陜西科技大學(xué)學(xué)報(bào)Aug.2009Vo.27JOURNAL OF SHAANXI UNIVERSITY OF SCIENCE & TECHNOLOGY文章編號(hào):1000-5811(2009)04006303乙醇脫氫酶對(duì)小鼠抗醉解酒作用的研究毛跟年,李麗維,齊鳳,張曉霞陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,陜西西安710021)摘要:通過抗醉和解酒兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn),觀察了乙醇脫氬酶直接作為解酒藥物的抗醉酒及解酒作用.結(jié)果顯示,乙醇脫氬酶在防酒醉試驗(yàn)中的作用效果比較明顯,尤其是在給酒后1h,小鼠血液中乙醇含量降低最明顯,而對(duì)已經(jīng)處于酒醉狀態(tài)的小鼠的解酒作用效果并不明顯關(guān)鍵詞:乙醇脫氫酶;抗醉酒;解酒中圖分類號(hào):Q554+,9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A0引言乙醇脫氫酶( alcohol dehydrogenases,簡稱ADH)是廣泛專一性的含鋅金屬酶,以NADH為輔酶,化伯醇和醛之間的可逆反應(yīng).乙醇脫氫酶在人體內(nèi)主要分布于胃壁和肝臟細(xì)胞中,在乙醇代謝中發(fā)揮著重要作用.近年來國內(nèi)外的研究表明飲酒后有部分乙醇既未進(jìn)入血液循環(huán),也未潴留在消化道內(nèi),而是在胃內(nèi)被氧化代謝,這一現(xiàn)象被稱為乙醇的第一關(guān)卡代謝( First-pass metabolism of ethanol).胃乙醇脫氡酶是參與這一代謝的主要酶.胃內(nèi)這一代謝可調(diào)節(jié)乙醇的生物利用度,進(jìn)而影響乙醇對(duì)肝臟及機(jī)體的毒性作用.如果在胃內(nèi)可以加強(qiáng)乙醇的分解,就可以防止其進(jìn)入胃壁細(xì)胞以及肝臟細(xì)胞中,從而達(dá)到保護(hù)胃粘膜和肝臟的功效,同時(shí)也可以防止乙醇及乙醛進(jìn)入血液循環(huán),損壞人體的神經(jīng)系統(tǒng),造成其他的毒副作用1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料(1)ADH酶液:自制;胃蛋白酶、胰蛋白酶和輔酶: sigma公司;56°北京紅星二鍋頭:北京紅星股份有限公司;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純(2)昆明種小鼠體重(20±2)g,雌雄各半,西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,小鼠按常規(guī)方式飼養(yǎng)一周挑選健康正常者隨機(jī)分組.實(shí)驗(yàn)前禁食12h,自由飲水(3)紫外可見分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器廠);臺(tái)式超速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);微量移液槍( Gilson, france);超級(jí)恒溫器(重慶試驗(yàn)設(shè)備廠);冰箱等.1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1酸性重鉻酸鹽氧化法用涂有肝素的離心管接取新鮮小鼠的血6份每份取500L,用微量進(jìn)樣器按0、0.5、1、1.5、2、2.5、3L系列添加50%的乙醇,分別加入500L120%三氯乙酸沉淀蛋白,以800r/min冷凍離心沉淀6min,取上清液各600μL,加重鉻酸鉀硫酸試劑1.8mL,100℃水浴加熱10min,取出冷卻至室溫.用空白水做參比液,測(cè)其在595nm處的吸光度值1.2.2血液中乙醇濃度的檢測(cè)收稿日期:2009-05-04作者簡介:毛跟年(1962-),男陜西省涇陽縣人,教投研究方向:生物藥物材料研究與應(yīng)用基金項(xiàng)目:陜西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(SJ08B18)、陜西省教育廳專項(xiàng)科研計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)08JK236)陜西科技大學(xué)學(xué)報(bào)第27卷用移液槍準(zhǔn)確吸取500L血樣于預(yù)先涂有抗凝肝素的具塞試管中,加入500山L120%三氯乙酸以沉淀樣品中的蛋白質(zhì),以8000/min冷凍離心沉淀6min,取上清液各600L,加重鉻酸鉀硫酸試劑1.8mL,100℃水浴加熱10min,取出冷卻至室溫.