●210●中國生物制品學(xué)雜志2001年第14卷第4期Chnin J Bidogpcie 2001,0 V01.14.No.4聚乙二醇活性酯對(duì)干擾素azn化學(xué)修飾的初步研究劉麗軍趙麗純朱迅(吉林大學(xué) ,長(zhǎng)春130021)石曉麗劉丹張巖張雪梅盛軍(長(zhǎng)春生物制品研究所,長(zhǎng)春130062)[摘夔]目的探討聚乙二醇活性酯(mPEC - ss MW 5000和MW 2000)0飾重組人干擾索啦(hIFN a )的最佳反應(yīng)條件。方法在不同反應(yīng)條件下 ,用聚乙二醇活性酯修飾dlENar采用VsV - Wish細(xì)胞病變抑制法測(cè)定修飾后thIFNas的生物學(xué)活性。結(jié)果隨著PEG對(duì)dhIFNias 摩爾比的增加或修飾反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),tJFNou的修飾產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量和不均一-性增 加，且隨著rhlFNos修飾度的提高,其生物學(xué)活性逐斷降低。結(jié)論初步確立了 PEC修飾thIFNcr的反應(yīng)條件,反應(yīng)摩爾比與聚乙二醇活性酯的相對(duì)分子質(zhì)量是影響反應(yīng)的關(guān)鍵因素。{關(guān)鍵詞]聚乙二醇活性酯 tuFNos, 化學(xué)修飾Chemical Modification of rhUFNaxo with Activated Polyethylene GlycolLU Lijun,ZHAO Lichun,ZHU Xun et al( Basic Medical School of Jilin Uniersity , Changchun 130021)[Abstract] Objective To explore the oplimal condition of modifing thlFNas by activaled polyetbyleneelycol with relative molecular 0q9999qq9 wexjights of 500 and 2000. Methods thIFTNas was modified withactivated plyehylene gyol under various conditins, and the bioactivity of the modifiedl IFNaxs was analyed byVSV- Wish system. Results Along with the increase of the ratio of PEC to hIFNash as well as he reactiontime. ,the relative molecular weight and inongneity of the nodified thIFN咖were also incrxsed. And the bio-activity of PEG - hIFN QB was reduced with the improvement of modification degree. Conclusion The optimalcondition of modifying hIFN咖with ativated plyethylenc g!ycol is prelininaily determined. The molar ratio ofPEG to hIFN and the relative molecular weight of PEG play important rules in he modifcation.[ Key words ] Activated polyethylene glycol hlFNax Chemical mdification干擾素([FN)是由細(xì)胞分泌的一類誘生性蛋白為991029- 5,由長(zhǎng)春生物制品研究所提供;質(zhì),具有廣譜的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能"',1.2 PEC活性酯( MW5000和MW20000)購自是目前公認(rèn)的最為有效的抗病毒藥物之一。目前全Signa 公司;球有60多個(gè)國家和地區(qū)應(yīng)用干擾索制劑治療大約1.3 CM - Sepharose F為Phamnacia公司產(chǎn)品;30多種疾病,取得了良好的治療效果。但長(zhǎng)期使用1.4Wish細(xì)胞及VSV病毒由長(zhǎng)春生物制品研IFN易產(chǎn)生抗體,且因其相對(duì)分子質(zhì)量小,在體內(nèi)易究所提供。經(jīng)腎小球?yàn)V過排泄,導(dǎo)致其半衰期短,影響療效。利2.方法用一些無毒H水溶性好的免疫惰性大分子聚合物2.1 rhlIFNcqp 和PEG( MW5000)投料摩爾比對(duì)修(如PEG等)對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾可改變其相對(duì)分子飾產(chǎn)物的影響:二者的摩爾比分別為1:5、1:10.1:15質(zhì)量及免疫原性,從而使修飾蛋白在循環(huán)中半衰期和1:30反應(yīng)2h后,0.5%冰醋酸終止反應(yīng),取樣作明顯延長(zhǎng)2。本研究采用PEC活性酯修飾SDS - PACE,并測(cè)定其生物學(xué)活性。h[FNay ,并對(duì)不同修飾條件下得到修飾產(chǎn)物的相對(duì)2.2 rhIFNa 和PEC( MW5000)反應(yīng)時(shí)間對(duì)修飾分子質(zhì)量和生物學(xué)活性進(jìn)行研究,以便選擇最佳修產(chǎn)物的影響:于hIFNas溶液中按1:10摩爾比加入飾條件.