Vol 24高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)No 82003年8月CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES1495~1498成分枝型聚乙二醇的簡(jiǎn)便新方法何明磊,蘇志國(guó)(中國(guó)科學(xué)院過程工程研究所生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100080)摘要以賴氨酸和mPEG5000為起始物,利用多肽合成中常用的保護(hù)、縮合和脫保護(hù)等方法合成了在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有重要應(yīng)用價(jià)值的分枝型聚乙二醇.用該方法形成的分枝型PEG在有機(jī)相中以縮合反應(yīng)的方式一步完成,反應(yīng)條件溫和,且有較高的產(chǎn)率(61%).各步產(chǎn)物的表征都與其結(jié)構(gòu)一致.最終產(chǎn)物分枝型PEG的HNMR的表征結(jié)果與其結(jié)構(gòu)吻合關(guān)鍵詞新方法;合成;分枝型聚乙二醇中圖分類號(hào)O633.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0251-0790(2003)08-1495-0隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展,越來越多的具有生物活性的多肽、蛋白質(zhì)和酶被用于臨床治療.但是這些生物大分子在直接用于人體時(shí)還存在快速排除、被人體中的蛋白酶降解和免疫反應(yīng)等缺陷.因此,蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾特別是醫(yī)用蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾仍然是一個(gè)熱門的研究領(lǐng)域.許多天然大分子及合成的高分子已經(jīng)和正在被用于蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾.由于聚乙二醇(PEG)對(duì)人體無毒并且具有生物相容性,因此被廣泛應(yīng)用于修飾蛋白質(zhì)、多肽及酶甚至一些小分子藥物,PEG是一種水溶性聚合物,當(dāng)它與蛋白質(zhì)分子(多肽,酶)以共價(jià)鍵結(jié)合后,能夠降低這些活性分子的上述缺陷,甚至加強(qiáng)其潛在用途.例如,PEG與腺苷脫氨酶的結(jié)合物(PEG- adenosine deaminase)已經(jīng)獲得FDA(美國(guó)食品和藥物管理局)的批準(zhǔn),PEG修飾的細(xì)胞因子( PEG-modified Cytokines)已經(jīng)制備出來,PEG修飾的巨噬細(xì)胞集落刺激因子( PEG-modified granulocyte- macrophage colonystimulating factor)甚至表現(xiàn)出了分化的兩種生物學(xué)性質(zhì)2.人們發(fā)現(xiàn),用PEG修飾生物活性分子,其修飾效果與所用的PEG的分子量及一定的修飾度有關(guān).一般PEG的分子量越大,修飾度越高,結(jié)合物的抗原性越小,而結(jié)合物的體內(nèi)排除時(shí)間越長(zhǎng),但結(jié)合物的生物活性也隨之減小.結(jié)合物生物活性的下降主要是由過度修飾引起的.為了解決這個(gè)問題,人們合成了分枝型聚乙二醇( BranchedPEG).用 Branched PEG修飾蛋白質(zhì)等生物活性分子,可以在反應(yīng)位點(diǎn)給定的情況下增加結(jié)合的PEG量.人們?cè)谘芯恐羞€發(fā)現(xiàn),由于分枝型聚乙二醇的特殊結(jié)構(gòu),當(dāng)它結(jié)合在蛋白質(zhì)分子的表面后,其較大的位阻大大降低了結(jié)合物的抗原性,更有效地阻止了體內(nèi)蛋白酶的水解.因此在修飾度相同的情況下,分枝型聚乙二醇的修飾效果優(yōu)于線型聚乙二醇( Linear Peg)現(xiàn)有的分枝型聚乙二醇的合成方法存在所用化學(xué)試劑昂貴,產(chǎn)率低,反應(yīng)條件難于控制等缺點(diǎn),限制了其研究和實(shí)際應(yīng)用.