《西藏科技》2005年11期(總第151期)信息技術(shù)PCR技術(shù)簡(jiǎn)介何燕旦巴卓嘎孟霞(西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院農(nóng)學(xué)系,西藏林芝860000)摘要:現(xiàn)代生物技術(shù)在近20年的發(fā)展中受到了各方人士的普遍關(guān)注,更有許多專家將21世紀(jì)稱為生命科學(xué)的世紀(jì),將現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)稱為21世紀(jì)的朝陽(yáng)產(chǎn)業(yè)。而PCR技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)和生物丁程技術(shù)的靈魂,PCR技術(shù)已經(jīng)成為遺傳與分子分析的根本性基石。PCR技術(shù)操作簡(jiǎn)便,結(jié)果可靠,被世界各國(guó)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、考古學(xué),甚至是刑偵方面。本文簡(jiǎn)要介紹了PGR技術(shù)的原理、反應(yīng)組分及應(yīng)用中常見問題。在農(nóng)業(yè)方面,PCR技術(shù)作為分子植物育種實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)平臺(tái)具有較好的實(shí)用性。在西藏自治區(qū),分子植物育種方法尚未起步。本文旨在向大家簡(jiǎn)單介紹PCR技術(shù),以期一問探討在西藏這個(gè)種質(zhì)資源豐富地區(qū)的常規(guī)分子生物學(xué)及生物丁程技術(shù)的應(yīng)用。關(guān)鍵詞:PCR技術(shù)中圖分類號(hào):Q5241前言右一定時(shí)間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的PCR,即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReac-雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為tion,PCR)是1985 年由美國(guó)PE- Cetus公司的科學(xué)家下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備;K.B.Mulis發(fā)明的一項(xiàng)可在體外快速擴(kuò)增特定基因或1.2 模板DNA與引物的退火(復(fù)性) 模板DNA經(jīng)加DNA序列的新技術(shù)。它借助PCR儀,根據(jù)生物體內(nèi)熱變性成單鏈后,溫度降至55C左右,引物與模板DNA序列能進(jìn)行快速?gòu)?fù)制的某些特點(diǎn),實(shí)現(xiàn)在體外對(duì)DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合;特定DNA序列進(jìn)行快速擴(kuò)增,可在短時(shí)間內(nèi)在試管中1.3 引物的延伸DNA模板- -引物結(jié)合物在TaqDNA獲得數(shù)目萬個(gè)特異DNA序列拷貝。該系統(tǒng)自問世以聚合酶或其它DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)來獲得廣泛應(yīng)用,同時(shí)也成為獲得外源基因的-一個(gè)有原料,靶序列為模板,按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原效手段。發(fā)明人Kary Banks Mulis因此而榮獲1993年理,合成一.條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR 技術(shù)神奇在于:一是被擴(kuò)增的鏈。重復(fù)循環(huán)變性一褪火-延伸三過程,就可獲得更DNA所需量極小,理論上講-一個(gè)分 子就可以用于擴(kuò)增多的“半保留復(fù)制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循了;二是擴(kuò)增效率高,幾個(gè)小時(shí)就可將靶序列擴(kuò)增環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2~4分鐘,2~3小時(shí)100萬倍以上。就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。到達(dá)平臺(tái)期PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。程,DNA聚合酶以一段單鏈DNA為模板,借助一小段2PCR儀雙鏈DNA來啟動(dòng)合成，通過一個(gè)或兩個(gè)人工合成的寡目前的PCR儀已經(jīng)可以設(shè)定程序，研究者可以根核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補(bǔ)序列結(jié)合,據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行許多類型的機(jī)器選擇。