生物技術(shù)通i164LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol.12 No.3 Aug.2001聚乙二醇修飾牛血清白蛋白的反應(yīng)與分析'李偉軍鄭春輝張達(dá)磊張穎蘇志國”(中國科學(xué)院化工冶金研究所生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京10080)Q5|A摘要采用N，N'-羰基二咪唑活化法活化單甲氧基聚乙二醇 5000分子一端的羥基,對(duì)活化后的單甲氧基聚乙二醇分子進(jìn)行了元素分析。用該活化產(chǎn)物對(duì)牛血清白蛋白的賴氨酸側(cè)鏈氨基進(jìn)行化學(xué)修飾。應(yīng)用毛細(xì)管電泳對(duì)聚乙二醇修飾后的產(chǎn)物進(jìn)行了分析,并與高效液相色諾分析結(jié)果作了對(duì)照研究,表明毛細(xì)管電泳對(duì)絡(luò)飾后的牛血清白蛋白有更好的分析效果。關(guān)鍵詞牛血清白蛋白.聚乙二醇。修飾，分析 ,毛細(xì)管電泳Modification of bovine serum albumin with polyethylene glycol derivative andrelated analysis techniquesLI Wei-Jun, ZHENG Chun Hui, ZHANG Da-Lei, ZHANG Ying, SU Zhi-Guo( Sate Key Laboratory of Biochemical Engineering，Institule of Chemical Mtallurgy.Chinese Academy of Scienes, Beijing 10080, P . R . China)Abstract Monomethoxypolythylene glycol (MPEG) was activated by N, N'-carbonyldimidazole. The activated MPEG was char.acterized by element analysis and used to modify bovine serum albumin (BSA). HPLC and capillary electrophoresis were appliedto analyze the modified products. Capillary electophoresis was evaluated站a convenient lcchnique in the analysis of MPEG modi-fied proteins.Key words bovine serun albumin, polyelhylene glycol, modication, analysis, capillary elecrophoresis隨著生物技術(shù)的發(fā)展,蛋白類藥物的應(yīng)用越來飾可以有效降低牛血清白蛋白的免疫原性,修飾后越廣泛。蛋白質(zhì)屬天然抗原，某些異源藥用蛋白質(zhì)的牛血清白蛋白可以作為血液代用品之一代替人血進(jìn)入人體后會(huì)誘發(fā)抗體抗原反應(yīng)而被清除,甚至?xí)灏椎鞍?HSA)(*.s。與傳統(tǒng)的三氯均氰活化法相導(dǎo)致過敏反應(yīng)。一些有治療前景的蛋白質(zhì),在體內(nèi)比,經(jīng)N, N'羰基二咪唑(N, N'-carbonyldiimidazole,易被蛋白酶降解,存留時(shí)間太短,而達(dá)不到治療效CDID)活化的PEC具有反應(yīng)條件溫和,被修飾蛋白果。研究表明,以聚乙二醇( polyethylene glycol,活性喪失較小，體內(nèi)半衰期較長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)6，1。我們PEC)、葡聚糖等大分子作修飾劑對(duì)蛋白質(zhì)(多肽)的采用CDID活化單甲氧基聚乙二醇(MPEC),并用此某些氨基酸殘基進(jìn)行化學(xué)修飾,可以改善蛋白質(zhì)的對(duì)牛血清白蛋白進(jìn)行修飾。.藥用性質(zhì),消除其免疫原性,延長(zhǎng)在體內(nèi)的停留時(shí)PEG是一類親水的、有一定分子量分布范圍的間,同時(shí)保持原有的生理活性"。因此,采用大分子電中性大分子化合物,其水力學(xué)半徑較大.在溶液中修飾劑,對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行特異位點(diǎn)的化學(xué)修飾的的形狀不規(guī)則,這給PEG修飾蛋白質(zhì)的分析分離帶工作已成為生化藥物研究的熱點(diǎn)”,而PEG是蛋白來很大困難,迄今尚未確立- -種簡(jiǎn)便可靠的分析方質(zhì)化學(xué)修飾中應(yīng)用最廣泛的大分子修飾劑之一法8)。