本文開發(fā)了一種新的簡(jiǎn)便的分枝型聚乙二醇的合成路線,取得了較好的結(jié)果1實(shí)驗(yàn)部分1.1試劑與儀器單甲氧基聚乙二醇(mPEG5000,M=5000),二環(huán)已基碳二亞胺(DC),N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)購(gòu)自瑞典Flka公司.其它化學(xué)試劑均為分析廠H中國(guó)煤化工mesh)購(gòu)自美國(guó)BiRad公司.dMX30型核磁共振儀(300MHz, Bruker4CNMHG型紅外光譜儀( Bruker公司), Waters Series凝膠滲透色譜儀(Pump515, RI detector2410, Column Ht3-5-6), BIFLEXⅢ型收稿日期:2002-09-30.基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào):20136020)資助聯(lián)系人簡(jiǎn)介:蘇志國(guó)(1954年出生),男,博士,研究員,主要從事生化工程研究.E-mail:Aiha1965@163.com高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)Vol 24質(zhì)譜儀( Bruker公司).1.2賴氨酸乙酯鹽酸鹽的制備向500mL三角瓶中加入300mL無水乙醇和30g賴氨酸.在攪拌下將干燥的氯化氫氣體通入上述懸濁液至飽和.賴氨酸逐漸溶解,加熱回流后溶液透明.將此溶液密閉靜置12h后,減壓蒸岀氯化氬和過量的乙醇.溶液經(jīng)濃縮后加入冷的無水乙醚中,此時(shí)有黃色晶體析岀,洗滌并在真空下干燥,得42g產(chǎn)物1.反應(yīng)式如下NH2(CH,)CH(COOH),+ C, H,OH HCI(g)HCINH2-(CH,)CH(COOC,H;)-NH, HCI(1)對(duì)產(chǎn)物1進(jìn)行紅外光譜測(cè)定1.3羧甲基化的單甲氧基聚乙二醇的制備根據(jù)文獻(xiàn)[6]的方法制備產(chǎn)物2.反應(yīng)式如下MngmPEG--OHPEG-CHO→ mPEG--COOH(2)產(chǎn)物2的IR光譜在FTIRⅤ ector22紅外光譜儀上測(cè)定(KBr壓片)1.4分枝型PEG的合成將254mg( I mmol)的賴氨酸乙酯鹽酸鹽加入到裝有25mL二氯甲烷(干燥)的50mL三角瓶中,然后將4mmol的三乙胺(TEA)、2mmol(10g)的羧甲基化的單甲氧基聚乙二醇以及過量的DCC和NHS依次加入到溶液中.在磁力攪拌下于室溫反應(yīng)24h,過濾除去反應(yīng)中生成的二環(huán)己基脲(DCU),然后將溶液慢慢地傾λ強(qiáng)烈攪拌下的150mL冷乙醚中,此時(shí)有乳白色沉淀生成.將沉淀濾岀并真空干燥,得9.5g乳白色粉末狀物質(zhì),將其溶于50mL1 mol /L NaOh中,再加入10 g NaCl,于室溫下攪拌反應(yīng)1h,用6mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值為3.用二氯甲烷萃取(5θmL×3),合并有機(jī)相,用硫酸鎂干燥后將溶液減壓濃縮至5θmL.將此濃縮液慢慢傾λ強(qiáng)烈攪拌下旳3θ0m冷乙醚中,有乳白色沉淀析出,濾出沉淀并真空干燥得9.0g產(chǎn)物3.反應(yīng)式如下:mPEG-COOH HCINH2-(CH2)CH(COOC2H)-NHHCI-TEADCC. NHSmPEGCONH-(CH,).CH(COOC, H)-NHOC--mPEGH+mPEG-CONH-(CH,CH--COOH (4)mPEG-CONH將產(chǎn)物3進(jìn)行MALDⅠ-TOF質(zhì)譜測(cè)定和GPC測(cè)定(產(chǎn)物3是產(chǎn)物2和4的混合物1.5凝膠過濾( Biogel P100)純化分枝型PEG及其HNMR表征將0.4g產(chǎn)物3溶解在2mL蒸餾水中,在裝有 Biogel P100100-200mesh)的色譜柱(5cm×50cm)上,分2次上樣(每次1nL),以水為洗脫液進(jìn)行凝膠過濾分離,以每管10mL進(jìn)行分步收集.將相對(duì)于分枝型聚乙二醇的組分(通過碘顯色反應(yīng)鑒定)合并,用二氯甲烷萃取,乙醚沉淀,最后用乙醇結(jié)晶,得到0.24g乳白色產(chǎn)物4.在dMX300型核磁共振儀(30MHz, Bruker公司)上,以CDCl3為溶劑,TMS為內(nèi)標(biāo)測(cè)定產(chǎn)物4的HNMR譜2結(jié)果與討論產(chǎn)物1的紅外光譜如圖1(A)所示.