第41卷第2期東北師大學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版Vol, 41 No. 22009年6月Journal of Northeast Normal University(Natural Science Edition)June 2009[文章編號(hào)]10001832(2009)020154-06乙醇濃度對(duì)人參多糖分離的影響朱梅',畢宏濤2,楊威2,劉楊2,臺(tái)桂花2,周義發(fā)(1.北華大學(xué)化學(xué)與生物學(xué)院,吉林吉林132013;2.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春130024)[摘要]研究了不同濃度的乙醇對(duì)人參多糖分離的影響.結(jié)果表明,乙醇濃度在很大程度上影響著人參多糖的分離效果和產(chǎn)率,通過對(duì)不同濃度乙醇提取和沉淀的多糖組成和相對(duì)分子質(zhì)量的分析,得出了分離人參多糖的簡(jiǎn)便方法:依次用體積分?jǐn)?shù)為70%,50%,30%的乙醇和蒸餾水提取,經(jīng)大孔樹脂和透析分離,可分別得到皂甙、單寡糖、中性多糖和酸性多糖;人參水提取液經(jīng)40%,60%,70%的乙醇分步醇沉,可分別得到不同相對(duì)分子質(zhì)量的多糖和單寡糖,[關(guān)鍵詞]人參多糖;索氏提取法;乙醇分級(jí);人參寡糖[中圖分類號(hào)]Q538[學(xué)科代碼]180·1720[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A人參( Panax ginseng C.A. Meyer)是五加科( Araliaceae)人參屬植物,其根為名貴中藥,在我國(guó)和亞洲有著數(shù)千年的藥用歷史.人參具有多種藥理功能,其活性成分為人參皂苷、多糖、多肽和少量的小分子物質(zhì).人參多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、降血糖等藥理活性(210,近些年來隨著糖生物學(xué)研究的迅速發(fā)展,人參多糖也越來越多地引起了人們的關(guān)注,大量的研究表明,人參多糖的相對(duì)分子質(zhì)量和組成與活性有著密切的關(guān)系15.通常水提取的人參多糖往往含有人參單寡糖和人參皂甙,需要經(jīng)過復(fù)雜的分離純化過程才能得到人參多糖純品,影響人參多糖的研究和應(yīng)用.本文探討了利用不同濃度的乙醇提取人參多糖和沉淀人參多糖的過程,并對(duì)所得人參多糖的產(chǎn)率和組成進(jìn)行了研究,以期優(yōu)化一種簡(jiǎn)便易行的分離人參多糖的方法1實(shí)驗(yàn)部分1.1材料、試劑與儀器實(shí)驗(yàn)所用干燥人參根購(gòu)于吉林省撫松縣人參種植基地,經(jīng)粉碎后用于人參多糖的提取.單糖、二糖及三糖標(biāo)準(zhǔn)品均為 Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品, Sephadex G-75凝膠為 Pharmacia公司產(chǎn)品,D101型非極性大孔樹脂(凈品級(jí))為天津海光試劑有限公司產(chǎn)品,其余均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?yàn)儀器: Shimadzu10ATvp高效液相色譜儀(日本島津);723型分光光度計(jì)(上海精科);FD1A冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康);z36-HK高速冷凍離心機(jī)(德國(guó) Herrle)1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1不同濃度乙醇提取分級(jí)人參多糖1.2.1.1人參多糖的提取將50g人參干粉裝入索式提取器中,加入300mL99.7%