毛細(xì)管電泳是近年發(fā)展起來的研究生物大分目前，一些重大傳染病(如艾滋病.乙型肝炎)的子的新型手段,已被引人PEG修飾蛋白質(zhì)的分析流行使人們不得不重新考慮異體輸血和使用血液制中, PEC修飾蛋白質(zhì)在毛細(xì)管電泳過程中按所聯(lián)品過程中潛在的危險(xiǎn)性，而開展血液代用品(bloodPEC個(gè)數(shù)的不同而依次分離19.101。我們采用毛細(xì)管substitute)的研兗是解決這一問題的有效途徑'”。中國煤化工Inada等采用經(jīng)三氯均氰(cyanunic chorde)法活化的0HCNMHG8)1助PEG對(duì)牛血清白蛋白(BSA)進(jìn)行修飾,認(rèn)為PEC修” 通訊聯(lián)系入李偉軍等:聚乙二醇修飾牛血清白蛋白的反應(yīng)與分析電泳對(duì)PEG修飾的牛血清白蛋白進(jìn)行了分離分析,儀。主機(jī)為Sysemn Gold Progannable Solvent Module 126 系統(tǒng).并與HPLC方法作了對(duì)比。紫外檢測(cè)器為BeckmanDiodeArayModule168.檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，反柑液相色譜柱為Beckman Ultrapore C, column, 4.6 mm x1材料與方法75 mm,采用System Gold專用軟件系統(tǒng)處理數(shù)據(jù)。流動(dòng)相為A:0.1%三氟乙酸水溶液;B:含0.1%三氟乙酸的乙脯.線性梯度洗脫.10%-90%B(30min).流速0.6m/min.經(jīng)1.3步驟1.1 材料BSA購自中國科學(xué)院上:海生物化學(xué)研究所, MPEC購自處理后的樣品可以直接進(jìn)樣.每次進(jìn)樣量為20 yuls .美國Union Catbide公司(相對(duì)分子質(zhì)量5000+250),2,4,6-三1.7毛細(xì)菅電泳 分析采用美國Beckman公司P/ACE 5000毛細(xì)管電泳系統(tǒng)。電硝基苯磺酸( rnirtbenenenslufonire acid, TNBS)購自美閏Sigma泳緩沖液為0.05 mol/L磷酸緩沖液,pH2.5.使用前經(jīng)超聲波公司,CDID購自瑞七Fluka 公司。乙腈為美國Merck公司產(chǎn)徐氣,經(jīng)0.45 pum微孔濾膜過濾。普通熔融毛細(xì)管柱(河北水品。其它藥品為分析純。所有溶液均用RiOs超純水系統(tǒng)年光導(dǎo)纖維廠)與自制線性聚內(nèi)烯酰胺涂漬柱川總長(zhǎng)均為27(Millipore.美國>生產(chǎn)的超純水配制。cm,有效長(zhǎng)度19.4 cm,內(nèi)徑50 pum。紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為1.2MPEC的活化稱取MPEG 10g, CDID1.95g,溶于40 ml 1,4二氧六環(huán)200 mm,恒壓操作模式,運(yùn)行電壓為10kV(+→-),柱溫為25士0.1C。采用P/ACESation1.0電泳數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)處理數(shù)中。待溶解后于37C下攪拌反應(yīng)2h。F0下，向上述反應(yīng)混合物中逐滴加人乙醚，并于滴加據(jù)。壓力進(jìn)樣3.4474 kPa/3s。 每次運(yùn)行前用電泳緩沖液沖洗過程中不斷攪伴，所加乙醚約為40 ml。所得沉淀用C4漏斗過柱子3 min.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用超純水沖洗毛細(xì)管柱5- 10 min,然濾,用乙醚洗滌3-4次,所得沉淀經(jīng)真空干燥.得白色固體9.6后保存。經(jīng)1.3步驟處理后的樣品可以直接進(jìn)樣。g,即為CDID活化后的MPEG術(shù)生物(簡(jiǎn)記為CDIDMPEC)。2結(jié)果與討論1.3 MPEG修飾蛋白質(zhì)向2mg/ml的BSA溶液(pH8.5,0.05mol/L的borate緩沖2.1 MPEG 的活化與蛋白質(zhì)修飾反應(yīng).液配制)中加入一定量的CDID-MPEG, BSA與CDID- MPEG的摩爾比例為1:60。將以上溶液混合均勻,置于4C下連續(xù)攪PEG有不同種類,-般采用相對(duì)分子質(zhì)量5 000拌。72h后,將反應(yīng)混合物在5000 r/min下離心I5 min, 以的單甲氧基聚乙二醇選擇性修飾蛋白質(zhì)分子賴氨酸AmiconSuredCell8200超濾器和截留相對(duì)分子質(zhì)量為30000側(cè)鏈的ε-氨基或N末端的a-氨基。