在1740.9和1218.9cm-處出現(xiàn)了較強(qiáng)的羰基吸收峰,這是典型的飽和羧酸烷基酯—C—O的特征吸收;而3421中國(guó)煤化工縮振動(dòng)峰相對(duì)較弱,這是由于形成鹽酸鹽所致.紅外光譜說明產(chǎn)物1為賴氨iCNMHG產(chǎn)物2的紅外光譜如圖1(B)所示,在1745.5cm·處出現(xiàn)較弱旳璇懸吸收峰,說明原料單甲氧基聚乙二醇中的羥甲基被氧化成為羧基.分枝型PEG的合成實(shí)際上包括兩個(gè)反應(yīng)步驟.首先在有機(jī)相(CH2Cl2)中實(shí)現(xiàn)了羧甲基化mPEG對(duì)賴氨酸衍生物(賴氨酸乙酯鹽酸鹽)的二取代反應(yīng).然后通過皂化作用,將二取代的賴氨酸乙酯水解,再通過酸化作用,最后得到目的產(chǎn)物mPEG二取代的賴氨酸,即分枝型的PEG.我們對(duì)產(chǎn)物3進(jìn)何明磊等;合成分枝型聚乙二醇的簡(jiǎn)便新方法14971.2}(A)1.60.80.44000200040003000Fig. 1 IR Spectra of product I(A) and product 2(B行了 MALDO-TOF質(zhì)譜分析和GPC分析,結(jié)果見圖2. MALDI-TOF的結(jié)果表明,產(chǎn)物3包括兩種組分:一種組分是平均分子量為5089的聚合物,另一種組分是平均分子量為10263的聚合物.平均分子量為10263的聚合物為目的產(chǎn)物4.而平均分子量為5089的組分是未反應(yīng)的原料羧甲基化mPEG.GPC結(jié)果顯示了連在一起的2個(gè)峰,一個(gè)峰的分子量最高值為12054,另一個(gè)峰的分子量最高值為7088.由于GPC測(cè)定使用PS(聚苯乙烯)為標(biāo)準(zhǔn)物,因此12054和峰7088分別相對(duì)與MALDⅠ-TOF質(zhì)譜分析中的峰10263和峰5089.根據(jù)GPC測(cè)定中的峰面積積分計(jì)算,平均分子量為10263的組分占混合物總量的61%2500}(A)200015001000影21026360001000014000m/xt/minFig 2 MALDI-TOF spectrum(A) and GPC spectrum(B)of product 3產(chǎn)物4的HNMR,?:1.2~1.4(多重峰,6H,賴氨酸的_CH2-3,4,5);1.6(多重峰,2H,賴氨酸的_CH2-6);3.14(單峰,3H,mPEG的末端甲氧基);3.49(單峰,mPEG骨架—CH2-);4.05(三重峰,2H,與羰基相連的_CH—-);7.11(三重峰,lH,賴氨酸的εNH-);7.37(雙峰,1H賴氨酸的α-NH—).與已報(bào)道的該結(jié)構(gòu)的HNMR的指紋圖譜相當(dāng)吻合,特別是由于兩個(gè)不同的與羰基聯(lián)接的NH質(zhì)子的存在,第一個(gè)與羰基聯(lián)接的_NH—質(zhì)子由于還與—CH,相連而顯示出三重峰,第個(gè)與羰基聯(lián)接的_NH—質(zhì)子由于還與賴氨酸的α-CH相連而顯示岀雙峰.這一結(jié)果表明,平均分子量為10263的組分就是目的產(chǎn)物分枝型PEG現(xiàn)有的合成分枝型PEG的方法一般是通過賴氨酸與PEG反應(yīng).由于賴氨酸不溶于有機(jī)溶劑,因此現(xiàn)有的合成反應(yīng)只能在水溶液中進(jìn)行.在這種情況下必須精確控制反應(yīng)溶液的pH值,而且產(chǎn)率較低.現(xiàn)有的方法都是通過活化氨基組分或者活化PEG組分來實(shí)現(xiàn)合成,在本文的方法中,我們首先通過酯化反應(yīng)保護(hù)賴氨酸的羧基.這種方法不僅保護(hù)了羧基,由此形成的賴氨酸衍生物在有機(jī)溶劑中有良好的溶解性.因而使得合成分枝型PEG的反應(yīng)能夠中國(guó)煤化工過多肽合成中常用的縮合反應(yīng)完成了分枝型PEG的合成.該反應(yīng)在室溫下即CNMHG反應(yīng)溶液的pH值,使2個(gè)PEG分子在一步反應(yīng)中都結(jié)合到賴氨酸分子上.此合成方法比規(guī)伺萬活便且有較高的產(chǎn)率3結(jié)論以賴氨酸和mPEG5σ00為起始物,利用多肽合成中常用的保護(hù)、縮合和脫保護(hù)等方法合成了在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有重要應(yīng)用價(jià)值的分枝型聚乙二醇分子.