用空白水做參比液,測(cè)定其在595mm波長處的吸光度值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算小鼠血液中乙醇的含量1.2.3數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用X±S表示,采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析2結(jié)果與討論乙醇含量/AL2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制2圖1體內(nèi)檢測(cè)低濃度乙醇以小鼠血液中乙醇含量為橫坐標(biāo),595nm處的吸光度為縱坐標(biāo)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線作圖,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖1所示回歸方程為:y=0.0377x+0.1021,R2=0,9965.標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程用于對(duì)小鼠體內(nèi)的乙醇含量進(jìn)行定量分析表1動(dòng)物醉酒乙醇用量的確定22小鼠酒醉乙醇用量測(cè)定結(jié)果1醉倒時(shí)間/min在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,首先需要確定小鼠酒醉的乙醇用量,灌胃給組別123456酒的劑量太大容易引起小鼠中毒而死亡,劑量太小又不足以引1組(0.015mL/g)-1035起小鼠醉倒,故需要選用合適的劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)對(duì)4組(每2組.016mLg)54651514組6只)不同給酒劑量的小鼠進(jìn)行了考察,以1h內(nèi)翻正反射消3組(0.017mL/g)21失的時(shí)間為指標(biāo),確定能夠引起小鼠酒醉的乙醇用量4組(0.018mL/g)由表1可以看出,給酒劑量0.015mL/g不足以使小鼠醉注:“*”死亡;“一”未醉倒倒,有3只小鼠沒有出現(xiàn)翻正反射消失,其醉倒率為50%0.018mL/g的劑量過大,有4只小鼠死亡;0.017mL/g的劑量下有2只小鼠死亡故實(shí)驗(yàn)確定0.016mL/g的劑量為小鼠酒醉的乙醇用量,在此劑量下小鼠醉倒率為100%且沒有發(fā)生小鼠死亡2.3乙醇脫氫酶抗酒醉及解酒實(shí)驗(yàn)4將小白鼠隨機(jī)分成3大組,每大組均包括實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組,每小組各8~10只小鼠表2乙醇脫氫酶防酒醉實(shí)驗(yàn)乙醇含量測(cè)定結(jié)果2.3.1乙醇脫氫酶抗酒醉實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組乙醇含量降低各組小鼠均采用灌胃的方法一次性給h/(l/ml)/l/m1)百分率/%藥,小鼠的用藥劑量即為小鼠醉酒的乙醇0.56.08360.106157329±0.29545.0用量(0.016mL/g)給予實(shí)驗(yàn)組小鼠乙醇13.9823±0.13593.6287±0.0556·8.9脫氫酶與NAD液等比例混合液,空白對(duì)1.54.4951±0.15134.3178±0.08873.9照組小鼠同體積的生理鹽水給藥10min注:與對(duì)照組相比·P<0.05,P<0.01后,給予各組動(dòng)物相同劑量的白酒(56°紅表3乙醇脫氫酶解酒實(shí)驗(yàn)乙醇含量測(cè)定結(jié)果察時(shí)間對(duì)照組試驗(yàn)組乙醇含量降低后,各組小鼠均斷頭取血采用酸性重鉻酸/h/(uL/mL)/(gL/mL)百分率/%鹽氧化法測(cè)定小鼠血液乙醇濃度.實(shí)驗(yàn)結(jié)0.54.3979士0.12554.3360±0.09144.2211±0.25484.1680士0.1765果如表2所示1.54.2564士0.06424.2122±0.1860從表3可以看出,在乙醇脫氫酶防酒醉實(shí)驗(yàn)中,先給藥再給酒,并在隨后的0.5h、1h1.5h內(nèi)對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠血液中的乙醇含量進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果顯示,未給藥的對(duì)照組(給生理鹽水)小鼠體內(nèi)的乙醇含量均高于實(shí)驗(yàn)組(給藥)小鼠給酒05h后,實(shí)驗(yàn)組小鼠血液中的乙醇含量與空白對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05),乙醇含量降低了5%;給酒1h后,實(shí)驗(yàn)組小鼠血液中的乙醇含量與空白對(duì)照組相比差異極為顯著(P<0.01),乙醇含量降低了89%;給酒1.5h后,實(shí)驗(yàn)組小鼠血液中的乙醇含量較空白對(duì)第4期毛跟年等:乙醇脫氡酶對(duì)小鼠抗醉解灑作用的研究照組相比差異顯著(P<0.05),乙醇含量降低了3.9%,由此可以推測(cè),可能在小鼠胃部時(shí)乙醇脫氫酶在輔酶的作用下參與了乙醇分解代謝的過程,乙醇很快降解,從而有效的阻止了乙醇進(jìn)入血液循環(huán).