的YM30超濾膜Millipore公司,美國)超濾除去小分子雜質(zhì)，對(duì)所得的CDID-MPEG作C、H、O、N元素分析.超濾體積為反應(yīng)體積的20倍。圖1示MPEG的話化與修飾結(jié)果見表1。以元素N的實(shí)測(cè)含量與理論含量的相蛋白質(zhì)的反應(yīng)。對(duì)值表示MPEG的活化度,為82%。MPEG-OH + L，N(CDID)表1 CDID-MPEG的元素分析結(jié)果%尤素理論值實(shí)刪值54.3753.24H8.988.036.0136.77MPEG-0(CDID-MPEG)ia0.550.4Protein-NH2-TNBS法測(cè)得MPEC修飾產(chǎn)物( MPEG-BSA)的修飾度為平均每分子BSA偶聯(lián)4.8個(gè)MPEC。MPEG - -0N- Protein (MPEG Protein)2.2反相高效液相色譜分析MPEG-BSA采用C;反相高效液相色譜對(duì)MPEC-BSA進(jìn)行圈1MPEC的活化與修飾蛋白質(zhì)的反應(yīng)了分析,結(jié)果見圖2。天然BSA與被修飾BSA之間1.4 元素分析以元素分析法測(cè)定活化后的MPEG的C、H.0、N的百分的保留時(shí)間差異較大,但被修飾BSA不能再作進(jìn)一含量。C.H.N的分析用CHN- Rapid元素分析儀(Heraeus,德步的分離。MeGoff等曾采用C4反相高效液相色國),0的分析用ST-02元素分析儀(北京分析儀器廠)。譜對(duì)MPEG-SOD進(jìn)行了分析研究,本文結(jié)果與之相1.5 TNBS法測(cè)定蛋白修飾度類似。我們?cè)捎幂^緩的洗脫梯度,在70 min內(nèi)將參照Hlabeeb的方法:"。中國煤化工:被修飾BSA作進(jìn)--1.6 高效液相色譜分析片CN MH G緩沖液)與天然BSA采用美國Beckman公司System Golid多用途高效液相色諧之間的保留時(shí)間相差很近。圖2中峰1.2.3對(duì)應(yīng)的坐物技術(shù)通ifLETTERS IN BIOYTFCHNOILOCY Vol.12 No.3 Aug.2001保留時(shí)間分別為1.8 min.2 .0 min.17.3 minc標(biāo)準(zhǔn)""對(duì)圖2中A譜圖進(jìn)行計(jì)算.衣明約有20%的BSA未被MPEC修飾(未被修飾的BSA可通過凝膠過濾除去,另文報(bào)道).而TNBS方法只能測(cè)定蛋白平均修飾度,不能判斷殘存大然蛋白的量與被修飾組分的數(shù)量分布。相比之下，毛細(xì)管電泳具有分析速度快(15 min內(nèi)),定量準(zhǔn)確,所需樣品量少(進(jìn)樣量小于10nl/次)等特點(diǎn),適于PEG修飾蛋白制品的質(zhì)量控制,值得進(jìn)-步研究..15t/min參考文獻(xiàn)圈2 MPEC-BSA 的高效液相色譜分析圍譜1.非保留組分: 2. 天然BSA組分: 3. 被修飾BSA組分王樹歧.金晶.馬淑哲。 蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾與生化藥物.中國?；幬镫s志1998,19: 2242.3毛細(xì)管電泳分析MPEG-BSALundualad RL, Brnulshaw RA. Application of sie speeifir ehenical mod.采用毛細(xì)管電泳對(duì)MPEC-BSA進(jìn)行分離分析,ification in the manuiecture of bophameaceuticals: 1. An overvien. Biv-technol Appl Biochero, 1997, 26: L43見圖3。圖3中A為采用聚丙烯酰胺涂漬毛細(xì)管柱Li W. Zhang D. Lin B. Su 7.. Purificat1on and dntification of PEGlet-進(jìn)行的分離譜圖,B為普通毛細(xì)管柱的分離譜圖eed henoglobin. 0 potenial blood subeitute by eronstography and cup聚丙烯酰胺涂漬毛細(xì)管柱可有效地對(duì)MPEG- BSA混ilary eleoporesis. Chomalographia, 200 S2: 451Inada Y. Frukawa M, Sasaki H a al. Biomedical and biutechnological合物進(jìn)行分離,而普通毛細(xì)管柱不能將MPEG-BSAapplications of PEG- and PM modified proteins. Trends Biotechnol .混合物分開。