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇80℃條件下進(jìn)行索式提取,每隔1h用薄層層析法(TLC)檢測(cè)虹吸回流的液滴,待硅膠板上各點(diǎn)的顏色基本消失時(shí),停止加熱;冷卻至室溫后離心將提取液和殘?jiān)蛛x提取液旋轉(zhuǎn)蒸依次用90%,80%,70%,60%,50%,30%的乙醇溶液和蒸H中國(guó)煤化工按照上述操作CNMHG[收稿日期]2009-01-23[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)H(30770489);吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20070710)[作者簡(jiǎn)介]朱梅(1963-),女,副教授,主要從事藥用植物資源研究;周義發(fā)(1962-),男博士,教授,博士研究生導(dǎo)師,主要從事多糖的結(jié)構(gòu)與功能研究第2期朱梅,等:乙醇濃度對(duì)人參多糖分離的影響l551.2.1.2人參多糖的分離采用D101型非極性大孔樹脂對(duì)提取液中的皂甙和糖類化合物進(jìn)行分離,樣品依次用蒸餾水和梯度乙醇溶液洗脫,TLC跟蹤檢測(cè)1.2.1.3TLC檢測(cè)人參多糖、單寡糖及皂甙采用硅膠G薄層層析板(厚約0.25mm);展層劑為氯仿與甲醇的混合溶液(v(氯仿):V(甲醇):v(水)=65:35:10);顯色劑為5%硫酸乙醇溶液在此檢測(cè)條件下,人參多糖由于極性大而位于原點(diǎn)處且為黃色斑點(diǎn);人參皂甙和人參單寡糖由于極性相對(duì)較小而隨展層劑展開,人參皂甙為粉紅色斑點(diǎn),人參單寡糖為黃棕色斑點(diǎn)斑點(diǎn)顏色的深淺與物質(zhì)的含量直接相關(guān),顏色越深含量就越高,因此可以用TLC估算出產(chǎn)物中人參多糖、人參皂甙和人參單寡糖的相對(duì)含量1.2.2不同濃度乙醇沉淀分級(jí)人參多糖將500g人參干粉用蒸餾水進(jìn)行索氏提取,提取液濃縮至2L后,等分成4份備用1.2.2.1分別醇沉取3份濃縮液緩慢加入96%的乙醇,使乙醇的體積分?jǐn)?shù)分別達(dá)到70%,75%和80%;靜置過夜,離心,得到的上清和沉淀分別記作:GRS1和GRP1;GRS2和GRP2;GRS3和GRP3,沉淀常規(guī)干燥,上清旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇后冷凍干燥.1.2.2.2分步醇沉取1份濃縮液,緩慢加入96%的乙醇,使乙醇的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到40%靜置過夜,離心,沉淀(GRPa)常規(guī)干燥;向上清繼續(xù)加入96%乙醇,使乙醇的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%,靜置過夜,離心,沉淀(GRPb)常規(guī)干燥;再向上清中加入96%乙醇,使乙醇的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%靜置過夜,離心,沉淀(GRPc)常規(guī)干燥,上清(GRS’)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇后冷凍干燥1.2.3相對(duì)分子質(zhì)量分布檢測(cè)采用 Sephadex G75(2cm×100cm)凝膠色譜柱檢測(cè)所得產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量的分布,洗脫液為0.15mol/ L Nacl,洗脫速率0.15mL/min,苯酚-硫酸法連續(xù)檢測(cè).1.2.4單糖組成分析1.2.4.1樣品的甲醇解及酸水解稱取2mg樣品,加入1mL2mol/L的無水鹽酸甲醇,充氮?dú)夥夤?80℃水解16h;氮?dú)獯蹈珊?