第32卷第5期太陽能學(xué)報(bào)vol 32. No 52011年5月ACTA ENERGIAE SOLARIS SINICAMay,2011文章編號:02540096(2011)05073005全細(xì)胞生物催化竹筍殼制備燃料乙醇的研究王超,姬麗婷,林海萍2(1.漸江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院,杭州311002.浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,杭州31100)摘要:以竹筍殼為原料,采用白腐菌(TST01)對其進(jìn)行預(yù)處理后,選擇纖維素酶和木聚糖酶進(jìn)行酶解,并在酶解產(chǎn)物中添加固定化混合菌種(嗜單寧管囊酵母和釀酒酵母)進(jìn)行乙醇發(fā)酵。結(jié)果表明:白腐菌表現(xiàn)出優(yōu)良的木質(zhì)素降解性能,經(jīng)過24d,木質(zhì)素的降解率達(dá)到621%;6%木聚糖酶和10%纖維素酶混合,在初始p值為4.5的條件下酶解6h,總糖轉(zhuǎn)化率可達(dá)到67.54%;固定化混合菌種在發(fā)酵48h的酒精質(zhì)量濃度可達(dá)到19.84g/L,高于游離混合菌種,也遠(yuǎn)高于單一菌種。關(guān)鍵詞:竹筍殼纖維;白腐菌;酶降解;固定化混合菌種;燃料乙醇中圖分類號:S2162文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A0引言量(干基)分別達(dá)到50%和75%以上。將這些來源廣、產(chǎn)量高的纖維資源通過全生物途徑轉(zhuǎn)化為燃料以可再生的植物纖維原料生產(chǎn)燃料乙醇首先要乙醇,具有廣闊的應(yīng)用前景進(jìn)行預(yù)處理。理化預(yù)處理方法需要專業(yè)的設(shè)備并消耗大量能源且容易造成環(huán)境污染。通過全生物途徑1材料及設(shè)備轉(zhuǎn)化植物纖維原料生產(chǎn)燃料乙醇的研究正如火如1.1材料茶1.1.1竹筍殼高效利用植物纖維原料的關(guān)鍵之一在于如何降采集自浙江農(nóng)林大學(xué)后山,清洗后風(fēng)干備用。解包裹在纖維素晶體外的木質(zhì)素。王宏鄖等研究1.1.2預(yù)處理菌株及其培養(yǎng)基了3株不同種屬白腐菌對玉米秸稈木質(zhì)纖維素的降白腐菌(TST0):浙江大學(xué)分離保藏解能力和規(guī)律;葛春梅等“探討了里氏木霉和雞腿種子培養(yǎng)基:葡萄糖20g/L,玉米漿40g/L菇利用秸稈共發(fā)酵產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的研究。但采用(NH4)2SO40.4g/L,KH2FO40.9gL,MsO4·7H2O全生物途徑將植物纖維原料轉(zhuǎn)化為燃料乙醇的工藝0.4gL,V0.5g/,pH值5.0過程和技術(shù)參數(shù)尚需深人探討。本研究首先利用白基礎(chǔ)培養(yǎng)基:酒石酸銨1mL、微量元素15mL、大腐菌(TST01)固體發(fā)酵的方法破壞木質(zhì)素的復(fù)雜結(jié)量元素15mL,V3mL,加水至培養(yǎng)液體積為50mL,構(gòu)”;再添加生物酶對纖維素和半纖維素進(jìn)行降解,其中酒石酸銨(2.0gL)為氮源,大量元素每升含獲得可被利用的糖類物質(zhì)6;在乙醇發(fā)酵階段,為20 g KH,PO4,13.8gMgO4·7H2O,1, Og CaCI2和0.6g充分利用水解液中的糖類物質(zhì),以嗜單寧管囊酵母NaCl,微量元素每升含035 g EnSO4HO,60 mg Feso4(P. tannophilus)與釀酒酵母(S. cereuisiae)共固定化·7H2O, 110mg CoCI2·6H20,95 mg CusO4·5HO,6mg來發(fā)酵原料水解糖液。AIK(SO4)2·12H2O,6 mg H3 BO3和6mgNa2MoO我國竹類資源十分豐富,全國竹林面積約72x2H20,60 mg ZnsO4·6H2O,Vm的質(zhì)量濃度為100mg/L10°m2,鮮筍年產(chǎn)量已達(dá)217萬t。