提高thIFNa>b 的藥效作用。PEC(MW5000) ,反應(yīng)時(shí)間分別為1.2和4h,取樣作材料與方法中國煤化工個(gè)影響:于hIFNas溶1.材料w5000),反應(yīng)pH分1.1 IFNap半成品,效價(jià)為Ix 10IU/ml,批號(hào):fYHCN M H G 2h，,取樣作SDS-中國生物制品學(xué)雜志2001年第14卷第4期Chin J Ridogcule 2001. Vol.14.No.4●211●PAGE,并測(cè)定其生物學(xué)活性。2.在pH8.5-9.5范圍內(nèi).PEC與hlFNas的摩2.4 PEG 相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)修飾產(chǎn)物的影響:選爾比為10:1時(shí),反應(yīng)產(chǎn)物無顯著變化.均主要顯示擇pH9.0. PEC( MW5000)和PEG( MW20000)分別與相對(duì)分子質(zhì)量29000和19000兩條帶。在pH8. 5.9.hIFNa,反應(yīng)2h終止,取樣作SDS-PAGE,并測(cè)定其0和9.5反應(yīng)時(shí)間為2h時(shí).其中相對(duì)分子質(zhì)量29000生物學(xué)活性。.的修飾蛋白分別占總蛋白的30%、33%和30%。表2.5 PEC - FNar的分離純化:以CM - Sepha-明當(dāng)溶液在pH8.5-9.5的范圍內(nèi),在其他反應(yīng)條件rose FF為層析介質(zhì),20mmol/L NaAc - HAc (pH5.0)一致時(shí),其反應(yīng)產(chǎn)物差異無顯著意義。為洗脫液,柱層析法純化反應(yīng)產(chǎn)物。3.在plH9.0,PEC與rhlFTNasn投料摩爾比為10:12.6生物學(xué)活性測(cè)定;采用細(xì)胞病變抑制法時(shí),不同時(shí)間取樣,經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè),反應(yīng)至2h(CPE)2] ,以Wish - VSV為基本檢測(cè)系統(tǒng),用國家參時(shí),相對(duì)分子質(zhì)量29000 的修飾蛋白占總蛋白含量考晶校準(zhǔn)為IU,應(yīng)為其標(biāo)示量的75% ~ 150%。達(dá)最高(33%),再增加時(shí)間彌漫帶明顯增加.見圖2.7蛋白含量測(cè)定:按2000年版《中國生物制2。品規(guī)程>中微量法(Lowy)的要求進(jìn)行。M結(jié)果97 00066 0001.隨著PEG(MS000)對(duì)thIFNap投料摩爾比的43 000增加,修飾產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量和不均一性增加。經(jīng)34 700SDS - PAGE測(cè)定,未經(jīng)PEG修飾的rhIFNc2r顯示兩條21 000帶,相對(duì)分子質(zhì)量分別為19000和380(為thlFNan的14 400二聚體,含量<5%),當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為2h, PEC與hIFNag摩爾比為5:1時(shí),反應(yīng)混合物主要示有相對(duì)分子質(zhì)量29000和19000兩條帶和一-些相對(duì)分子質(zhì)量大圖2 PHG與rhIFNm不同反應(yīng)時(shí)間的修飾產(chǎn)物sIs- PAGE的彌漫帶,其中相對(duì)分子質(zhì)量29000的為修飾蛋白，F(xiàn)ig 2.SDS - PAGE profle of rhIFN始modifed by PEG占總蛋白的19%。當(dāng)二者摩爾比為10:1 時(shí),反應(yīng)混at diferent reaction time合物亦主要示有相對(duì)分子質(zhì)量29000和19000兩條帶5, rhlFNics ;4, standard protein marker; The reaction tine和一些相對(duì)分子質(zhì)量大的彌漫帶,但相對(duì)分子質(zhì)量of lanes 3,2 and 1 are lh,2hand 4h respectrely.2900的修飾蛋白占總蛋白的33%。當(dāng)二者摩爾比為15:1和30:1時(shí),反應(yīng)產(chǎn)物中大于相對(duì)分子質(zhì)量290004.以PEC( MW5000)和PFC( MW20000)分別修的彌漫帶明顯增多,見圖1。表明摩爾比是影響反應(yīng)飾HIFNan ,得到以相對(duì)分子質(zhì)量2900和60000為產(chǎn)物的一個(gè)重要因素。主的修飾蛋白,PEG(MW0000)修飾所得的相對(duì)分子質(zhì)量6000蛋白占總蛋白的52% ,并且相對(duì)分子質(zhì)量60000的修飾蛋白生物學(xué)活性高]相對(duì)分子質(zhì)量29000修飾蛋白。5. PFEG( MW20000)與nhIFNarp 反應(yīng)混合物經(jīng)CM-Spharose純化后得4個(gè)洗脫峰,峰1為術(shù)結(jié)合的PEC,峰2為過度修飾的產(chǎn)物,峰3為PEC - IFNaw(約MW0000) ,峰4為未經(jīng)修飾的IFTNas,見圖3。1234566.