其原因是采用線性聚丙烯酰胺靜態(tài)涂1995，13; 86柱法對(duì)毛細(xì)管內(nèi)壁改性后,可有效減少蛋白在毛細(xì)5 Sasaki H, Ohtake Y, Matsushimm A et al . Reduction of immunoreactiv-ity of bwvine seum albunin corajugated with comb sharped plyethylene管壁的不可逆吸附,有利于提高分離度川。gyol dervatives. Biochem Biophys Res Conmun. 1993. 197: 287Beuchamp co, Gonia sL, Menepace DP el al. A new procedure ferthe syntheis of polythylene gyeol-procin adducts: eftets on function,receplor reoguition, and clearance of superoxide dsnutase. lacofemin.and a2- macroglobulin. Anal BRiochem. 1983. 131; 25KajiharaJ, Shibeta K, Nakano Y es al. Physicheraicat characteiza.|Ption of PEC PPG eonjugated human uroknse. Biorhim Riophys Acta.1994，199: 202Roberts MJ, Harris JM. Attachnent of degnadable pouly( ethylene glycul)CDIDto proteins has the potential to increse therpeuir eficucy. J PharmSei, 1998. 87: 1440Bulock J, Chowdhury s, Severdia A eal. Comparison of resuls of v歸-20rious methods used to determine the exlent of modifieation of methoxypolyetbylene glycol 5000 modified bovine euprie-zine superoxide dig-圖3 MPEC-BSA 的毛繃臂電泳圈譜mutase. Anal Bixchem. 1997, 254: 254A.徐潰毛細(xì)管柱; B.普遁 毛細(xì)管柱.10 Li w. Zhong Y, Lin B. Su z. Characterization of plyethylere glyrol.mdied proteing by senu- squcous epllay eoporsis. J Chroma-P。為天然BSA;P、P2. P分別表示偶聯(lián)有1.2.3↑個(gè)togr A. 2001, 905: 299MPEG分子的BSA:CDID為N. N'羰基二瞇唑1 Habeeb AFSA. Deternination of free anino groups in protcine by trimi-通過內(nèi)標(biāo)法可知P。為未修飾的BSA,修飾產(chǎn)物trobenzenesulfonie ncid. Anal Biochem. 1966. 14: 3282 HanF, XueJ, Lin B. Manitoal inluence on the separation DNA frag-中殘留-部分游離的CDID.實(shí)驗(yàn)過程中,曾將活化ments by capillary leetrphoresis in eniangled polymer sultions。Talan-的CDID-MPEC以及未活化的MPEG進(jìn)樣電泳,在此u, 1998, 46: 735條件下30 min內(nèi)仍不出峰,說明這兩種物質(zhì)不會(huì)干13 MeCoff P, Baziokis AC. Maskiewier R. Andlyis of polyethylene gkjyculmodified uperoxide disnulse by chromatographie. ertophuretie 。擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。light sattring. chenical and enzymoetie methols. Chem Pharm Bull. ,毛細(xì)管電泳譜圖(圖3A)顯示的蛋白修飾度顯1988. 36: 3079然比TNBS測(cè)定值低。Bullock 等已報(bào)道過這一差中國煤化工: manal. Flere:: Rrk.異,認(rèn)為MPEG活化行生物本身的親核性會(huì)使TNBSfYHC N M H G2001:02.23收稿>測(cè)定時(shí)的結(jié)果偏高|9。我們以校正峰面積作為定量