這些形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環(huán)境下,在體外通過PCR儀的選擇可體掘研空去巫好、經(jīng)費(fèi)以及儀器和酶促反應(yīng)以百萬倍擴(kuò)增一段目的基因。其特異性依賴使用中國(guó)煤化工要注重其穩(wěn)定性及經(jīng)于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性一久耐YH. CNMHG擇上。退火一延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:3 PCR 反應(yīng)基本成分1.1 模板DNA的變性模板DNA經(jīng)加熱至93C左3.1模板DNAi3信息技術(shù)《西藏科技》2005年11期(總第151期)PCR反應(yīng)的模板可以是單鏈或雙鏈DNA,可以是.配率上升,降低合成速度,并導(dǎo)致反應(yīng)過早終止。一般基因組DNA、重組質(zhì)粒或λ噬菌體,或者任何其它含有實(shí)驗(yàn)室常用的dNTP's直接從專業(yè)公司購(gòu)買。DNA的生物樣品,mRNA也可作為PCR的模板,只需3.4熱穩(wěn)定 DNA聚合酶用逆轉(zhuǎn)錄酶把mPNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA即可。由于PCR最初的DNA聚合酶中從人腸桿菌中提取的,對(duì)熱反應(yīng)的特異性由寡聚核苷酸引物決定,因此模板DNA敏感,DNA變性溫度可使其火活,因此在PCR的變性不需要高度純化,但應(yīng)避免任何蛋白酶、核酸酶、DNA步驟后必須重新加入DNA聚合酶,造成操作技術(shù)煩聚合酶抑制劑、能結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)及多糖類物質(zhì)的瑣、耗時(shí)、費(fèi)力、成本加大,且效率低。在熱穩(wěn)定DNA污染。選用純化的DNA做模板,可增加模板分子的濃聚合酶尚未發(fā)現(xiàn)之前,PCR可能還是-種笨拙的中看度,提高PCR擴(kuò)增的有效性。不中用的實(shí)驗(yàn)室方法。PCR所需的模板DNA的量極微小，通常在納克.1988年Saiki等從美國(guó)黃石國(guó)家公園的溫泉中分級(jí),適宜的模板DNA濃度為30 ~ 50ng,不到1ng的基離的一-株水生嗜熱桿(Thermus aquaticus, Taq)中提取到因組DNA序列就足夠用來進(jìn)行PCR分析,甚至有1個(gè)一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點(diǎn):①耐高DNA分子就可以擴(kuò)增出特定的NDA序列。溫,在70C下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的90%，3.2 引物在93C下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%,在.PCR反應(yīng)成功的關(guān)鍵是設(shè)計(jì)最適合的引物。引物959C下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40% ;②在熱變?cè)O(shè)計(jì)的先決條件是與引物結(jié)合的靶DNA序列必須是性時(shí)不會(huì)被鈍化,不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶;③已知的,與兩個(gè)引物結(jié)合的序列之間的靶DNA序列則大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率,增加了擴(kuò)增未必清楚。PCR 引物是-段與待擴(kuò)增的目標(biāo)DNA序長(zhǎng)度(2.0Kb)。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率,因而列側(cè)翼片段互補(bǔ)的寡核苷酸片段,長(zhǎng)度大多為10~ 30其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow個(gè)堿基。通常,一對(duì)引物包含5'端與正義鏈互補(bǔ)的寡片段區(qū)別,將此酶命名為TaqDNA多聚酶(TaqDNA核苷酸片段和3'端與反義鏈互補(bǔ)的寡核苷酸片段,這Polymerase)。 此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。兩個(gè)寡核苷酸片段在模板DNA.上的結(jié)合位置之間的由于Taq DNA多聚酶沒有3'→5'外切核酸酶活距離決定PCR擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度。引物過長(zhǎng)往往會(huì)降性,缺乏校止錯(cuò)配核苷酸的能力,通常錯(cuò)配率為2x低其與模板的雜交效率,從而減低PCR的反應(yīng)效率。10-*。