中國(guó)工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志2004年2月第17卷第1期 Chinese j Ind Med Feb2004,vol.17No丙烯腈對(duì)DNA交聯(lián)作用研究崔金山,李海山,張淼2,張玉敏1,段志文1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)教研室,遼寧沈陽(yáng)10∞034;2.沈陽(yáng)市第四人民醫(yī)院,遼寧沈陽(yáng)10∞031)摘要:目的應(yīng)用牛胸腺DNA和染毒丙烯腈(AN)小鼠精細(xì)胞研究AN對(duì)DNA的交聯(lián)作用,研究AN毒作用的分子機(jī)制。方法應(yīng)用溴化乙錠熒光法測(cè)定加或不加S條件下AN對(duì)牛胸腺DNA交聯(lián)作用。雄性小鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照,3、618和24mg/kgAN染毒組,毎組2只。腹腔注射染毒1次,于染毒第24h處死小鼠,分離精細(xì)胞觀察細(xì)胞存活率,測(cè)定精細(xì)胞DNA交聯(lián)率。結(jié)果加與不加S條件下,AN對(duì)牛胸腺DNA均未產(chǎn)生交聯(lián)作用。小鼠精細(xì)胞DNA交聯(lián)率在3、6、9mg/kgAN劑量范圍內(nèi)隨劑量增加而升高,呈明確的劑量反應(yīng)關(guān)系(r=0.935,P<0.05)結(jié)論在體外實(shí)驗(yàn)中AN對(duì)牛胸腺DNA未產(chǎn)生交聯(lián)作用,對(duì)小鼠精細(xì)胞DNA在較低劑量時(shí)產(chǎn)生了交聯(lián)作用高劑量產(chǎn)生斷裂作用和交聯(lián)作用。AN對(duì)精細(xì)胞的DNA交聯(lián)作用可能是產(chǎn)生生殖毒作用的分子機(jī)制之關(guān)鍵詞:小鼠;牛胸腺DNA;精細(xì)胞;DNA交聯(lián);丙烯腈中圖分類(lèi)號(hào):R99;0623.76文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1002-221X(2004)1-0018-03Study on DNA cross-link effect of acrylonitrileCUI Jin-shan', LI Hai-shan', ZHANG Miao2, ZHANG Yu-min', DUAN Zhi-we(l. Department of Toxicology, Shenyang Medical College, Shenyang 110034, China 2. Shenyang Municipal Fourth110031, China)Abstract: Objective To study the cross-link effect on DNa and the toxic mechanism of acrylonitrile( an) using calf thymus DNAand spermatids of AN exposed mice. Method DNA cross-link effect of AN in calf thymus with or without $9rescence assay. Male mice were randomly divided into control, 3my/kg, 6mg/kg, 9mg/kg, 12mg/kg, 18mg/kg and 24mg/kg ANgroups, two mice per group the mice were injected with AN ip and killed at 24 hours after treatment, separating spermatids and determining the survival rate and cross-link rate, Result There was no significant increase in DNA cross-link rate of calf thymus DNA exposedto AN with or without S9. Cross-link rates of spermatids in mice exposed to AN significantly increased with the dose in 3mg/kg, 6mgkg and 9 mg/kg groups, which showed