現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志2006年第20卷第5期J Modern Somatol ,September 2006 ,Vol 20 ,No. 5501.聚乳酸一聚乙二醇的制備 及骨修復(fù)實(shí)驗(yàn)研究孔航潘可風(fēng)吳志剛[摘要]目的研究聚乳酸-聚乙二醇(PLA-PEG)共聚物作為細(xì)胞因子骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子( bFGF的載體修復(fù)下頜骨缺損的效果。方法制備多孔 PLA- PEG共聚物并對(duì)其進(jìn)行表征。將PLA- PEG/BMR(實(shí)驗(yàn)組1 ) PLA- PEG/BMP/bFGR實(shí)驗(yàn)組2和PLA- PEQ(對(duì)照組)分別植入27只雄性新西蘭白兔的下頜體部骨缺損處。術(shù)后2周、4周和8周對(duì)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的成骨狀況進(jìn)行大體、X線、組織學(xué)、掃描電子顯微鏡觀察及計(jì)算機(jī)圖像分析。結(jié)果實(shí)驗(yàn) 期間各組成骨活躍。2 周時(shí)實(shí)驗(yàn)組2成骨量最多實(shí)驗(yàn)組1其次對(duì)照組最少差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性意義( P <0.05);4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組2成骨量最多其余兩組成骨量差異不大( P>0.05 )8周時(shí)各組的成骨量的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性意義( P >0.05)結(jié)論新型的 PLA- PEG共聚物呈現(xiàn)良好的生物相容性和骨引導(dǎo)性是BMP和bFGF的良好載體。[關(guān)鍵詞]聚乳酸細(xì)胞因子下頜骨缺損The study of the copolymer of PLA and PEG on the repair of rabbit mandibular defect KONG Hang ,PAN Kefeng ,WU Zhigang. School of Material Science and Engineering , Tongji Unirersity , Shanghai 200092[ Abstract] Objective To evaluate the effect of the new PLA - PEG and the composite of PLA - PEG , bonemorphogenetic protein( BMP ) and basic fibroblast growth factor( bFGF ) on the regeneration of the rabbit mandibulardefects. Methods The porous PLA- PEG was prepared by ring - opening polymerization and solvent - casting/ particle. leaching. PLA - PEG( control group), PLA - PEG/BMP ( experimental group A ) and PLA - PEG/BMP/bFGF( experimental group B ) were respectively implanted into 27 rabbit mandibular defects. Two , four and eight weeks afteroperation, the rabbits were sacrificed and the specimens examined by naked eyes , X - ray ，optical microscope ,computerized image analysis and SEM. Results At the 2d week the regenerated bone in the experimental group B wassignificantly more than that in the experimental group A , trailed by control group. At the 4"h week the new bone in theexperimental groupB was more in size , no statistically significant difference of the new bone between the other twogroups. At the 8th week there was no statistically significant difference among the three groups with regard to the boneregeneration. Conclusion This new PLA - PEG possesses sound biocompatibility and osteoconductivity , which will havemore positive effect on bone regeneration when combined with BMP. And bFGF can synergistically enhance the boneregeneration with PLA - PEG and BMP. This new biomaterial is safe and reliable in bone regeneration. .