江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)200,19(11):70-72Acta Agriculturae Jiangxi鐵釘菜乙醇提取物對(duì)真菌生長(zhǎng)的影響歐陽(yáng)桐嬌,鄭怡2,劉艷如2,林勇3,郭文杰,江枝和3(1.福建省農(nóng)科院生物技術(shù)研究所,福建福州35003;2,福建師范大學(xué)生命科學(xué)院福建福州350007;3.福建省農(nóng)科院土壤肥料研究所福建福州350013)摘要:鐵釘萊乙醇粗提物通過(guò)薄層層析法分離活性物質(zhì),分別采用紙片法和菌餅法測(cè)定了鐵釘苿提取物及薄層層析帶對(duì)3種真菌的菌絲生長(zhǎng)的影響,用玻片法測(cè)定了對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:乙醇提取物對(duì)3種真菌孢子萌發(fā)的抑制作用最強(qiáng),其中,濃度在0.005-/mL時(shí)對(duì)綠色木霉和黑曲拿孢子萌發(fā)的抑制率均達(dá)到9%。關(guān)鍵詞:鐵釘萊;薄層層析;真菌;萬(wàn)絲生長(zhǎng);孢子萌發(fā)中圖分類號(hào):Q949.327.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào):1001-8581(2007)11-0070-03QUYANC of etha n o ENt aCt fr ym iskig e r yAm u guo g w h n znhezhou 350003. China2. College of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China;3. Institute of Soil and Fertilizer, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013, ChinaAbstract: Active substances separated by TLC from the ethanol extract of ishige okamura were used to study their effects on thehyphal growth of three fungi by using the method of disc and flter paper, as well as their restraining effects on the spore germination byusing the slide method. The results indicated that ethanol extract showed strong inhibition to the spore germination of three fungi anthe maximum inhibitory rate reached 97. 0% to Trichoderma wride and Aspergillus niger under the concentration of 0. 005 mg/mL.ls: Ishige okamura; Thin layer chromatographic analysis; Fungus; Hyphal growth; Spore germination海洋占地球總面積的71%,蘊(yùn)藏著極其豐富的生物細(xì)菌、真菌對(duì)抗生素耐藥性和抗藥性的加強(qiáng),尋找新的抗資源是有機(jī)物質(zhì)的最大生產(chǎn)者。這些有機(jī)物基本上是菌活性物質(zhì)已成為了當(dāng)務(wù)之急。而海洋生物的多樣性、海洋浮游植物合成的特別是海藻。因此可以說(shuō)海洋藻特殊性及復(fù)雜性是理想的新的抗菌素的資源寶庫(kù)。海藻類是世界上最大的有機(jī)物合成并儲(chǔ)存的資源寶庫(kù)并且抗菌活性物質(zhì)的研究主要包括對(duì)具抗菌活性種類的篩它們?cè)诤Ｑ笾蟹植紡V泛從大洋水體到世界各沿岸海區(qū),選抗菌活性物質(zhì)的提取、分離純化及化學(xué)成分分析和結(jié)生活環(huán)境變化多端,物種和生活環(huán)境的多樣性為海洋藻構(gòu)鑒定等。本研究以綠色木霉( Trichoderma viride)、黑曲類帶來(lái)了其生物活性物質(zhì)的多樣性。由于海洋環(huán)境的特霉( Aspergillus niger)、圓弧青霉( Penicillium cyclopium)為殊性很多的海洋生物在高鹽、高壓、缺氧等惡劣生活環(huán)研究對(duì)象研究了乙醇提取物及薄層層析分離物對(duì)其生境的長(zhǎng)期進(jìn)化和發(fā)展的過(guò)程中為適應(yīng)生存和競(jìng)爭(zhēng)生存長(zhǎng)的影響旨在為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用海藻的天然活性物質(zhì)空間形成并產(chǎn)生了許多結(jié)構(gòu)獨(dú)特而藥理作用顯著的海提供借鑒。