significant dose-response relationship(r=0.935, P<0.05). Conclusion AN could not induce cross-link of calf thymus DNA in vitro, but could induce DNA cross-link of spermatids in lower dose and DNA cross-link combiningwith DNA strand-breaks of spermatids in higher dose in mice. The DNA cross-link effect on spermatids might be one of the molecularmechanisms of ANs reproductive toxicityKey words: Mice Calf thymus DNA Spermatid DNA cross-links Acrylonitrile丙烯腈( acrylonitrile,AN)主要用于制造腈綸纖丙烯腈購(gòu)自上海試劑三廠,純度≥95%,含氰氫維、ABS工程塑料及某些樹(shù)脂材料,是人類(lèi)廣泛接觸酸(以HCN計(jì))0.05%,溶于水,臨用現(xiàn)配。牛胸的職業(yè)性毒物和環(huán)境污染物12。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人群資腺DNA購(gòu)自 Sigma公司,用Tis-EDA緩沖液配成3料均證明AN有生殖毒性和遺傳毒性,AN可與睪丸mg/ml使用。溴化乙錠(EB)購(gòu)自 Sigma公司,用磷精細(xì)胞DNA共價(jià)結(jié)合損傷DNA,致睪丸初級(jí)精母細(xì)酸鹽緩沖液(20mmol/ L K,HPO4,0.4 mmol/L edta,胞染色體畸變率升高341,同時(shí)可使外周血有核細(xì)胞pH=12)配成10mg/L溶液線粒體DNA的缺失率升高5本研究以牛胸腺DNA1.2體外實(shí)驗(yàn)和染毒AN的小鼠精細(xì)胞為受試對(duì)象,探討AN對(duì)將AN配成100、200、400800mmol/L水溶液DNA是否產(chǎn)生交聯(lián)作用及其規(guī)律,為研究AN對(duì)機(jī)體以無(wú)菌水為陰性對(duì)照,以80mm/甲醛(FA)為的損傷作用提供分子機(jī)制。不加中國(guó)煤化工L馬兜鈴酸(AA)為材料與方法加S9CNMHG8方法,每管加入牛1.1試劑胸腺DNA與受試化學(xué)物各10l,再加入10l無(wú)菌水或S混合液,37℃水浴30min,每管加3mEB溶液發(fā)育在拙(則H+),男,我,主要研究方向?yàn)樯澈蛣?應(yīng)用HmF20熒光分光光度計(jì)測(cè)定稿日期:2003-07-28;修回日期:2003-09-08其熒光強(qiáng)度,激發(fā)波長(zhǎng)525mm,發(fā)射波長(zhǎng)590m中國(guó)工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志2004年2月第17卷第1期 Chinese J Ind Med Feb204,Vol.17No.1狹縫5m。置100℃水浴8min,迅速冷卻至室溫,測(cè)定結(jié)果再次測(cè)定熒光強(qiáng)度。從表1可見(jiàn)陽(yáng)性對(duì)照物 FA DNA交聯(lián)率為按公式計(jì)算交聯(lián)率:C=[(∫-加)(1-加)×85.71%。各染毒組加熱前后熒光強(qiáng)度與對(duì)照組比較100%經(jīng)F檢驗(yàn)差異無(wú)顯著性(P>0.05式中:C為DNA交聯(lián)率,f為經(jīng)受試物處理管表1不加S時(shí)AN對(duì)牛胸腺DNA交聯(lián)作用測(cè)定結(jié)果加熱后熒光強(qiáng)度(EM2)與加熱前熒光強(qiáng)度(EM1)(x±s,n=3)比值,所為陰性對(duì)照管FM2/EM比值。