sasaki,e70.al. Application of quantitative ethanol detector( QED)[10]羅赟,岳蘊瑤,李大春.血液中乙醇含量測定方法的研test kitto measure ethanol concentration in blood samples究].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2010,20(8):1897-1898LJ. Forensic Science International, 2001, 124: 124-129[11] Gary M. Pollack, Jodi L. Kaw Aagoe. Determination of收稿日期:201208-20methanol in whole blood by capillary gas chromatog(上接第7頁)Bio.2003,63(3):191-205[7] Wang T, Xue N, Birdwell J D Least-square deconvolu- [10] Gill P, Sparkes R, Pinchin R, et al. Interpreting simpltion: a framework for interpreting short tandem repeatSTR mixtures using allele peak areas[j]. Forensic Sci Imixtures. J Forensic Sci, 2006, 51(6): 1284-1297l998,91(1):41-53[8] Swgdam Short tanderm repeats(STR)interpretation [11] Perlin中國煤化工 re analysis: a mathe-guidelines. Forensic Sci Comm, 2000, 2(3)maticTHCN G DNA samples[J[9 Mortera J, Dawid A P, Lauritzen S L Probabilistic ex-j Forensic Sci,2001,46(6):1372-1378.pert systems for dNa mixture profiling]. Theor Popul收稿日期:2012-10-19