第29卷第5期福州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)Vol. 29 No.5_2001 年10月Jourmal o[ Fuzhou University( Natural Science)Oct.2001文章編號(hào):1000- 2243(2001)05 - 0123 -04聚乙二醇一步沉淀提取卵黃抗體王輝龍，周建武，王中來(lái),饒平凡.(福州大學(xué)生物工程研究所,福建楣州350002)摘要:利用聚乙二醉一步沉淀法提取卵黃抗體.當(dāng)聚乙二醇濃度為5%時(shí)，可獲得66%抗體回收率,抗體純度達(dá)92%;當(dāng)聚乙二醇濃度為10%時(shí)，抗體純度為85%，但可獲得99%的抗體回收率，且抗體活性沒(méi)有損失.關(guān)鍵詞:卵黃抗體;聚乙二醇;沉淀;提取中圖分類號(hào): TQ936.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A經(jīng)抗原免疫的母雞能將體內(nèi)的抗體傳遞到雞蛋的卵黃中，從卵黃中提取的抗體稱為卵黃抗體(IgY).IgY與哺乳類動(dòng)物血清中分離的抗體相比具有許多突出的優(yōu)點(diǎn).如來(lái)源廣、費(fèi)用低、作為免疫檢測(cè)試劑時(shí)，不會(huì)激活補(bǔ)體1、不會(huì)與類風(fēng)濕因子結(jié)合[2]等.近年來(lái)，在卵黃抗體的純化方面已進(jìn)行了大量的研究[3-8),通常是在制備水溶性蛋白組分后,采用多次沉淀初步分離抗體,再應(yīng)用各種色譜進(jìn)行純化.這些方法在獲得IgY純度和活性方面有其優(yōu)點(diǎn),但是包括了很多耗費(fèi)時(shí)間的步驟，如多次鹽析,乙醇沉淀，凝膠過(guò)濾，色譜和滲析等,不易規(guī)?；a(chǎn)，本文報(bào)道了-種簡(jiǎn)單的提取卵黃抗體的方法.在制備水溶性蛋白組分后，用低濃度聚乙二醇(PEG)一步沉淀提取卵黃抗體,在不經(jīng)色譜分離的情況下取得滿意的純度和活性.1材料與方法1.1 試劑與材料嗜水氣單胞菌株(福建省農(nóng)科院生物中心); PEG(分子量為6000,華美生物工程公司);堿性磷酸酶標(biāo)記的抗IgY二抗(兔抗雞二抗, Sigma); 磷酸對(duì)硝基苯酯二鈉(0364 - 5G, AMRESCO); 翅濾膜(SMB -20型，中科院上海原子核研究中心); TSK G3000SW(TOSOH corporation).1.2抗原的制備保存的嘈水氣單胞菌株經(jīng)活化后接入普通培養(yǎng)基，在37C下培養(yǎng)48h,離心(10 000 r/min, 4C，3min)收集菌體，經(jīng)生理鹽水洗許3次后,用0.5%甲醛滅活過(guò)夜，經(jīng)洗滌后，用生理鹽水調(diào)節(jié)菌體依度為1X 109 efu/ mL.1.3免疫將包含1x 109 cfu/mL的菌液與等體積的完全福氏佐劑充分混合形成油包水體系，四點(diǎn)注射法對(duì)母雞進(jìn)行初次免疫，每次1mL.2周后，以不完全福氏佐試劑代替完全福氏佐試劑進(jìn)行二次免疫,每周1次，持續(xù)3周. ELISA檢測(cè)特異性卵黃抗體的效價(jià).初次免疫后開(kāi)始收集雞蛋, 4七保存?zhèn)溆?1.4 水溶性蛋白組分的制備將免疫后的雞蛋蛋贊液用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(0. 04 mol/L, pH6.0)稀釋10倍[9], 4乜下靜置過(guò)夜，沉降后的上清液加助濾劑經(jīng)0.22 pm膜上過(guò)濾，濾液經(jīng)截留分子量為70 000的超濾膜超濾脫鹽濃縮8倍制備成水溶性蛋白組分(WSF).最后添加0.02%的迭氮鈉于4個(gè)下保存.1.5 卵黃抗體的分離純化S mL WSF中,加入4%至10%不同濃度的PEG,完全混合溶解后在4七下靜置30 min,然后在4七下，用10000 r/ min轉(zhuǎn)速離心6 min,收集沉淀，溶解于5 mL的蒸餾水中,用于隨后的分析.收稿日期: 2001 -03-21作者簡(jiǎn)介:王輝龍(1976-),男，碩士.中國(guó)煤化工MHCNMH G福州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)第29卷1.5.1抗體回收率及純度分析樣品用高壓液相色譜法進(jìn)行分析，色譜柱是TSK G3000SW,在室溫下，流動(dòng)相為含0. 1 mol/L硫酸鈉的磷酸鹽綬沖液(0.1 mo/L, pH7.0), 流速為0.5 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm.抗體的回收率和純度分別按照下面公式計(jì)算:R抗體= (A抗體/Awsr) x 100%P抗體= (A抗體/A總崍) x 100%其中: R抗體是抗體的回收率(%), A抗體是純化后樣品的抗體峰面積, Awsp是水溶性蛋白組分中抗體的蜂面積，P抗體 是抗體的純度, A總峰是純化后樣品中所有峰的總面積.1.5.2特異性抗體 ELISA的檢測(cè)特異性抗體活性的檢測(cè)參照Cost10]的方法進(jìn)行.1.5.3 SDS -聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白的SDS -聚丙烯酰胺凝膠電泳分析是參照Leammli方法[1]進(jìn)行, 4%的濃縮膠, 7. 5%的分離膠,電泳恒壓150V,電泳樣品用G250考馬斯亮藍(lán)染色后再按照標(biāo)準(zhǔn)程序褪色.2結(jié)果與討論2.1卵黃抗體 的高壓液相色譜法分析表1列出了不同濃度的PEG沉淀WSF所獲表1 PEG 濃度對(duì)卵黃抗體回收率和純度的影響得的抗體回收率和純度.