光熱后熒光交聯(lián)率強(qiáng)度EMEM’/EM(%)1.3體內(nèi)實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照組65.87±3.4026.14±0.920.39861.3.1動(dòng)物分組及處理選擇健康性成熟的雄性昆l00mmo/LAN65.41±5.3126.48±1.70.4048明種小鼠,由沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分200mml/LAN64.02±1.7125.94±1.130.3958為3、6、9、12、18、24mg/kgAN染毒組和一個(gè)陰性400mAN64.12±2.5426.46±1.01041332.74對(duì)照組,每組2只小鼠,按0.1ml/l0g經(jīng)腹腔注射800mml/LAN64.95±1.4425.97±0.520.39710.05次染毒,染毒第24h處死小鼠,分離精細(xì)胞800mLFA64.87±1.5759.32±1.471.3.2精細(xì)胞分離及存活率測(cè)定取雙側(cè)睪丸于2.3加s9時(shí)AN對(duì)牛胸腺DNA交聯(lián)作用測(cè)定結(jié)果35mm平皿中,去除脂肪,加37℃預(yù)溫的 D-Hanks液陽(yáng)性對(duì)照物 AA DNA交聯(lián)率為73.94%,說(shuō)明沖洗2次〔每次5ml),再加5 ml hanks液,去除睪活性較好。各染毒組加熱前后熒光強(qiáng)度與對(duì)照組比丸被膜,梳理并剪碎曲細(xì)精管,110目細(xì)胞篩輕輕過(guò)較,經(jīng)F檢驗(yàn)差異無(wú)顯著性(P>0.05濾,1000r/min離心8~10min,棄上清,重懸細(xì)胞表2加S9時(shí)AN對(duì)牛胸腺DNA交聯(lián)作用測(cè)定結(jié)果沉淀,臺(tái)盼藍(lán)染色,顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)并計(jì)算細(xì)胞存活率。將細(xì)胞原液濃度調(diào)至1.5×10個(gè)/ml。存活熱前熒光加熱后熒光EM’/EM1交聯(lián)率(%)率達(dá)80%~90%以上的劑量組細(xì)胞,進(jìn)行DNA交聯(lián)性對(duì)照組512±0.7727.64±0.50.5率測(cè)定。100mLNN55,67±1.3428,30±1.100.50841.3.3精細(xì)胞DNA交聯(lián)率測(cè)定取40μl細(xì)胞懸液0N5602.162.33±2.100.51733.17AN54.13±1,4827.69±1,O0加到200d溶解液(4mol/ L NaCl,50mml/L8moAN587±1.450.5101KH, PO4, 10 mmol/L EDTA, 0. 1% Sarkosyl FA 2 g/L 10mmoV/L AA 55.40+1.36 48.20+1.390.8708RNase)中,37℃水浴16h,加入500U/ml肝素溶24AN對(duì)小鼠精細(xì)胞DNA交聯(lián)作用測(cè)定結(jié)果液,37℃水浴20min。測(cè)定及計(jì)算DNA交聯(lián)率同體從表3可見(jiàn),在3、6、9mg/kg范圍內(nèi)隨染毒AN外實(shí)驗(yàn)。每只小鼠測(cè)2個(gè)平行樣劑量增加小鼠精細(xì)胞DNA交聯(lián)率升高,呈現(xiàn)明確的1.4統(tǒng)計(jì)方法劑量反應(yīng)關(guān)系,其相關(guān)系數(shù)r=0.9349,P<0.05應(yīng)用SPs軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,熒光強(qiáng)度以x±ξ劑量達(dá)12mg/kg時(shí),加熱前熒光強(qiáng)度明顯低于陰性表示,各組間差異比較采用F檢驗(yàn),并進(jìn)行直線相對(duì)照組(P<0.05),而其他各組與陰性對(duì)照組加熱關(guān)分析前熒光強(qiáng)度差異不顯著(P>0.05),12mg/kg組加2結(jié)果熱后熒光強(qiáng)度高于陰性對(duì)照組,但明顯低于其他劑量2.1精細(xì)胞存活率組,且交聯(lián)率仍高達(dá)60.76%。加熱后熒光強(qiáng)度各染分離的精細(xì)胞在高倍鏡下可見(jiàn)細(xì)胞呈圓形,形態(tài)毒組均高于陰性對(duì)照組(P<0.05均一,分散良好。從每只小鼠可獲得(1~1.5)表3AN對(duì)小鼠精細(xì)胞DNA交聯(lián)作用測(cè)定結(jié)果10個(gè)精細(xì)胞。