[Key words] Polylactic acidCytokineMandibular defect中圖分類號(hào):R782.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A迄今為止人們已經(jīng)對(duì)多種骨組織缺損修復(fù)與材料和方法重建材料進(jìn)行了大量的研究1-61。其中聚乳酸( PLA )材料成為最活躍的研究領(lǐng)域。1.實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備:丙交酯(D,L- LAX同濟(jì)本研究在PLA中引入聚乙二醇( PEG)并將這大學(xué)材料學(xué)院自制);PEG(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué).種新型的PLA- PEG材料分別與骨形態(tài)發(fā)生蛋白試劑公司化學(xué)純);骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)100mg,( BMP和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因孔( bFGF )相復(fù)合,粉劑中國(guó)煤化工!供);堿性成纖維細(xì)胞觀察其對(duì)兔下頜骨缺損修復(fù)的作用。生長(zhǎng)MHCN M H G液雙組份(北京雙鷺?biāo)帢I(yè)生產(chǎn))動(dòng)物手術(shù)器械;X線牙片機(jī)光學(xué)顯微鏡;高清晰度彩色病理圖文計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)Motic上海市科委重大項(xiàng)目基金資助課題(編號(hào)05D]14006 )作者單位200092上海同濟(jì)大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院(孔航、Images Advanced 3. 0(上海醫(yī)科大學(xué)病理科提供)昊志風(fēng))同瀝發(fā)銷數(shù)擒醫(yī)學(xué)院潘可風(fēng)為通訊作者)2.多孔PLA-PEG的制備:采用兩步法制備,502.現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志2006年第20卷第5期J Modern Somatol Setember 2006 ,NVol 20 ,No.5即先由乳酸縮聚制得丙交酯(見(jiàn)反應(yīng)方程式1 ),再?zèng)r完整取出下頜骨觀察下頜骨標(biāo)本上材料植入?yún)^(qū)用丙交酯與聚乙二醇聚合制得PLA- PEG共聚物骨組織愈合情況。將下頜骨從頦正中聯(lián)合處分離斷(見(jiàn)反應(yīng)方程式2)其中LA與PEG的聚合比例為開(kāi)進(jìn)行X線攝片觀察。10:1 PEG的數(shù)均分子量為6000。(見(jiàn)反應(yīng)方程式7.脫鈣骨組織標(biāo)本HE染色:將下頜體的骨缺1、2 )然后利用溶劑澆鑄-顆粒濾瀝技術(shù)制備三維多損區(qū)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的植入材料部位的周緣緣外孔支架78。用打孔機(jī)制備成直徑為5mm、高為1mm處鋸下，并從中間矢狀剖開(kāi)顯露骨愈合界面,3mm圓柱形多孔支架材料鈷60照射滅菌。10%福爾馬林固定,脫鈣,石蠟包埋,切片,HE染色光鏡觀察。OHn CHsCHCOOHCatalyst，HIC8.標(biāo)本的超微結(jié)構(gòu)觀察:標(biāo)本從中間切開(kāi)顯露-H2OCH:骨愈合界面2%戊二醛中固定掃描電鏡觀察。9.計(jì)算機(jī)圖像分析:每個(gè)脫鈣HE染色切片上反應(yīng)方程式1乳酸縮合制備丙交酯距正常骨壁0.5mm處隨機(jī)取-圓形視野區(qū)域通過(guò)圖像分析軟件分析目標(biāo)區(qū)(新骨形成區(qū)域)占所選中H0一PEG - -0H+1/2mr區(qū)域的面積百分比。10.數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:使用Excel軟件和Hs- +OCHC+ +(OCH-CHx 0- +CCHO)SAS6.12軟件對(duì)成骨面積的百分比數(shù)據(jù)進(jìn)行方差。分析，以P <0.05為差異有顯著性意義。各組數(shù)據(jù)反應(yīng)方程式2丙交酯與聚乙二醇聚合制得PLA- PEG共聚物.均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。3.多孔PLA- PEG材料的性能表征:采用結(jié)果Waters-150C型凝膠滲透色譜儀測(cè)試共聚物的分子量;使用HITACHI公司S- 2360N掃描電子顯微1.材料的性能表征本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明采取常規(guī)鏡觀察多孔支架的超微結(jié)構(gòu);采用比重瓶法測(cè)定材的有機(jī)高分子聚合方法獲得的PLA- PEG聚合物料的空隙率材料置于0.2M的磷酸緩沖溶液( PBS )平均分子量約35973道爾頓。