再加入1mL2mol/L三氟乙酸,120C水解1h,水解產(chǎn)物轉(zhuǎn)入蒸發(fā)皿中,加入適量無水乙醇除去三氟乙酸,水浴蒸干1.2.4.2單糖衍生物的制備衍生化過程參照文獻(xiàn)[16]的方法稍作改進(jìn):向樣品水解產(chǎn)物中加入0.5mL1-苯基3-甲基5-吡唑啉酮(PMP)試劑和0.5mL0.3mol/ L NaOH溶液,70℃反應(yīng)30min,鹽酸中和,氯仿萃取過量的PMP試劑后,對(duì)所得的單糖PMP衍生物進(jìn)行HPLC分析.1.2.4.3高效液相色譜分析采用 Shimadzu10ATvp高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行色譜分析,檢測(cè)波長(zhǎng)245nm,色譜柱 DIKMA Inertsil ODs3(5pm,150mm×4.6mm),柱溫35℃,流速1.0mL/min,流動(dòng)相:18.7%乙腈+81.3%磷酸鹽緩沖液(0.1mol/L,pH=7.0)2結(jié)果與分析2.1不同濃度乙醇提取人參多糖2.1.1第一次索氏提取中國(guó)煤化工為了進(jìn)行提取條件的初步篩選,分析人參中皂甙、單寡糖HCNMHG取時(shí)的分布情況第一次索氏提取采用了99.7%90%,80%,70%,60%,50%,30%的乙醇溶液和蒸餾水8個(gè)濃度梯度.提取結(jié)果見表1,其中提取時(shí)間為TLC檢測(cè)不到提取物的時(shí)間.由表1可見80%的乙醇所需的提156東北師大學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)第41卷取時(shí)間最短,80%以下濃度的乙醇所需提取時(shí)間明顯增長(zhǎng),說明人參中皂甙比多糖更易于提取由于最初的乙醇濃度較高提取物多數(shù)是易溶于醇的皂甙隨著水的增多,寡糖逐漸被提取出來,水到達(dá)70%時(shí),只有多糖被提取來這樣,大部分人參皂甙被90%的乙醇提取出來,其余皂甙存在于乙醇體積分?jǐn)?shù)≥70%的提取物中,單寡糖存在于90%~50%的乙醇提取物中,多糖存在于乙醇體積分?jǐn)?shù)≤60%的提取物中,其中30%乙醇和蒸餾水的提取物中只有多糖,多糖提取量最大表1第一次索式提取的結(jié)果實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目乙醉提取液體積分?jǐn)?shù)/%提取時(shí)間/h甙單寡糖單寡糖多糖(含量從多到少排列)皂甙單寡糖單寡糖單寡糖提取物質(zhì)量/g1.520.93產(chǎn)率/%3.04由此可知,70%的乙醇可以將絕大部分人參皂表2第二次索式提取的結(jié)果甙提取出來,50%的乙醇可以將剩余的人參單寡糖乙醇提取液體積分?jǐn)?shù)/%實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目提取出來,30%的乙醇和蒸餾水提取的基本是不摻70提取時(shí)間/h雜皂甙和單寡糖的人參多糖提取溫度/C802.1.2第二次索氏提取提取物質(zhì)量/g4.93(皂試)0.18(多糖)1.103.78根據(jù)第一次索氏提取的結(jié)果,第二次索氏提取9.05(寡糖)0.75(單寡糖)(多糖)(多糖)只采用了4個(gè)濃度梯度,即70%,50%,30%的乙醇產(chǎn)率/%9.86(8試)0.36(多糖)2.207.5618.10(寡糖)1.50(單寡糖)(多糖)(多糖)和蒸餾水.70%乙醇提取后,用大孔樹脂分離提取物中的皂甙和單寡糖;50%乙醇提取后,透析分離提取液中的單寡糖和多糖.分析結(jié)果見表2.33789789112023511522303mina單糖標(biāo)準(zhǔn)品;b.經(jīng)70%乙醇提取,大孔樹脂分離所得的人參單寡糖;c.50%乙醇提取的人參多糖;d30%乙醇提取的人參多糖e.蒸餾水提取的人參多糖.1.PMP;2.甘露糖;3.鼠李糖;4.葡萄糖醛酸;5.半乳糖醛酸;6.葡萄糖:7.半乳糖:8.木糖;9.