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)存活率,陰性對(duì)照(x±s,n=4)組及3、6、9、12、18和24mg/kgAN組細(xì)胞存活率中國(guó)煤化工光EM/EM交聯(lián)率依次為99%、%6%、94%、91%、80%、65%和陰性對(duì)CNMH根據(jù)體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)一般要求細(xì)胞存活率應(yīng)3mg/kgAN29.68±3.1015.52±0.850.506025.21控制在80%~90%的原則,確定小鼠精細(xì)胞DNA交6ng/kgAN29.85±1.2324.10±0.250.785669.579 ng/kg AN29.14±2.1025.21±0.31聯(lián)實(shí)驗(yàn)劑量為3、6、9和12mg/kgAN。mg/kgAN17.97±10.74022不加系統(tǒng)時(shí)N對(duì)牛胸腺DNA交聯(lián)作用經(jīng)F檢驗(yàn),與陰性對(duì)照組比較*P<0.05,**P<0.01中國(guó)工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志2004年2月第17卷第1期 Chinese j Ind Med Feb2004,vol.17No3討論代謝轉(zhuǎn)化為活性中間產(chǎn)物2-氰環(huán)氧乙烷(CEO),AN溴化乙錠與雙鏈DNA結(jié)合可產(chǎn)生熒光,而DNA與CEO均具有親電性,而CEO比NN更強(qiáng),二者均在加熱變性為單鏈后熒光衰減,交聯(lián)DNA由于解鏈可損傷生物膜,產(chǎn)生活性氧攻擊DNA大分子,造成受阻熒光衰減幅度小8牛胸腺DNA交聯(lián)實(shí)驗(yàn)是檢DNA損傷1341,在外周血和睪丸組織中AN和CEO測(cè)外來(lái)化學(xué)物對(duì)DNA損傷的一種簡(jiǎn)便、快速、可靠均可通過(guò)直接脫烷基作用烷化DNA,與DNA共價(jià)結(jié)的方法。本研究發(fā)現(xiàn)AN在100~800mmo/L范圍合形成加合物,使DNA斷裂和/或交聯(lián),使基因突變內(nèi),無(wú)論加與不加S代謝活化系統(tǒng),AN均未對(duì)牛胸產(chǎn)生遺傳毒作用4590。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)AN腺DNA產(chǎn)生交聯(lián)作用。但在同樣條件下不加S9的及其代謝產(chǎn)物可使精細(xì)胞DNA產(chǎn)生交聯(lián)作用,較大800mmo/L甲醛和加S的10mmoL馬兜鈴酸均對(duì)劑量產(chǎn)生DNA斷裂,因而進(jìn)一步證明AN所致生精細(xì)牛胸腺DNA產(chǎn)生了明顯的交聯(lián)作用,說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)方胞DNA損傷是產(chǎn)生生殖毒作用的分子機(jī)制之法可靠,S活性較好,未產(chǎn)生假陰性,結(jié)果可信。參考文獻(xiàn)有報(bào)道體內(nèi)實(shí)驗(yàn)AN對(duì)大鼠外周血淋巴細(xì)胞DNA產(chǎn)生[1]張貴利,戴修道,丙烯腈毒作用研究進(jìn)展[J]中國(guó)公共衛(wèi)生學(xué)損傷作用9,目前尚未見(jiàn)AN體外DNA交聯(lián)實(shí)驗(yàn)報(bào)報(bào),1998,17(3):1921告。AN作業(yè)工人外周血有核細(xì)胞線粒體DNA在較低[21崔金山,楊凱,付守林,等,丙綿周對(duì)雄性小鼠生殖功能影響研究[J]工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病,2001,27(3):155-158劑量產(chǎn)生了交聯(lián)作用3本研究AN對(duì)牛胸腺DNA未[]吳鑫,鐘先,丙烯臘生殖毒性研究概況[J1芳動(dòng)醫(yī)學(xué),2000產(chǎn)生交聯(lián)作用,推測(cè)可能是牛胸腺DNA對(duì)N損傷較17(1):51-52其他組織不敏感,或AN代謝活化要求的酶系僅S9[4] Ahmed ae,Akds, Nour am.A是不夠的,因此在體外未能轉(zhuǎn)化為活性中間產(chǎn)物損傷DNA in rats [J]. J Biochem Toxicol, 1992,7(1): 5-6DNA,而致檢測(cè)結(jié)果為陰性。[5]丁晟,馬來(lái)記,范衛(wèi),等.丙烯腈作業(yè)工人外周血有核細(xì)胞線體DNA損傷研究[J].