這種作用在給酒后1h內(nèi)表現(xiàn)得最為明顯.給藥1.5h給酒,效果不明顯,有可能是乙醇脫氫酶長時(shí)間在胃部的酸性環(huán)境下活性降低或失去活性,致使無法將乙醇降解,較多的乙醇被吸收2.3.2乙醇脫氫酶解酒實(shí)驗(yàn)按照0.016mL/g的劑量,先給各組小鼠白酒(56°紅星二鍋頭),10min后再給各實(shí)驗(yàn)組小鼠相同劑量的藥液(乙醇脫氫酶液與NAD液等比例混合液),對(duì)照組小鼠給予相同體積的生理鹽水,分別于0.5h、1h、1.5h后,各組小鼠斷頭取血,采用酸性重鉻酸鹽氧化法檢測(cè)血液中乙醇含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示由表3可以看出,在各檢測(cè)時(shí)間段內(nèi),未給藥的對(duì)照組小鼠血液中乙醇含量的平均值均高于給藥的實(shí)驗(yàn)組小鼠,但實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)差異性不顯著,表明乙醇脫氫酶在小鼠解酒實(shí)驗(yàn)中的作用效果并不顯著.可能是在飲酒后,經(jīng)食道、胃、腸道等器官乙醇已被體內(nèi)吸收,再給藥時(shí),乙醇脫氫酶只能降解胃內(nèi)部分的乙醇,而且隨著時(shí)間的延長,乙醇脫氫酶酶活降低或活性喪失,因此在1.5h時(shí)乙醇含量的降低率很低3結(jié)論乙醇脫氫酶在乙醇代謝中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,它可催化乙醇生成乙醛,乙醛再在乙醛脫氫酶的作用下生成乙酸,經(jīng)TCA循環(huán)最終生成CO2和H2O.本實(shí)驗(yàn)通過乙醇脫氫酶的防酒醉實(shí)驗(yàn)和解酒實(shí)驗(yàn)考察了其在體內(nèi)分解乙醇的情況,并通過t檢驗(yàn)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.結(jié)果表明,ADH在抗酒醉實(shí)驗(yàn)中的作用效果比較明顯,尤其是在給酒后1h,血液中乙醇含量降低最明顯,與未給藥的對(duì)照組小鼠血液中的乙醇含量相比,乙醇含量降低了8.9%效果極為顯著但在解酒實(shí)驗(yàn)中,乙醇含量降低都很小,實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明乙醇脫氫酶對(duì)已經(jīng)處于酒醉狀態(tài)的小鼠的解酒作用效果并不明顯推測(cè)原因可能是由于先給藥再給酒,乙醇脫氫酶可很快將乙醇降解,從而有效的阻止了乙醇的吸收.而在解酒方面由于乙醇在體內(nèi)極易吸收,飲酒后再給藥,致使很多乙醇在未被降解前已被體內(nèi)吸收,因而解酒效果不明顯參考文獻(xiàn)[1] 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Immunohistochemical localization of ADH in the stomach before and after abstinence of alcohol in alcoholics-usingconfocal laser scanning microscopy[]. Kurume Med J. 1997,44(4),263[2]魏泓,醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)[M]第2版成都:四川科學(xué)技術(shù)出版社,2001:366388[3]王坤施前實(shí)用診斷酶學(xué)[M]上海:上海醫(yī)科大學(xué)出版社,2000159162[4]李煥德許樹梧急性中毒毒物檢測(cè)與診療[M湖南:湖南科學(xué)技術(shù)出版社,2000:450605RESEARCH OF ADH ON THE ROLE OF ANTI-INEBRIATIONMAO Gen-nian, LI Li-wei, QI Feng, ZHANG Xiao-School of Life Science Engineering, Shaanxi University of Science Technology, Xi'an 710021, China)Abstract: Anti-inebriation of ADh was observed by means of alcohol-resistance experimentand alcohol-relieving experiment, it was indicated that ADH is excellent on alcohol-resistantit can reduce the alcohol in the blood, especially in the drink after l hour, but it has no significant effect on the alcohol-relieve for the mouse who was inebriatedKey words: ADH; alcohol-resistant; alcohol-relieve