用這種方法合成分枝型聚乙二醇分子在國(guó)際高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)Vol 24上迄今未見報(bào)道.與已有的合成方法相比,該方法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì).參考文獻(xiàn)[1] ZHOU Wen- Xiao(周文孝), YUAN Qing-Hui(袁慶輝). 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However the existing synthetic methodsof branched PEG make it very expensive to be used in research and practice. In this paper, a kind ofbranched PEg was synthesizedconventional methods usedhe synthesis of polypeptide(protection, condensation, and deprotection using lysine and mPEG5000 as starting materials. Inthis method, the most important reaction of forming branched PEG was fulfilled in one step bycondensation reaction in organic phase. It makes this method remarkably different from othermethods. The reaction condition is mild and the yield of the product (61%) is higher. Thecharacterization of products in different steps is consistent with their structures. The H NMRspectrum of our end product branched PEG tallies with its structure.Keywords New method; Synthesis; Branched PEg(Ed. W.Z)2002年進(jìn)入《SCI》CDE的中國(guó)期刊ACTA CHIMICA SINICA(化學(xué)學(xué)報(bào))ACTA MECHANICA SINICA(力學(xué)學(xué)報(bào)ACTA PHARMACOLOGICA SINICA(中國(guó)藥理學(xué)報(bào))CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES-CHINESE(高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào))CHINESE JOURNAL OF CHEMISTRY(中國(guó)化學(xué))CHINESE MEDICAL JOURNAI(中華醫(yī)學(xué)雜志)CHINESE PHYSICS LETTERS(中國(guó)物理快報(bào))CHINESE SCIENCE BULLETIN(科學(xué)通報(bào))COMMUNICATIONS IN THEORETICAL PHYSICS(理論物理通訊)SCIENCE IN CHINA SERIES A- MATHEMATICS PHYSICS ASTRONOMY(中國(guó)科學(xué)A-數(shù)學(xué),物理,天文學(xué))ENCE IN CHINA SERIES B-CHEMISTRY(中國(guó)科學(xué)B化學(xué))SCIENCE IN CHINA SERIES C-LIFE SCIENCES(中國(guó)科學(xué)C-生命科學(xué))SCIENCE IN CHINA SERIES D-EARTH SCIENCES(中國(guó)科中國(guó)煤化工SCIENCE IN CHINA SERIES E-TECHNOLOGICAL SCIENOCNMHG轉(zhuǎn)載自《中國(guó)科技論文統(tǒng)計(jì)與分析》(中國(guó)科學(xué)技術(shù)信息研究所