洋次生代謝物質(zhì)如抗菌、抗病毒、抗腫痼抗氧化等活性1材料與方法物質(zhì)而海藻作為海洋生物鏈的第一生產(chǎn)者,為了抵1.1材料鐵釘菜采自石獅海域;海藻采回后立即清洗抗外界微生物的感染和獵食者的吞食而獲得生存,它們于凈室內(nèi)陰干陰涼處保存?zhèn)溆谩Ｔ诓粩嗟倪M(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生了對(duì)各種敵害生物的抗性。由1.2真菌本實(shí)驗(yàn)的供試真菌有3種即綠色木霉(mi于海藻本身沒(méi)有像高等動(dòng)物那樣的細(xì)胞免疫系統(tǒng)它們 choderma tinde)、黑曲霉( Aspergillus niger)圓弧青霉的這種抗性是一種有目標(biāo)地產(chǎn)生化學(xué)物質(zhì)的防衛(wèi)機(jī)制,( Penicillium cyclopium),由福建農(nóng)林大學(xué)許文耀教授分一般為藻類產(chǎn)生的次生代謝物質(zhì)。另外海洋藻類還是離純化本實(shí)驗(yàn)室保存。很多其他消費(fèi)者的活性物質(zhì)的主要來(lái)源。自20世紀(jì)601.3試劑石油醚、丙酮、乙醇、乙酸乙酯均為國(guó)產(chǎn)分析年代人們提出“向海洋要藥”的口號(hào)起,近40年來(lái)海洋純薄層層析硅膠為青島海洋化工有限公司產(chǎn)品?；瘜W(xué)及生命科學(xué)研究成為熱點(diǎn)之一12)。其中對(duì)于海14洋藻類抗菌活性物質(zhì)的研究由來(lái)已久特別是隨著很多司);SHH中國(guó)煤化工斯特儀器有限公CNMHG一州長(zhǎng)城科工貿(mào)收稿日期:2007-08-06基金項(xiàng)目:福建省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)日(2005N096)。作者簡(jiǎn)介:歐陽(yáng)桐嬌(1963-),女福建平渾人助理研究員從事植物資源化學(xué)研究工作。歐陽(yáng)桐嬌等:鐵釘菜乙醇提取物對(duì)真菌生長(zhǎng)的影響71有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);電熱恒28℃恒溫保混培養(yǎng)6h,顯微鏡下觀察并記錄孢子萌發(fā)溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠);VD-650型桌上式潔凈情況。以等量的乙酸乙酯為對(duì)照每處理重復(fù)3次按下工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備);電熱手提式壓力蒸汽滅菌器面公式計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率:(上海醫(yī)用核子儀器廠);TDCC2-3接觸調(diào)壓器(浙江正孢子萌發(fā)抑制率=(1-處理萌發(fā)率/對(duì)照萌發(fā)率)泰電器股份有限公司);雙層鐵皮電爐(上海申航五金電x100%器廠丹陽(yáng)分廠);F-I型三用紫外分析儀(上海顧村電2結(jié)果與分析光儀器廠)。2.1乙醇提取物抗真菌活性通過(guò)對(duì)鐵釘菜乙醇浸提1.5方法后得到的粗提物經(jīng)薄層層析后取各個(gè)特征帶的乙醇浸151鐵釘菜樣品的處理將已經(jīng)在通風(fēng)處陰干的鐵泡液并以乙醇作為對(duì)照采用紙片法進(jìn)行抗菌試驗(yàn)抗菌釘菜,用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎保存于干燥器中備用。結(jié)果如表1所示通過(guò)薄層層析后R052對(duì)圓弧青霉的152鐵釘萊的浸提液的制備取干鐵釘菜粉末適量,抗菌活性明顯增加,而對(duì)黑曲霉、綠色木霉的抗菌活性消加入5倍體積的有機(jī)溶劑(乙醚、乙醇),于50℃水浴鍋失,R081的抗菌活性減弱。中浸提72h,常溫下每3d過(guò)濾1次,再加等量的有機(jī)溶表1鐵釘菜提取物及層析帶的抗真菌活性劑連續(xù)3次,得到浸提液。提取物及層析帶黑刪賽綠色木霉圓弧育莓15.3粗提物的制備將浸提液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸餾,直至把有乙醇提取物機(jī)溶劑全部蒸出獲得干物質(zhì)即是粗提物每一次旋轉(zhuǎn)蒸Rf0.52餾時(shí)都要過(guò)濾兩次。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時(shí)當(dāng)蒸餾瓶中的有機(jī)溶0811.24注:表中數(shù)據(jù)為抑制圈直徑(mm);-表示沒(méi)有抑制效果。