隨著PEG濃度的提高，wrec/ %A擾體R抗休/%P抗體/%抗體的回收率也提高，但純度隨之下降;聚乙二268 (Aws)醇濃度為5%沉淀時(shí)，可獲得66%抗體回收率,114189抗體純度達(dá)92%(圖1和圖2);當(dāng)聚乙二醇濃度17756)2為10%時(shí)，抗體純度為85%，但可獲得99%的19774抗體回收率.這是由于PEG的加入，產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)[12),促使蛋白積聚沉淀，而且蛋白的分子2077790量越大越被PEG沉淀[13];抗體的分子量大，因227858此，在低濃度PEG的時(shí)候，抗體首先被沉淀,當(dāng)257)686PEG濃度升高時(shí)，抗體沉淀量增大,但同時(shí)低分1026599子量的雜蛋白的沉淀量也加大,純度也就下降.0.300 I0.300 tlg)0.2000.200 |0.1000.000w.0.0020.0035.0035.00 .1/min圖1抗體樣品(5%PEG沉淀)的HPLC色譜圖圖2 WSF 的HPLC色譜圖中國(guó)煤化工MHCNMHG第S期土輝龍等:聚乙二醇一步沉淀捉取卵黃抗體125。2.2特異性抗體 的檢測(cè)圖3是符異性抗體活性回收率的檢測(cè)結(jié)果.為了便于比0.8較，WSF和PEG提取的抗體樣品在ELISA檢測(cè)時(shí)秘邦相同的倍數(shù).雖然經(jīng)PEG沉淀后抗體量有所損失,但足提純后的0.6抗體去除了雜質(zhì)的干擾ELISA值較高，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相華 04符14.15].022.3 SDS- 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析從圖4可以看出，經(jīng)PEG一步沉淀提取后。樣品中的主WSF4s678.910要蛋白帶分子最為180 kD左在，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相符(S].圖5是WSF的電泳蛋白分布圖。圖6是WSF與用不同濃度的PEG沉淀WSF后的上清液的電泳圖，當(dāng)PEG的濃度達(dá)到圖3不同濃度的PEG提收抗體的活性與10%時(shí)，上清溶液中無(wú)明顯的抗體帶.WSF中杭體活性比較4%5%6%7%。8%9%10%WSFWSF5% 6% 7% 8% 9% 10%IgY- 200kDgY- 130kD- 97.4kD- 66.2kD-43kD圖4用不同濃度 PEG提收的抗圖S WSF 與標(biāo)準(zhǔn)蛋白的圖6 WSP 與用不同濃度PEG沉淀體的電泳圖電泳圖WSF后上情液的電狀圖3結(jié)語(yǔ)采用PEG一步沉淀法提取卵費(fèi)抗體,能夠獲得較高的抗體回收率和純度.用5%的PEG能夠獲得66%的抗體回收率，純度達(dá)92%;用10%的PEG濃度時(shí)，純度為85%，但是能夠獲得WSF中99%的抗體，并且該方法可以在不需要經(jīng)過(guò)任何色譜分離的情況下，根據(jù)不同需要靈括應(yīng)用，這在大規(guī)模制備卵黃抗體方面具有很大的應(yīng)用價(jià)值.參考文獻(xiàn):[1] BenmnHN, Brufield HP. Pomeroy B s. Requircnent of srian C'1 lor isxeion of guinre pig complenet by wviananitbody - antigen complx(J]. Inmunol, 1961. 87; 616 - 622.[2] LarswonA. Alex K P. Soquist J. Use ol chicken aiblil in imuna to swid iteferenre by theumostid fctorn[J].CinCbem. 1991, 37; 411- 414.3] McCannelAA. Nakai s. Srperation of 0 yolk immnoboli ino supultins wing DEAE - ion exchongechroatatgrphyJ]. Can Iust Food Sai Tecbnol, 1990, 23: 42 - 46.[4] HsA, Asock H. Puifiation of yolk imunogobulisn 。1w - stop procedure wing hydrophochie interecionchromnatograply and gel fluatioU小Inmunal Mclods, 1988. 110: 225 - 228.[5] Akita E M. Nakal S. Iuunogobuli lrom egg yolk: iolsion and pufitio[JI. Fooud Sei, 1992, 57+ 629- 634.[6] Pet Hosen, Judth A. Soble ct al. laion and punliorion of imniobulis from chicken n wing tiophileinterncion croraogrophyUJ. Imunol Methods, 1998, 215: 1-7.[7] Polon A, Coetzer T, Knuger J. et al. Improvements in the inltionImnwodl Invest. 1985， 14; 323- 327."中國(guó)煤化[8] Polxon A. lolaion oft lgY fron the yll of oR by o clorodoro pol.MHC N M H Gol lavest, 1990,●126●福州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)第29卷19: 253- 258.9] 傅蓉,李現(xiàn),王中來(lái)，等.雞卵黃免疫球蛋白的嗜硫性色譜一-步分離純化[J].福州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2000,28(6): 110-114.