對(duì)PLA- PEG多孔中(pH=7.4 ,37C )進(jìn)行體外降解,降解時(shí)間共22薄膜用掃描電子顯微鏡進(jìn)行表面形貌觀察,支架為周?；ゴ┒嗫捉Y(jié)構(gòu)孔分布均勻孔徑約為120 ~ 200pum4.動(dòng)物模型的建立選取健康雄性新西蘭白兔(圖1》孔隙率測(cè)定顯示材料孔隙率約為84.7%。27只,體重2~3kg隨機(jī)分為3組每組9只。3%戊巴比妥鈉按體重1ml/kg的劑量經(jīng)兔耳緣靜脈注射行全身麻醉。于下頜骨下緣上3mm處平行于下頜骨下緣逐層切開(kāi),于近下頜骨下緣下頜骨體處用電機(jī)慢速檔(1000~2000rpm)去除皮質(zhì)骨和部分松質(zhì)骨制備成直徑5mm深3mm的缺損。對(duì)照組將PLA- PEG置入骨缺損內(nèi)實(shí)驗(yàn)組1 :在 PLA- PEGA100 e000 ISKV 500 Ls材料中滴入含有5mgBMP的生理鹽水溶液0.1ml,待材料充分吸收該溶液后將PLA- PEG/BMP置圖1樣品表面形 態(tài)的超微結(jié)構(gòu)入骨缺損中實(shí)驗(yàn)組2在PLA- PEG材料中滴入含2.材料體外降解實(shí)驗(yàn)該材料的吸水率較高在有5mgBMP和100u的bFGF的生理鹽水溶液前10周吸水率逐步增加,10周左右的時(shí)間吸水率0.1ml然后按照實(shí)驗(yàn)組1的方法進(jìn)行操作縫合手達(dá)到|YH中國(guó)煤化工(表1)多孔支架的術(shù)創(chuàng)口。每組植入物高度均與下頜骨體表表面平重均CNMH G劇下降的過(guò)程(表1)齊。術(shù)后肌注慶大霉素8萬(wàn)uo隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng),樣品的重量在逐漸減少(表.5.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)本的觀察時(shí)間及處理:術(shù)后第2、1》pH值隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低(表1)4、8周分批處死每組3只動(dòng)物完整取出下頜骨。多孔材料至6周時(shí)急劇膨脹到第10周時(shí)尺寸不再6.大體觀察及X線攝片:觀察該區(qū)域軟組織情變大在第14周時(shí)尺寸出現(xiàn)縮小隨后開(kāi)始崩解變.現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志2006年第20卷第5期J Modern Somatol ,September 2006 ,Vol 20 ,No. 5503.成微小的碎片顆粒狀物質(zhì)。面和材料的孔隙中同時(shí)有毛細(xì)血管長(zhǎng)入材料孔隙表1 PLA- PEG體外降解實(shí)驗(yàn)不同時(shí)間各項(xiàng)指標(biāo)的變化實(shí)驗(yàn)組2新生骨量最多對(duì)照組最少。4周時(shí)，對(duì)照檢測(cè)指標(biāo)實(shí)驗(yàn)時(shí)間組與實(shí)驗(yàn)組1可見(jiàn)類骨樣物質(zhì)融合呈片狀分布兩1周2周4周6周10周14周18周 22者面積相差不明顯其中可見(jiàn)鈣化結(jié)節(jié)(圖2A箭頭吸水率10%)0 2.21 2.8 6.8 8.77 13.99 13.88 10.64 7.85失重率10%0 )00 93.892.487.383.766.756.251.948.所示) ,但實(shí)驗(yàn)組1鈣化結(jié)節(jié)面積大于對(duì)照組(圖2B分子量(Dlum) 46046 NVA 41638 34704 26492 17970 13496 10684 6918箭頭所示》實(shí)驗(yàn)組2可見(jiàn)大片狀類骨樣物質(zhì)生成,pH值.4 7.35 7.3 7.26 7.1 6.89_ 6.91 6.88 6.8面積大于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組1新生骨較2周時(shí)成熟，3.骨組織標(biāo)本大體觀察:各組骨缺損創(chuàng)口愈合可見(jiàn)較多鈣化結(jié)節(jié)(圖2C所示)材料占據(jù)面積較良好未見(jiàn)明顯的炎癥反應(yīng)。各組新骨生成量均隨減少,且呈散在分布。8周時(shí)各組新生骨的成熟性著時(shí)間的推移而增加材料逐步降解。第2周時(shí)實(shí)較以前高,鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量及范圍較前增加材料占據(jù)驗(yàn)組2成骨量最多實(shí)驗(yàn)組1次之對(duì)照組最少。第區(qū)面積進(jìn)一步減少，且呈散在分布。隨著時(shí)間的推4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組2成骨量最多實(shí)驗(yàn)組1和對(duì)照組基移鏡下可見(jiàn)類骨樣物質(zhì)及鈣化結(jié)節(jié)增多細(xì)胞成分本相同。至第8周時(shí),各組缺損已完全為骨組織覆減少。蓋,但是其強(qiáng)度仍稍低于正常骨組織各組材料至此6.電鏡觀察結(jié)果植入2周時(shí)各組可見(jiàn)骨和材時(shí)僅剩余少量顆粒于缺損中央部位。