劑很少時(shí),每隔30min稱重1次,直至恒重15.4萃取將獲得的粗提物以10倍的比例,倒蒸2.2鐵釘菜乙醇提取物對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用以乙餾水充分振蕩直到粗提物不再溶解同樣以10倍的比醇作為對(duì)照測(cè)定鐵釘菜乙醇浸提粗物和薄層層析帶乙例倒人乙酸乙酯充分振蕩至粗提物全部溶解然后把溶醇浸泡液對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用試驗(yàn)結(jié)果表明鐵釘菜液倒入分液漏斗中,上下充分振蕩后,放在鐵架臺(tái)上靜置乙醇提取物及各薄層層析帶對(duì)綠色木霉均沒(méi)有明顯的抑至分層將水相和乙酸乙酯相分別收集。萃取時(shí)振蕩制作用;從表2可見(jiàn),乙醉提取物、R0.52、R05、0.63對(duì)圓弧青霉的抑制率都隨著時(shí)間的增加而降低,其定要充分靜置后取乙酸乙酯相這樣就配制成0.1B影中R0.5的抑制率最高,R(0.60反而促進(jìn)其菌絲mL的粗提有機(jī)溶劑溶液。由表3可知,乙醇提取物及薄層層析的3個(gè)帶即Rf1.55薄層層析分離方法制作薄層層析板稱取薄層000、R063、Rf0.81對(duì)黑曲霉的抑制率隨時(shí)間的增加層析硅膠10g量取30mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為05%的羧甲基纖而降低,H063對(duì)黑曲霾的抑制率較原粗提物高出116維素鈉,倒入研缽內(nèi)研磨10min,后鋪板、顛板、在光線下29.5個(gè)百分點(diǎn),而有些條帶則表現(xiàn)出促進(jìn)生長(zhǎng)作用觀察,直至板均勻?yàn)橹?常溫下自然風(fēng)干。烘箱中100℃表2鐵釘菜提取物及層析帶對(duì)圓弧條件下,烘30min活化距離板邊緣1.5cm處先畫上膏霉菌絲生長(zhǎng)的抑制率條基線然后將浸提液點(diǎn)到基線上。將板點(diǎn)好后,配制展培養(yǎng)時(shí)間乙提層劑將其倒入層析缸中再把板放入層析缸,等各個(gè)特(h)取物000.50.550.60.630.81征帶分離后即可把板拿出。展層劑為丙酮:石油醚=12433.33.366.7-86733.3-66.736429-28.614.357.1-8.714.3-14.315.6特征帶的制備對(duì)已經(jīng)分離好的多個(gè)板觀察展注濃度為00gmL出來(lái)的條帶數(shù)計(jì)算出R值準(zhǔn)備好試劑瓶收集特征帶表3鐵釘菜提取物及層析帶對(duì)黑曲霉1.5.7菌絲生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)采用菌餅法進(jìn)行生長(zhǎng)速率菌絲生長(zhǎng)的抑制率測(cè)定在PDA平板表面中心接種菌餅然后用移液槍取時(shí)間乙膀提h)取物0000.520.550.600.630.8120μ鐵釘菜提取液,注射在菌餅周圍。以等量的乙酸212.6153-2.5-4.1-1641x.5乙酯作為對(duì)照每處理重復(fù)3次。28℃恒溫培養(yǎng)。觀測(cè)3616712.6-20.8-12512.52.34.2菌絲生長(zhǎng)測(cè)量直徑連續(xù)測(cè)量3次記錄數(shù)據(jù)。按慕立注:濃度為00gm義的方法計(jì)算抑制率菌絲生長(zhǎng)抑制率=[1-(處理23鐵釘菜提職物對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用對(duì)鐵釘菜組生長(zhǎng)直徑一菌餅直徑)/(對(duì)照組生長(zhǎng)直徑-菌餅直乙醇粗中國(guó)煤化工(以乙醇作為對(duì)照)進(jìn)CNMHG-6。從表4看1.5.8孢子蒴發(fā)抑制實(shí)驗(yàn)采用玻片法往干燥潔凈的出乙醇提取物的分離帶斑052對(duì)圓弧青霉的孢子萌無(wú)菌口玻片凹孔中滴加100μ海藻提取液在超凈合上發(fā)有抑制作用,而鐵釘菜乙醇提取物在濃度0.005g/mL揮發(fā)至干;然后每孔滴加100μL配制好的孢子懸浮液,時(shí)抑制率達(dá)到了最高。從表5看出鐵釘菜乙醇提取物江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)對(duì)綠色木霉孢子萌發(fā)有抑制作用濃度為005g/m時(shí)林雄平等使用乙酸乙酯和水對(duì)海藻乙醇提取物進(jìn)行抑制率達(dá)到了99%。從表6中可以看出,R0.52對(duì)黑曲萃取后對(duì)兩萃取相分別采用薄層層析進(jìn)行了初步分離霉孢子萌發(fā)的抑制率隨著濃度的下降而降低并測(cè)定了不同層析帶的抑菌活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分薄層表4鐵釘菜提取物及層析帶對(duì)層析分離組分的抗菌活性均強(qiáng)于分離前的粗提物。作者圓弧青霉孢子萌發(fā)的抑制率%所做的實(shí)驗(yàn)也用薄層層析法分離了乙醇提取物表明大提取物及層析帶濃度(g/mL)部分薄層層析分離組分都有抗菌活性可是沒(méi)有粗提物0.0100.0050.00l的活性高。