在竹筍加工過PDA斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯汁200g/L,葡萄糖程中筍基與筍殼均被丟棄,而筍基、筍殼粗纖維含20g/nH值白中國煤化工收稿日期:20100830基金項(xiàng)目:浙江農(nóng)林大學(xué)預(yù)研基金(2008FK66);浙江農(nóng)林大學(xué)大學(xué)生CNMHG學(xué)科研啟動基金項(xiàng)目通訊作者:王超(1978-),男,碩士、講師,主要從事發(fā)酵工程及生物質(zhì)能源方面的研究。 tianshan@ zafu,. edu,cm5期王超等:全細(xì)胞生物催化竹筍殼制備燃料乙醇的研究7311.1.3酶解用酶處理前、后液體中的還原糖量。還原糖測定采用纖維素酶、木聚糖酶購自淅江騰天生物科技有DN比色定糖法(540mm)限公司,酶活分別為4000g和8000yg221單因子試驗(yàn)1.1.4發(fā)酵產(chǎn)乙醇菌株及其培養(yǎng)基設(shè)置pH值、酶的用量和原料處理方式等三因素嗜單寧管囊酵母(P. tannophilus):該菌種能夠?qū)χ窆S殼酶解糖化的影響試驗(yàn)步發(fā)酵木糖和己糖浙江工業(yè)大學(xué)保存;釀酒酵母(1)竹筍殼糖化的起始pH試驗(yàn)(S. cereuisiae):浙江工業(yè)大學(xué)保存設(shè)置pH值分別為455.0556.065和7.0,酵母細(xì)胞培養(yǎng)基:葡萄糖20g/L,(NL)2SO,對竹筍殼進(jìn)行混合酶水解糖化,測定水解后的還原5g/L,蛋白胨20g/L,酵母膏10g/L,瓊脂20g/L糖量。酵母細(xì)胞液體培養(yǎng)基:葡萄糖20g/L,(NL)2(2)混合酶的用量試驗(yàn)5g/L,蛋白胨20g/L酵母膏10gL木聚糖用量分別為2%、6%和10%,對應(yīng)的纖固定化增值培養(yǎng)基:葡萄糖20g幾,木糖20g/L,維素酶量分別為5%、10%和15%,進(jìn)行竹筍殼的混蛋白胨5g/L,酵母膏5g/L,KH4PO42g/L,MgO4·7mH10合酶的水解糖化測定水解后的還原糖量。(3)原料處理方式Ig/Le發(fā)酵培養(yǎng)基:竹筍殼水解液濃縮糖液設(shè)置白腐菌預(yù)處理后的竹筍殼采用直接酶水解、水洗剪碎到0.5cm、風(fēng)干搗碎到0.5cm3種處理90-10g,(NH)SO5gL,酵母膏5gl,KBPO2gL,方式,進(jìn)行混合酶水解糖化,測定水解后的還原糖MgsO4·7H2Olg/L量12設(shè)備2.2.2正交實(shí)驗(yàn)分析天平、生化培養(yǎng)箱、高速組織搗碎機(jī)、精密在竹筍殼水解糖化過程中,對起始pH值、混合pH計(jì)磁力加熱攪拌器、分光光度計(jì)、電熱恒溫水浴酶用量和原理物理處理方式等3個(gè)因素,進(jìn)行3個(gè)鍋、酸度儀、北分瑞利Sp2100色譜儀等。水平的正交試驗(yàn),以確定影響竹筍殼水解糖化的最2試驗(yàn)方法大因素,找出最佳工藝條件。正交設(shè)計(jì)表中水平與因子L(3)各因素的取值范圍見表12.1預(yù)處理階段表1正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)L4(3)2.1.1白腐菌(TST01)種子培養(yǎng)Table 1 Factors and levels of orthogonal test L,(3)在250mL三角瓶中加入100mL種子培養(yǎng)基,于121℃,0.MPa下滅菌15mim,冷卻。用10m無菌水水平pH值混合酶用量原料處理方式洗下保存于PDA斜面上的白腐菌并倒入上述的液X-2、C5直接酶解體培養(yǎng)基中,用四層紗布包住瓶口,置于水浴搖床,X-6、C10水洗剪碎30℃、180r/min振蕩培養(yǎng)48~60h35.5X-10、C15風(fēng)干搗碎2.1.2竹筍殼預(yù)處理注:X、C分別表示木聚糖酶和纖維素酶;X2、C5分別表示準(zhǔn)確稱取竹筍殼1og,加2倍于原料質(zhì)量的基礎(chǔ)2%的木聚糖酶和5%的纖維素酶培養(yǎng)基水溶液,于12l℃、0.MPa下滅菌15mn,冷卻2.3乙醇發(fā)酵階段后每瓶接入已培養(yǎng)好的菌懸液10%,搖勻30℃保溫2.3.1酵母細(xì)胞菌懸液的制備培養(yǎng),間隔4d取樣,檢測木質(zhì)素纖維素和半纖維素將保存的試管菌種接入酵母細(xì)胞培養(yǎng)基上活的含量?；?