為了減少錯(cuò)配率,可增加模板分子或減少循環(huán)用于PCR反應(yīng)的每條引物的K度通常為20~30.次數(shù)利減低DNA合成的總量,或者使用高保真酶Pfu個(gè)核苷酸,包含幾乎相同數(shù)量的四種堿基。由于引物DNA聚合酶。Pfu DNA聚合酶是- -種具有高保真性能設(shè)計(jì)涉及的因素較多,因此常借助PCR引物設(shè)計(jì)軟件的高溫DNA聚合酶,來源于高溫嗜熱菌Pyrococcusfu-如:PCGENE、DNAMan進(jìn)行輔助設(shè)計(jì),然后由專業(yè)的生riosis。 Pfu DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性比Taq酶高,因此，物技術(shù)公司用DNA合成儀合成。在PCR反應(yīng)中,引物目前Pfu酶被公認(rèn)為是取代Taq酶的首選高保真高溫的適宜濃度為0.1 ~ 1mol/L。引物濃度過高,容易形成DNA聚合酶。除此之外,還有一些常見的Pfu DNA聚非特異性擴(kuò)增;引物濃度過低,則不足以完成30個(gè)循合酶:Tth DNA聚合酶;Tl DNA聚合酶:Ti DNA聚合環(huán)。在分子植物育種的實(shí)驗(yàn)室中一些通用的引物，可酶:PlatiumnDNA聚合酶等也都具有較好的耐熱性和高向?qū)I(yè)的生化與分子生物學(xué)試劑公司購(gòu)買。保真性。目前西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院西藏高原分子育種實(shí)3.3 dNTPs驗(yàn)室用的是Taq酶。dNTPs包括dATP, dCTP, dGTP, dTTP,是PCR反應(yīng)3.5緩沖液中靶DNA序列擴(kuò)增的原料。在PCR反應(yīng)中,每種脫氧PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液通常含有10mmol/LTris -核苷三磷酸的濃度以50 ~ 200mmol/L為宜。濃度過高HCl(中國(guó)煤化工.5mmo/LMgCl。這種.容易引起非特異性PCR產(chǎn)物,當(dāng)dNTP 濃度高于標(biāo)準(zhǔn)YHCNMHG體系的PH值會(huì)下降150mmol/L會(huì)抑制Taq酶的活性;而濃度過低,(如低于個(gè)多單位,使緩沖液的PH值7.2,基本適用于各種模10~ 15mmol/L時(shí))又會(huì)影響擴(kuò)增的產(chǎn)量。而且4種板及寡核苷酸引物。一般購(gòu)買的10x PCR緩沖液成dNTP的摩爾濃度應(yīng)相同,不平衡的濃度會(huì)導(dǎo)致堿基錯(cuò)分有含Mg*和不含MgZ* 兩種,具體使用哪種可由實(shí)54《西藏科技》2005年11期(總第151期)信息技術(shù)驗(yàn)室人員根據(jù)需要及經(jīng)驗(yàn)而定。變性后的兩條模板相配對(duì)。3.6 Mg+4.3引物 延伸溫度和時(shí)間Taq DNA多聚酶作用時(shí)需要Mg* ,每次擴(kuò)增反應(yīng)引物延伸是DNA聚合酶將脫氧單核苷酸逐一地時(shí)必須確定最佳Mg+濃度。PCR反應(yīng)體系中Mg2*的加到引物3’- 0H末端,依據(jù)模板序列合成-條互補(bǔ)濃度十分重要。一般Mg+濃度以高于dNTP總濃度新鏈的過程。引物延伸溫度取決于DNA聚合酶的最0.5~2.5mmol/L為適宜。Mg*+ 濃度過高,容易生成非適溫度。延伸時(shí)間取決于靶序列的長(zhǎng)度、濃度和延伸特異性擴(kuò)增產(chǎn)物;但如果MgZ* 濃度過低,又會(huì)使PCR溫度,一般為1~ 3min。靶序列越長(zhǎng)、濃度越低、延伸產(chǎn)量降低。溫度越低,則所需要的延伸時(shí)間越長(zhǎng),反之則反。3.7礦物油該過程即將反應(yīng)體系溫度調(diào)整到DNA聚合酶作如果PCR儀沒有配置加熱蓋,為了防止PCR反應(yīng)用的最適溫度,然后以目的基因?yàn)槟０?合成新的過程中反應(yīng)液體的蒸發(fā),還需要在反應(yīng)液體上面加約DNA鏈。50μl礦物油或液體石蠟覆蓋,以維持反應(yīng)體系的濃度4.4循環(huán)次數(shù)和熱恒定性,以保證PCR反應(yīng)的有效性升增加擴(kuò)增產(chǎn)DNA雙鏈變性、退火、延伸這三個(gè)步驟反復(fù)循環(huán)量。石蠟油不僅有防止液體蒸發(fā)的作用，還有使PCR的次數(shù)通常需要25 ~ 40次。適官的循環(huán)次數(shù)主要是反應(yīng)體系內(nèi)各組分(如引物與模板)在反應(yīng)液加熱變性取決于靶DNA序列的起始濃度?；赑CR的實(shí)驗(yàn)方前的阻隔效應(yīng)。這種阻隔對(duì)防止PCR反應(yīng)的開始階法很多,其手忙腳亂的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序也各有異段引物的非特異性結(jié)合具有重要作用。同,應(yīng)視具體情況而定。