料碎片的界面處有膠原纖維存在材料結(jié)構(gòu)致密斷4.x線觀察:各組樣本均隨時(shí)間的推移，對(duì)X面高低不平部分碎片表面有孔狀結(jié)構(gòu)。植入4周線阻射增加。第2周時(shí)各組均可見(jiàn)阻射影實(shí)驗(yàn)組時(shí)圖3A、B.C) ,各組可見(jiàn)材料碎片膠原纖維(圖2密度最大實(shí)驗(yàn)組1次之，對(duì)照組密度最小。第43A箭頭所示)增多部分材料表面見(jiàn)微孔,孔徑約6周時(shí)對(duì)照組密度最低實(shí)驗(yàn)組1稍高實(shí)驗(yàn)組2密- 10ym左右(圖3B箭頭所示)可見(jiàn)細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)(圖度最高。至第8周時(shí)，各組缺損內(nèi)部密度已接近正3C箭頭所示)植入8周時(shí),各組可見(jiàn)材料碎片散常骨組織，骨小梁無(wú)規(guī)則排列。在周圍有少量膠原纖維和成骨細(xì)胞材料碎片的孔5.組織切片觀察2周時(shí)各組均見(jiàn)成骨實(shí)驗(yàn)狀結(jié)構(gòu)直徑約100 ~ 400pxmo .組1、2可見(jiàn)新生骨基質(zhì)及細(xì)胞散布在材料與骨的界C圖24周時(shí)對(duì)照組(A)實(shí)驗(yàn)組1(B和實(shí)驗(yàn)組xC)組織切片(x10)中國(guó)煤化工CNMHG圖34周時(shí)對(duì)照組(A)實(shí)驗(yàn)組1(B)實(shí)驗(yàn)組xC)掃描電鏡圖像7.數(shù)據(jù)測(cè)量及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析材料植入2周時(shí)實(shí)驗(yàn)組2和實(shí)驗(yàn)組1的骨生長(zhǎng)速度在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著504●現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志2006年第20卷第5期J Modern Somatol Setember 2006 ,NVol 20 ,No.5性差異但較對(duì)照組快統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。4樣物質(zhì)形成和促進(jìn)新骨成熟的作用。添加bFGF周時(shí)實(shí)驗(yàn)組2與對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組1 在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有組光鏡和掃描電鏡觀察顯示缺損內(nèi)成骨活躍毛細(xì)顯著性差異;但對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組1兩者骨修復(fù)情況血管增殖明顯8周時(shí)骨成熟性高,且新生血管增生統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性差異。8周時(shí),三組生長(zhǎng)速度統(tǒng)活躍。通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析,可以看出在2、4計(jì)學(xué).上無(wú)顯著性差異(表2 )周時(shí)新生骨的成骨量較其它兩組有顯著性增加。這表2各組在不同時(shí)間新骨生成面積比例 單位x+ S)些結(jié)果提示成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子在和PLA- PEG術(shù)后觀察時(shí)間以及BMP復(fù)合后發(fā)揮了促進(jìn)毛細(xì)血管增殖的效實(shí)驗(yàn)材料分組2周( 100% )4周( 10%) 8 周( 100%)應(yīng)在協(xié)同作用下加速了缺損的修復(fù)。PLA- PEG組0.175+0.054 0. 426+0.0930.655 +0.024但是在標(biāo)本的大體觀察中8周時(shí)缺損的中央PLA- PCG+ RMP組0. 290+0.0450.384+0.0540. 589 +0.059PLA+ BMP+ bFGF組0.47640.075 0.636+0.046 0. 682 t0.160位置仍可見(jiàn)材料占據(jù)因此此種材料在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中2周時(shí)各材料組間比較F =52.82,P =0.0001 4周時(shí)各材料組間比的降解性稍差需做進(jìn)-步調(diào)整。較F=32.04,p=0.00018周時(shí)各材料組間比較F=1 86PL A- PEG組內(nèi)各時(shí)間段比較F=114. 57.p=0 0001:PLA-PEG+BMP組內(nèi)名時(shí)間限比最時(shí)間段比較=0.001:P[ A_ PEG+'bFGF組內(nèi).0000001 ;PLA- PEG各時(shí)間段比較F =8.41 ,P =0.0021。1 Andrea Bagno , Carlo Di Bello. Surface treatments and roughness討論propertiesof Ti - based biomaterials. J Mater Sci Mater Med ,聚乳酸PLA )是近年來(lái)作為組織工程支架的可2004 , 159)935 - 949.Kokubo T , Kim HM , Kawashita M, et al. Bioactive metals :吸收材料之一。