釀酒酵母2d,嗜單寧管囊酵母4d,活化后的菌種2.2酶解階段接入液體培養(yǎng)基中,在30℃、100r/min條件下活化在50m三角瓶中,加入經(jīng)過微生物預(yù)處理后24,得中國煤化工的竹筍殼10g,木聚糖酶用量6%(以酶液對竹筍殼2.3.2CNMHG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示)、纖維素酶用量10%,固液比1:10分取嗜單丁管襄醉母和釀酒酵母各4mL菌懸pH值為45,置于50℃恒溫處理6h,重復(fù)3次,測定液與96mL3%的海藻酸鈉溶液于常溫下混合,注入太陽能學(xué)報(bào)32卷150mL2%CaCl2水溶液中,固化4h,用無菌水將固32單因素試驗(yàn)結(jié)果化后的海藻酸鈉凝膠球洗滌3次,再移入150mL1%3.2.1竹筍殼糖化的起始pH值試驗(yàn)A2(SO4)3溶液中,放置4℃冰箱中固化24hpH值對竹筍殼水解糖化的影響見圖2。從圖223.3酒精發(fā)酵可以看出,pH值在4.5~5.5之間時(shí),竹筍殼的糖化將增值培養(yǎng)后的固定化凝膠球用無菌水洗滌3率無明顯差異,以pH值為5.0的糖化率最高,酶活次后,移入發(fā)酵培養(yǎng)基中。發(fā)酵液體積與凝膠球的性最大;在pH值為55時(shí)糖化率開始明顯降低,當(dāng)堆積體積為3:2,其中發(fā)酵液體積為50m,總體積為pH值為7.0時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)。因此,pH值為5.0是竹80mL。固定化混合菌種置于30℃、100/mim搖床上筍殼酶水解糖化的最適pH值,總糖轉(zhuǎn)化率為恒溫發(fā)酵,固定化釀酒酵母置于30℃烘箱中靜止發(fā)584%。酵。利用固定化細(xì)胞進(jìn)行重復(fù)式發(fā)酵,即每一批發(fā)酵結(jié)束后,收集發(fā)酵液,接入新鮮發(fā)酵液。2.3.4乙醇含量測定發(fā)酵結(jié)束后,先對發(fā)酵液進(jìn)行常壓蒸餾,然后用部氣相色譜檢測乙醇含量。使用北分瑞利色譜儀10%FFAP填料柱3mx3m。色譜條件:進(jìn)樣器溫H值度150℃,柱溫110℃,載氣H2流速20mL/min,進(jìn)樣圖2pH值對竹筍殼酶解總糖轉(zhuǎn)化率的影響量1L,檢測器TCD溫度為130℃。Fig 2 Effects of ph value on lignocellulosic degrading with enzymes3結(jié)果與討論322酶用量的影響由圖3可以看出,在一定的酶濃度范圍內(nèi),隨著31竹筍殼生物處理過程中組分的變化酶用量的增加,總糖轉(zhuǎn)化率提高。木聚糖酶由2%在用白腐菌(T)對竹筍殼進(jìn)行預(yù)處理的過增加到6%,纖維素酶從5%提高到10%,總糖化率程中定期取樣進(jìn)行組分測定觀察生物預(yù)處理對竹提高了近10%;但木聚糖酶和纖維素酶的酶量再分筍殼組分的影響,結(jié)果見圖1別增加到10%和15%時(shí),總糖轉(zhuǎn)化率增加不明顯。50-纖維素一·半纖維素一木質(zhì)素因此,酶用量以木聚糖酶6%和纖維素酶10%比較適宜。時(shí)間/dX-2.C.5X-6C-10X10、C-15混合酶用量圖1白腐菌(TSTr01)處理期間竹筍殼木質(zhì)纖維素含量變化圖3酶用量對總糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig 1 Variety of lignocellulose in the period ofFig 3 ELects of enzymes concentrationdegradation by White rot fungi TST-01clarification由圖1可知,經(jīng)過生物預(yù)處理,竹筍殼中中木質(zhì)3.23原料處理方式素的降解率最大,由處理前的156%降為62%,降竹筍殼纖維質(zhì)不同預(yù)處理方式的酶水解糖化效解率為621%。而纖維素和半纖維素在處理24d的果見圖4。圖4表明,竹筍殼經(jīng)過白腐菌預(yù)處理后,降解率分別為45.0%和37.4%。由此可知,TT01其作為酶解原料時(shí)的處理方式對酶水解糖化有明顯菌具有優(yōu)良的木質(zhì)素降解性能。木質(zhì)素被部分降解影中國煤化工達(dá)54.6%;而風(fēng)干后木質(zhì)素與纖維素半纖維素組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)被破搗碎∏CNMH總糖轉(zhuǎn)化率并不壞,有利于下一步酶解過程的進(jìn)行。