所得的修飾產(chǎn)物中IFN生物學(xué)活性隨著修圖1 PeG 與hNn不同你比的修飾產(chǎn)物SIS-PAGE飾后相對(duì)分子質(zhì)量的增加而降低。修飾前hIFNasFig 1.SDS- PAGE prolGle of rhuIFN Crb mdified by DEG的比活性為1x 1o0*IU/ng,相對(duì)分子質(zhì)母6000的修a dferentt molar ratios飾蛋白比活為1 x 10' IU/mg,相對(duì)分子質(zhì)量29000的1,standard poteio marker;2, rhINa2.The molar ratios修飾中國煤化工of PEG to hIFNiam in the lanes 3,4,5 and 6 are 5:1,10:1,15:YHCNMHG1 and 30:1 respectively.212●中國生物制品學(xué)雜志2001年第14卷第4期(hin J Roioicels 201.0 Val .14.No.4對(duì)IFTNaz2投料摩爾比的增加,修飾蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量增加,hIFNaxb的修飾度亦增加，且修飾的不均一性也增加,但hIFNarb的生物學(xué)活性保留亦下降,這與Tsusumi等用PEG活性酯修飾TNFa時(shí)觀察到的結(jié)果相似'5]。因此,從修飾所帶來的rhlPNagn相對(duì)分子質(zhì)量的增大程度和修飾后hIFNap生物學(xué)活性保留程度看,相對(duì)分子質(zhì)量大的PEG優(yōu)于相對(duì)分子質(zhì)量小的PEG。據(jù)此,我們選用了PEG活性酯的相對(duì)分子質(zhì)量為0000。1234在堿性條件下,偶聯(lián)反應(yīng)易于發(fā)生,即PEC的活性高;在酸性條件下,偶聯(lián)反應(yīng)終止。但在堿性條圈3修飾產(chǎn)物的純化件下.隨著pH的升高, PEG活性酯水解亦加快。本Fig 3. Purication of modification products文的修飾反應(yīng)最終確定在pH9.0的硼酸鹽緩沖液中進(jìn)行,在該pH下，反應(yīng)時(shí)間為2h時(shí),單個(gè)PEC-討論IFNg得率最高。同時(shí), PEC活性酯與FNQs在堿性hIFNa2相對(duì)分子質(zhì)量為1900, 屬小分子蛋白，條件下反應(yīng)時(shí),雖然PEG是過量的,但易降解,因易經(jīng)腎小球?yàn)V過,并易被血液中的胰蛋白酶等降解,此,延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間對(duì)修飾反應(yīng)影響不大。在相對(duì)分子質(zhì)量15000 ~ 70000的范圍內(nèi)，腎臟清除日前,對(duì)修飾產(chǎn)物生物學(xué)功效的研究還在深入小分子蛋白質(zhì)的速率與其相對(duì)分子質(zhì)量大小呈負(fù)相進(jìn)行,相關(guān)結(jié)果將另文發(fā)表。畚考文獻(xiàn)應(yīng)用線性的免疫惰性大分子PEC與蛋白質(zhì)的非必需基團(tuán)共價(jià)結(jié)合,其相對(duì)分子質(zhì)量大大提高,不「1} lee V HL. Ppuide und prtein dng dererepcutrubcao exd cllage.Pharm In, 1986,8:208 -211.易被腎小球?yàn)V過。蛋白質(zhì)經(jīng)PEG修飾后,形成一種[2] Jeng sT. Byun SM, Deuresed aluiniuilit d nxtxy - plytbylare屏蔽,使它作為異源物質(zhì)不被識(shí)別,不容易產(chǎn)生相應(yīng)dyol atarhed rod blood clls: sgifcaute因a blod substitue Atirt抗體,抑制了相應(yīng)的免疫反應(yīng),因而通過免疫反應(yīng)被Cells Hlod Subtit lnxbsil Biocchmol. 196.24:503 -511.清除率亦降低,同時(shí)由于這種遮蔽作用使蛋白質(zhì)不[3]中國生物制品規(guī)程(-部).1995,257.易被蛋白酶降解'。而且PEG無毒性,是FDA批準(zhǔn)[4] Fonry RE. Chenical mdificarin of poiein: commenrs and persoc-fivs. Int Pep Protein Res, 1987 ,29:;145- 158.的可用于人體的聚合物，在體內(nèi)不會(huì)進(jìn)行生物降解[5] Tatsemni Y,Kihin S.Tunode Hea al Mcecalar Deign d Hsbrid Tu.產(chǎn)生有毒衍生物,相對(duì)分子質(zhì)量小的( < 5000)PEGmor Necrois Factor - a Has Mekedly Fnhanoed Aniunor Potency due可由腎臟直接排出。因此,PEG化學(xué)修飾蛋白質(zhì)具to Longer Pasanre Hulf- lie and Higher Tumort Auuiation. Phama有較高的應(yīng)用價(jià)值。Exp Ther, 19.6278:10060- 1011.(收稿日期:2001-11- 12)研究表明,影響修飾反應(yīng)的關(guān)鍵是反應(yīng)摩爾比和PEG的相對(duì)分子質(zhì)量。隨著反應(yīng)中PEG活性酯中國煤化工MYHCNMHG