但其可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)9,10]，缺乏preparation and properties. J Mater Sci Mater Med ,2004 ,152):反應(yīng)性官能基團(tuán)親水性較差。PEG 因其分子鏈的99- 107.柔順性特有的細(xì)胞親和性以及可降低蛋白質(zhì)免疫3 Ohgushi H , Miyake J , Tateishi T. Mesenchymal stem cells and性的特點(diǎn)被本次研究用于對(duì)聚乳酸進(jìn)行化學(xué)改性。bioceramics : strategies to regenerate the skeleton. Novartis Found .骨缺損修復(fù)材料乃至體外組織工程的支架材料Symp , 2003 ,249 :118- 127.4 Katti KS. Biomaterials in total joint replacement . Colloids Surf B需要具有-定的孔隙率和孔徑,以容納細(xì)胞和細(xì)胞Biointerfaces , 2004 , 39(3):133- 142.因子并促進(jìn)其功能的發(fā)揮。目前有多種PLA三維Garvin K，F(xiàn)eschuk C. Polylactide-polyglyoolide antibiotic結(jié)構(gòu)制備方法11.12。其中溶劑澆鑄-顆粒濾瀝技implants. Clin Orthop Relat Res , 2005 ,( 437 )105 - 110.術(shù)可以通過(guò)控制微粒的粒徑和混入量來(lái)控制支架的， Wiesmann HP , Meyer U, Plate U ,et al. Aspects of cllagen孔徑和孔隙率。因此我們選擇該技術(shù)來(lái)制備PLAmineralization in hard tissue formation. Int Rev Cytol ,2004 ,242 :121- 156 .- PEG中合成的孔隙率84.7%左右孔徑為150 ~李世普.生物醫(yī)用材料導(dǎo)論.武漢武漢工業(yè)大學(xué)出版社2000 :250μm分子量為35973道爾頓理論上符合支架材186 - 188.料的要求。3 任杰吳志剛. PLA- PEG共聚物三維多孔支架的制備及表征.對(duì)照組(PLA-PEG)在光學(xué)顯微鏡下顯示成骨材料導(dǎo)報(bào)2004 ,18(3)93-95.是由材料和骨的界面處向內(nèi)部隨時(shí)間的增加而增加) lizuka T , Mikkonen P ,Paukku P ,et al. Reconstruction of orbital的。新生骨基質(zhì)、新生血管和成骨細(xì)胞清晰可見(jiàn)提floor with polydioxanone plate. Int J Oral Maxillofac Surg , 1991 ,20(2)83 - 87.示成骨比較活躍。而且在8周時(shí)較其它兩組新生骨10 Bos RR ,Roema FR ,BoeringG ,et al. Bone - plates and screws面積并無(wú)明顯差別,提 示這種材料具有良好的骨引of bioabsorbable poly(L- lactide)-- an animal pilot study. Br.導(dǎo)作用。光鏡下觀察沒(méi)有發(fā)現(xiàn)材料周圍纖維包裹Oral Maxillofac Surg ,1989 , 2X( 6 )467- 476.現(xiàn)象和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)提示這種材料的生物相容性11 Nam YS, Yoon JJ，Park TG. A novel fabrication method of較好。從數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析來(lái)看對(duì)照組隨著時(shí)間的增macroporous biodegradable polymer scaffolds using gas foaming salt加新生骨的成骨量有顯著性的增加提示這種材料中國(guó)煤化工ler Red Appl Bionater )20000 '在通過(guò)骨引導(dǎo)作用促進(jìn)骨缺損的愈合方面的效應(yīng)是12fHCNM HGbehaviors of biodegradable持久的。macroporous scaffolds prepared by gas foaming of effervescent添加BMP的兩實(shí)驗(yàn)組光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)局灶salts. J Biomed Mater Res 2001 55 3 )401 - 408性成骨在骨缺損的各部位散在分布。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示(本文編輯王植三) (收稿日期2005 -08 - 15)(修回日期2005-11-28)較單純P反方數(shù)握G組在2、4周時(shí)有明顯促進(jìn)新骨