乙醇提取物R0.52本實(shí)驗(yàn)采取了菌餅法、玻片法、紙片法測(cè)定鐵釘菜提取物對(duì)3種真菌生長(zhǎng)的影響,其中紙片法是比較成熟表5鐵釘菜提取物及層析帶對(duì)的方法前人經(jīng)常有使用紙片法的報(bào)道而其他2種方法綠色木霉孢于萌發(fā)的抑制率的報(bào)道較少。本文菌餅法、玻片法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與紙片法提取物及層析帶濃度(g/mL)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還是比較一致的。0.0100.001乙醇提取物Rf0.555876參考文獻(xiàn):Rf0.60[1]劉湘,汪秋安天然產(chǎn)物化學(xué)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005,118-126表6鐵釘菜提取物及層析帶對(duì)[2] Selective cytotoxicity of marine algae extracts to several human黑曲霉孢子萌發(fā)的抑制率leukemic cell lines[J]. cytotechnology, 1997, 252(1-3):13提取物及層析帶濃度(g/mL0.0100.005[3]董春景,賀娟,梁惠,等海藻提取物抑瘤活性及抗氧化作用乙醇提取物8092的觀察[].齊魯醫(yī)學(xué)雜志,2006,4(2l):98-100.Rf0.52[4]慕立義,植物化學(xué)保護(hù)研究方法[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,1994.80~813討論5]陳灼華鄭怡,莊惠如10種紅藻和褐藻抗細(xì)菌抗真菌活性前人研究業(yè)已證明海藻中含有豐富的抗菌活性物的研究[].福建師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,194,10質(zhì)并且有良好的抗細(xì)菌活性。但對(duì)海藻提取物中是否有抗真菌活性物質(zhì)尚存在爭(zhēng)議。有研究表明,海藻6徐年軍,范曉,韓麗君等海藻乙醇提取物抗菌活性的研究提取物的抗細(xì)菌活性和抗真菌活性相當(dāng)。而有的試驗(yàn)結(jié)[.海洋與湖沼,200,3(2):265~270.果表明海藻提取物沒(méi)有抗真菌活性。 Sreenivas和had[7] ZHENG Y, CHEN Y S, H. Screening for antibacterial andantifungal activities in some marine algae from the Fujian coast ofakuma發(fā)現(xiàn)海藻提取物具有抗真菌活性。陳灼華等China with three dierent solvents[J]. Chinese Journal Oceano和 Zheng,etl的研究也都證明了海藻提取物的抗真菌 yy and Limnology,x00,9(4):x7-3活性。作者所做的實(shí)驗(yàn)表明鐵釘菜乙醇提取物有一定的[8]林雄平,鄭怡,陳曉清.三種褐藻乙醇提取物抗動(dòng)植物病原抗真菌活性。菌活性[J].福建師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2005,21海藻提取物中有許多的活性物質(zhì)。徐年軍等和1):12(上接第的9頁(yè))油脂,00,(6參考文獻(xiàn):[S Cora J Dillard, German J B. Review phytochemicals: nutraceuti[1]戴洪平,王興國(guó),金青哲HPC法測(cè)定芝麻油中生理活性成cals and human health [J]. J. Sci. Food Agric. 2000, 80分芝麻素[食品科技200,(3):86~88[2]王可成王虹胡麻名考中藥材,19920(9):479-480[6]k P. Suja, A. Jayalekshmy. Antioxidant activity af sesame3]s Sirat Yasumoto, M Katsuta. Efect o sesame sceds rich incake extract [J]. Food Chemisesamin and sesamolin on fatty acid amidation in n liver [J]. [7] Lee-Wen Chang, Wen-Jye Yen. Artionidant activity o seJournal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49(5): 2647ne coat [ J]. Food Chemistry, 2002, (78): 347-354[8]李偉紅戴廷燦熊艷HPLC法測(cè)定畜禽內(nèi)中沙丁肢醇的殘[4]唐傳核彭志英芝麻木酚素“芝麻素”研究概況[]糧食與TH中國(guó)煤化工CNMHG