中華勞動(dòng)衛(wèi)生與職業(yè)病雜志,2003,21體內(nèi)染毒AN分離精細(xì)胞的DNA交聯(lián)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)(2):99-101染毒劑量在369mg/kg范圍內(nèi)精細(xì)胞DNA交聯(lián)率〖6]李海山.馬兜鈴酸的腎毒性及DA損傷機(jī)制研究[D]大連醫(yī)隨染毒劑量增加而升高,呈現(xiàn)明確的劑量-反應(yīng)關(guān)系科大學(xué)碩士學(xué)位論文.2003,P16說(shuō)明AN及其代謝產(chǎn)物在該劑量范圍內(nèi)對(duì)精細(xì)胞DNA[7]楊丹風(fēng),襲著革,張華山,等.3種醛類(lèi)化合物對(duì)DNA的交聯(lián)生產(chǎn)生了明顯的交聯(lián)作用。當(dāng)劑量達(dá)12mg/kg時(shí)由于成作用[J].中國(guó)公共衛(wèi)生學(xué)報(bào),199,18(2):110-111劑量增加對(duì)精細(xì)胞毒作用加強(qiáng)使精細(xì)胞死亡率達(dá)[8]黃建鳴,董玉寧,許峰,等.EB熒光分析法測(cè)定腫瘤細(xì)胞DNA交聯(lián)與增殖活性[J]生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,196,23(1):20%由于細(xì)胞死亡致使DNA碎裂和斷裂不能與溴化乙錠產(chǎn)生熒光使加熱前熒光強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組,[9張正東,劉豐,金復(fù)生,等.丙烯腈對(duì)大鼠外周血淋巴細(xì)胞DNA交聯(lián)率低于6mgkg組可能在該劑量下AN對(duì)生精細(xì)損傷研究[J]勞動(dòng)醫(yī)學(xué),1999,16(4):220-22胞DNA既產(chǎn)生了斷裂作用又產(chǎn)生了交聯(lián)作用。10] Ban F, LocndavistJ, boyd R, et al. Theoeritcal studies of the cross-AN在體內(nèi)經(jīng)細(xì)胞色素P450酶系的亞族CYP2E1linking mechanisms between cytosine [J ]. J Am Chem Soc, 2002, 124(1):2753-2761個(gè)單牛木單單中代單中中單產(chǎn)單中單個(gè)單個(gè)單水單個(gè)單單單中個(gè)單牛單個(gè)單單單單中大單中個(gè)單中單中個(gè)單中十十〔上接第17頁(yè))本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在溫石棉與AM開(kāi)起的氧化損傷。始孵育時(shí)激活了體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng),但隨著孵育時(shí)間參考文獻(xiàn)的延長(zhǎng),體內(nèi)抗氧化酶耗竭,岀現(xiàn)了下降的趨勢(shì)。說(shuō)「1 Kamp W D, Weitzman sa· The molecular basis of asbestos induced lung明溫石棉能破壞AM的自我防御系統(tǒng)。injury [J]. Thorax, 1999, 54: 638-652Onom是從可食用植物中提取的天然活性物質(zhì),[21王起恩,樊晶光,張使,等,吸煙與溫石梯單推及聯(lián)合作用對(duì)人含有黃酮、多酚、花色素、皂角苷和其他天然植物成胚肺細(xì)胞DNA鏈斷裂的影響[J]中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志分,功能試驗(yàn)證實(shí)它具有sOn活性,可以直接清除3]wa中國(guó)煤化工al. The interaction between asO。對(duì)石英粉塵所致肺泡巨噬細(xì)胞的氧化損傷有CN MH Gof rats pleural mesothelial cells定的緩解作用4本研究表明 OncolⅦm可以降低溫石culture [J]. Am J Pathol, 1987, 126: 343-349棉引起的MDNA斷裂,提高抗氧化酶SOD和GH.[4]劉英莉,張艷淑,ArH.kDag等. Oncolyn對(duì)石英粉塵所致肺泡巨噬細(xì)胞某些生化指標(biāo)的緩解作用[J].中國(guó)職業(yè)醫(yī)學(xué)的活性。在溫石棉與肺泡巨噬細(xì)胞作用的同時(shí)分2003,30(2):30-31別加入不恬濃的 Oncol,可以部分預(yù)防溫石棉引