一般,循環(huán)次數(shù)過多時(shí),產(chǎn)物4 PCR 反應(yīng)程序參數(shù)會(huì)相應(yīng)增多,但是非特異性產(chǎn)物的量也會(huì)增加,而且非PCR反應(yīng)程序參數(shù)即循環(huán)參數(shù)是指PCR循環(huán)中特異性產(chǎn)物的復(fù)雜度也會(huì)增加;循環(huán)次數(shù)過少,則會(huì)降每一反應(yīng)步驟的溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。參數(shù)的正確低PCR的產(chǎn)量。與否是PCR反應(yīng)成功與否的保證。適宜循環(huán)次數(shù)可參照下表: .4.1 變性溫度和時(shí)間不同靶DNA分子數(shù)所需的適宜循環(huán)次數(shù)變性的目的是要使雙鏈DNA完全解鏈成單鏈，既靶分子數(shù)循環(huán)次數(shù)要保證變性充分,使雙鏈DNA完全解鏈,又要保持3x 10DNA聚合酶在整個(gè)反應(yīng)過程中的活性。因此原則上5x l030~ 35變性步驟要在高溫和較短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。如果變性不1x 10'35~40540~45充分,DNA雙鏈會(huì)很快恢復(fù),導(dǎo)致PCR產(chǎn)物產(chǎn)量明顯減少;反之,如果變性時(shí)溫度過高,時(shí)間過長(zhǎng)的話,會(huì)加假設(shè)擴(kuò)增效率為“X" ,循環(huán)次數(shù)為“n”,則二者與.快酶的失活。- .般變性的條件是9SC,時(shí)間為30秒擴(kuò)增倍數(shù)“y”的關(guān)系式可表示為:y=(1+X)"。擴(kuò)增30鐘。解鏈溫度(Tm)值可以根據(jù)靶DNA鏈中的(G+個(gè)循環(huán)即n= 30時(shí),若X= 100%，則y=2°=C),按公式Tm=81.5- 16.61g[Na* ]+0.41(G+ C)% .1073741824(> 10)。 而若X= 80%時(shí),y= 1.80=- 660/N來計(jì)算,其中N為鏈長(zhǎng)。模板DNA或PCR產(chǎn)45517159.6(> 10’)。由此可見,其擴(kuò)增的倍數(shù)是巨大物的變性不完全,是PCR反應(yīng)失敗的常見原因。的。4.2退火溫度和時(shí)間5 PCR 應(yīng)用中的污染及對(duì)策退火的作用是使模板DNA的單鏈與引物相結(jié)合。PCR反應(yīng)的最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高退火溫度是引物與模板特異性結(jié)合的最佳溫度設(shè)定，的靈敏性,但在PCR中普遍遇到的問題是可被寡核苷引物退火溫度和時(shí)間取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成和酸引物中國(guó)煤化工染問題。在反應(yīng)成分中的濃度。退火溫度和時(shí)間是任何一個(gè)5.1MYHCNMHG染是由于研究者操PCR反應(yīng)體系中最重要的參數(shù)。通常退火溫度比引物作不干凈引起的。的解鏈溫度低5C,-般實(shí)驗(yàn)采用37~55C或稍高一5.1.1來自實(shí)驗(yàn)材料污染。如重組克隆的DNA、或者些,時(shí)間為1分鐘。該過程即能使- -對(duì)引物能分別與|來自同一次 PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物污染。主要是由于在5:信息技術(shù)《西藏科技》2005年11期(總第151期)PCR試劑配制過程中，由于加樣槍.容器雙蒸水及其要十分小心,吸樣要慢,吸樣時(shí)盡量一次性完成,忌多它溶液被PCR核酸模板污染。次抽吸,以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。5.1.2來自其他測(cè)試樣品污染。 標(biāo)本污染主要有收5.2.3預(yù)混和分裝 PCR試劑。所有的PCR試劑都應(yīng)集標(biāo)本的容器被污染,或標(biāo)本放置時(shí),由于密封不嚴(yán)溢小量分裝,如有可能,PCR反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好,然后于容器外,或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染;小量分裝，~ 20%保存。以減少重復(fù)加樣次數(shù),避免污標(biāo)本核酸模板在提取過程中,由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)染機(jī)會(huì)。另外，PCR試劑，PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或產(chǎn)物分開保存,不應(yīng)放于同- -冰盒或同- -冰箱。形成氣溶膠而擴(kuò)散,導(dǎo)致彼此間的污染。5.2.4 防止操作人員污染，使用一次性手套吸頭、小5.1.3 “遺留”污染。這是PCR反應(yīng)中最主要最常見離心管應(yīng)一次性使用。的污染問題。因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大(一般為1013拷5.2.5選擇質(zhì)量好 的Eppendorf管。