比水洗剪碎高,這可能是由于風(fēng)干影響了酶的作用,5期王超等:全細(xì)胞生物催化竹筍殼制備燃料乙醇的研究733酶在水分存在時(shí)吸附于原料表面有助于水解的進(jìn)酵母菌不能充分糖分。同時(shí),為了探明固定化混合行菌種的發(fā)酵性能,對比研究了固定化混合菌種游離混合菌種、游離釀酒酵母、游離嗜單寧管囊酵母、固定化釀酒酵母和固定化嗜單寧管囊酵母分別發(fā)酵水解液的情況。由表3可知,固定化菌種的發(fā)酵效果均優(yōu)于游離菌種。游離混合菌種在發(fā)酵48h的酒精質(zhì)量濃度直接酶解水洗剪碎風(fēng)干搗碎處理方式為1681gL,而固定化混合菌種在發(fā)酵48h的酒精質(zhì)量濃度可達(dá)到19.84g/L?？傮w而言,固定化混合圖4酶解原料物理處理方式對總糖轉(zhuǎn)化率的影響菌種的發(fā)酵效果明顯優(yōu)于單一菌種,也優(yōu)于游離混Fig 4 Efects of methods of material treatment on the合菌種。rate of saccarification表3不同類型菌種發(fā)酵結(jié)果對比33正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Fermentation results for different microorganism正交試驗(yàn)結(jié)果以及因素水平極差分析的結(jié)果如菌種類型酒精質(zhì)量濃度/gL表2所示?？梢钥闯?在被考察的影響總糖轉(zhuǎn)化率游離嗜單寧管囊酵母的3個(gè)因素中原料酶解前的處理方式影響最大,其固定化嗜單寧管囊酵母15.49次是酶解初始pH值混合酶用量影響最小。根據(jù)表游離釀酒酵母2的均值數(shù)據(jù)分析可知各因素的優(yōu)化參數(shù)為固定化釀酒酵母15.24AB2C,即初始pH值45,混合酶用量為6%木聚糖游離混合菌種定化混合菌種酶和10%纖維素酶,酶解前原料的處理方式為水洗剪碎。在該條件下,總糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到6754%。4結(jié)論表2正交試驗(yàn)方案和結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment for the rate of saccarification本研究采用生物降解木質(zhì)素的預(yù)處理方式,添加外源酶水解纖維素和半纖維素,并采用固定化混試驗(yàn)號回值混合酶用量原料處理轉(zhuǎn)化率合菌種將對糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇,得出如下初步結(jié)方式論1)預(yù)處理階段,白腐菌(TsT01)表現(xiàn)出優(yōu)良的61.74木質(zhì)素降解性能,經(jīng)過24d,木質(zhì)素的降解率達(dá)到2345678962.1%,同時(shí)纖維素和半纖維素也能適當(dāng)降解。這對下一階段纖維素酶和半纖維素酶發(fā)揮作用奠定了61.58良好的基礎(chǔ)。相比較于化學(xué)處理方式,生物預(yù)處理33332.94方式不但能減少污染,而且還簡化了操作工序;39.462)酶解時(shí)各因素水平的最優(yōu)組合為:初始pH值為45,混合酶用量為6%的木聚糖酶和10%的纖K114588120014660維素酶;酶解前原料的處理方式為水洗剪碎。在該K2134.32132.4454.56條件下總糖轉(zhuǎn)化率可達(dá)到6754%;K3120.021129311293k48.633)發(fā)酵產(chǎn)乙醇階段,固定化混合菌種在發(fā)酵k244.7744.1551.5248h的酒精質(zhì)量濃度可達(dá)到1984gL,高于游離混合k340.0137.6437.64菌種,V凵中國煤化工CNMHG3個(gè)階段分步進(jìn)3.4發(fā)酵產(chǎn)乙醇結(jié)果行達(dá)到∫較好時(shí)奴果。但在后實(shí)研究中,應(yīng)探索將酶解后的糖液同時(shí)存在戊糖和己糖,單一選用其中的2個(gè)甚至3個(gè)過程耦合以及時(shí)消除反饋抑制32卷的影響,從而提高轉(zhuǎn)化率。但乙醇濃度過高,將影響6] Hu Kuijuan,WuKe, Pan renrui,tal. Solid-state mixed菌株和酶的活性,必須及時(shí)析出乙醇,這些問題將是fermentation increases activities of xylanase and cellulose[J]以后研究的重點(diǎn)。