[10] CostKM, WestCs, Brinson D, et el. Mesurement of humen antibody nctivity ogint escherichia coli and pedomonsaeruginos using formalin treated whole organisms in an ELISA technique[J]. Immunassay, 1985, 6: 23-43.[11] 高木俊夫. PAGE術(shù)IT7U兒P三P夕兒電氣泳動(dòng)法[M].日本:廣川書(shū)店，1990, 54-61.[12] Atha D H, Ingham K C. Mechanism of precipitation of proteins by plyetbylene golyols. analyis in terms of excludedvolune[J]. J Biol Chem, 1981, 256; 12 108- 12 117.[13] Juckes I R M. Fractionation of proteins and vinuses with polyethylene gycol[J]. Biochim Biopbys Acta, 1971. 229: 535 -546.[14] SalonenE M, Vaberi A. Rapid sold - phase enzyme immunasay for antibodies to viuses and other microbes: efects ofpolyethylegyol[J]. Immunol Methods, 1981, 41: 95 - 103.[15] Akita E M, Nakai s. Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hensimmunized with an enterotoxigenic E. Coli strain[J]. Immunol Methads, 1993. 160; 207 - 214.One - step precipitation method of egg - yolk- antibody purification by polyethylene glycolWANG Hui - long, ZHOU Jian- wu, WANG Zhong - lai, RAO Ping - fan(Istitute of Biotechnology, Fuzhou University, Fuzhou, Fujian 350002, China)Abstract: A rapid and economical procedure for extraction of antibodies from egg yolk is described. One - steppolyethylene glycol (PEG) precipitation procedure was used to purify IgY. The procedure achieved 92% of thehighest antibody purity and 66% of the antibody yield by employing 5% (w/v) PEG to precipitate WSF. Theantibody recovery was close to 100% and the antibody purity was up to 85 % by employing 10% PEG withoutusing any chromatography, while the activity of IgY wasn' t afected by PEG.Keywords: egg yolk antibody; polyethylene glycol; precipitation; purification(接笫118頁(yè))The application of egg - yolk antibody on preventing and curing tryonyx sinensis diseaseCHEN Qiang', ZHOU Jian - wu', RAO Ping - fan', LIN Jin - zhong?(1. Institute of Biotechnology, Fuzhou University, Fuzbou, Fujian 3500020, China; 2. Institute of Fishery Science, Putian,Fujian 351100, China)Abstract: The article discusses the applcation of egg yolks specific antibody on preventing and curing tryonyxsinensis disease. Immunized chicken produced high titer egg - yolk antibody in the eggs. Lyophilization haslittle effect on the activity of antibody. It was shown by invitro bacteriostatic experiment that egg yolk specificantibody had high inhibitory activity on the growth of Aeromonas hydrophila. Passive immunizationexperiment demonstrated that the secific antibody exhibited satisfactory effects on tryonyx sinensis disease.Keywords: tryonyx sinensis; aeromonas hydrophila; eggs yolk antibody; passive immunization中國(guó)煤化工MYHCNMHG