以避免樣本外溢貝/ml),遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極及外來核酸的進(jìn)入,在打開含有PCR所用試劑的微量微量的PCR產(chǎn)物污染,就可造成假陽(yáng)性。離心管前,先把離心管放置在超凈工作臺(tái)的離心機(jī)中5.1.4還有一種容易忽視,最可能造成PCR產(chǎn)物污染進(jìn)行短暫離心(10s)。這可以使液體沉在底部并減少的形式是氣溶膠污染。在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形手套和移液裝置污染的可能性。開管動(dòng)作要輕,以防成氣溶膠,在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管,開蓋時(shí)、管內(nèi)液體濺出。吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污5.2.6減少PCR循環(huán)次數(shù)。只要PCR產(chǎn)物達(dá)到檢測(cè)染。水平就適可而止。.5.1.5實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染。在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽(yáng)性對(duì)照的檢驗(yàn)室,這個(gè)問DNA污染源的去除可通過用254nm的紫外線特題也比較常見。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)定的試劑(去除dNTP和H0的緩沖液)來實(shí)現(xiàn)。紫外高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在線照射也可用于小的裝備如:支架、移液器等的外表面活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒,由于活細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖的簡(jiǎn)便性及去除污染。工作區(qū)、微量離心管的非金屬表面和PCR具有很強(qiáng)的生命力,其污染可能性也很人。儀可用弱漂白粉溶液去污染。5.2防止污染的方法隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的迅速發(fā)展,科學(xué)技術(shù)的不5.2.1合理分隔實(shí)驗(yàn)室。 在理想的條件下, PCR應(yīng)該斷進(jìn)步,新型PCR儀器及相應(yīng)試劑、試劑盒、新的凝膠在一間單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行操作,但是對(duì)于大多數(shù)的電泳設(shè)備的不斷出現(xiàn)，PCR技術(shù)的實(shí)驗(yàn)方法也變得越研究者來說,較為實(shí)際的選擇是在實(shí)驗(yàn)室中為設(shè)置來越簡(jiǎn)便、快捷、實(shí)用,也向著更加智能化的方向發(fā)展。PCR劃出特定的區(qū)域:將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)操縱遺傳物質(zhì)來滿足生命體的特殊要求,將會(huì)給人類液.PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分的現(xiàn)代生活帶來根本性的重大變化。室進(jìn)行,特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其參考文獻(xiàn)它步驟嚴(yán)格分開。最好能劃分①標(biāo)本處理區(qū);②PCR[1] 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)(美)J.薩姆布魯反應(yīng)液制備區(qū);③PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū);④PCR產(chǎn)物鑒定克,D.W.拉塞爾著,黃培堂等譯,科學(xué)出版社區(qū)。其實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍應(yīng)專用。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室[2]現(xiàn)代生物技術(shù)導(dǎo)論,瞿禮嘉、顧紅雅、胡蘋、 陳章用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA。良著.高等教育出版社、施普林格出版社.5.2.2吸樣槍。 吸樣槍污染是一個(gè)值得注意的問題。本文中有些資料摘自Intenet 網(wǎng)站,資料中未列出由于操作時(shí)不慎將樣品或模板核酸吸人槍內(nèi)或粘上槍作者，在此向作者表示感謝!頭是一個(gè)嚴(yán)重的污染源,因而加樣或吸取模板核酸時(shí)中國(guó)煤化工編校陳莎莎MHCNMHG56.