Mycosystema,2007,26(2):273-278[7] Lin Jie, Tan Zhaozan, Luo Weicheng. Study on coferment[參考文獻(xiàn)]tion using cassava residue by mixed cellulolytic strains[J].JSafety Environ,2005,5(6):26-27[1] Tyson K S, Bozell J, Wallace R, et al. Biomass oil analysis:Research needs and recommendations[門].NP5[8]謝濤,陳佩.竹筍殼纖維組分的組合分離技術(shù)研究[J.湖南工程學(xué)院學(xué)報(bào),2008,18(2):72-7534796,2004[2]王超,章超樺.酶解纖維素類物質(zhì)生產(chǎn)燃料酒精的9]李慧蓉白腐真菌生物學(xué)和生物技術(shù)M]北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005,166-167研究進(jìn)展[J.纖維素科學(xué)與技術(shù),2003,11(4):52[10] Kang Liping, Liu Li, Liu Ping, et al. Production of fuel etha[3] Wang Hongxun, Du Fuyou, Zhang Xiaoyu. 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School of Agriculture and Food Science, Zhejiang Agriculture and Forestry Uninersity, Hanghou 311300, China;2. School of Forestry and Bio-technology, Zhejiang Agriautre and Forestry University, hangahou 311300, China)Abstract: After being pretreated on bamboo shoots shell fiber by microbial retting, foreign xylanase and cellulose werechosen for the use of enzymatic degrading. And Pachysolen tannophilus and Saccharomyces cerevisiae yeast cells were co-immobilized by entrapment in marine alga calcium gel. Fermentation of bamboo shoots shell fiber hydrolysate was studiedusing the immobilized yeast cells. The experiment results indicated that the degradation rates of lignin is 62. 1% aftercultivation for 24d by white-rot fungi. The highest rate of saccharification reaches 67.24% at the beginning of pH 4.5the optimal enzyme concentrations are xylanase of 6% and cellulose of 10%, respectively. The fermentation resultsare superior to those obtained with suspended multi-microorganisms, or separate samples of immobilized P. tannophilusor immobilized S. cerevisiae, and the ethanol yield coefficient reaches a maximum of 19 84g/LKeywords: bamboo shoots shell fiber; white-rot fungi enzymaticTYH中國煤化 Microorganisms;fuelCNMHG