阿拉伯糖圖1第二次索氏提取各產(chǎn)物單糖組成色譜圖單糖組成分析結(jié)果(見圖1)顯示:70%乙醇提取經(jīng)大孔組的單審施十西含有97%的葡萄糖;50%乙醇提取,經(jīng)透析分離所得的多糖由葡萄糖(83中國(guó)煤化工(3%)組成,含有痕量的甘露糖和鼠李糖;30%乙醇提取的多糖由葡萄糖CNMHG糖(23%和半乳糖醛酸(8%)組成;蒸餾水提取的多糖由半乳糖醛酸(43%)、葡萄糖(34%)和半乳糖(9%)組成,含有少量的阿拉伯糖、甘露糖和鼠李糖.第2期朱梅,等:乙醇濃度對(duì)人參多糖分離的彩響157由圖1可見,人參多糖的單糖組成與乙醇提取液的體積分?jǐn)?shù)有很大的關(guān)系隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的降低,葡萄糖的含量逐漸減小,半乳糖醛酸含量逐漸增大,尤其是蒸餾水提取的多糖中半乳糖醛酸含量超過了葡萄糖由此可知,70%乙醇提取經(jīng)大孔樹脂分離得到由葡萄糖組成的人參單寡糖和人參皂甙,50%乙醇提取經(jīng)透析分離得到人參中性多糖,30%乙醇提取得到含少量半乳糖醛酸的人參酸性多糖蒸餾水提取得到含大量半乳糖醛酸的人參酸性多糖3.2不同乙醇濃度沉淀分級(jí)人參多糖3.2.1分別醇沉將人參根粉碎后用蒸餾水提取,等量的提取液表3平行醇沉的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別用70%75%和80%的乙醇沉淀分級(jí),結(jié)果見醇沉體積分?jǐn)?shù)/%表3.由表3可見,沉淀的量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大上清/g41.9(GRs1)40.3GRs2)39(GRs3)而增大,而醇沉上清的量則是隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增沉淀/g22(GRP1)23.8(GRP2)25(RP3)大而減小.63.9GR-S-IGR-P.l901201501030609001501802103.0GRGR-P-30.0150180210GR-S-3GR-P-33.0000中國(guó)煤化工y/ mlCNMHG圖2 Sephadex G75分析平行醇沉產(chǎn)物色譜圖158東北師大學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)第41卷用分離范圍在相對(duì)分子質(zhì)量為1000~50000的 Sephadex G75凝膠柱層析分析醇沉分級(jí)產(chǎn)物,通過苯酚硫酸法檢測(cè)以洗脫體積為橫坐標(biāo),490nm處的吸光值為縱坐標(biāo)作圖,結(jié)果見圖2如圖2所示,醇沉上清均由相對(duì)分子質(zhì)量≤1000的單寡糖組成醇沉沉淀均由多糖和單寡糖組成且沉淀中單寡糖的比例隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增大結(jié)果表明,70%乙醇可以將水提物中的多糖完全沉淀下來,但在所選的濃度范圍內(nèi)一次醇沉不能將單寡糖和多糖徹底分開.3.2.2分步醇沉將人參干粉用蒸餾水提取提取液依次用40%,60%和70%的乙醇沉淀分級(jí),所得的沉淀和上清利用 Sephadex C-75進(jìn)行分析,通過苯酚硫酸法檢測(cè),以洗脫體積為橫坐標(biāo).,490nm處的吸光值為縱坐標(biāo)作圖,結(jié)果見圖3GR-P-cGR→P-a0.2圖3 Sephadex-75分析分步醇沉產(chǎn)物色譜圖如圖3所示,當(dāng)溶液醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí),沉淀中只含有多糖,且多糖的相對(duì)分子質(zhì)量≥50000;醇濃度增加至60%時(shí),在總體積與外水體積之間有明顯的寬峰呈現(xiàn),說明相對(duì)分子質(zhì)量<50000的多糖也被沉淀下來,其與相對(duì)分子質(zhì)量為50000以上的多糖含量比約為2:1,總體積處仍沒有洗脫峰出現(xiàn),說明無單寡糖被沉淀下來;當(dāng)溶液的醇濃度達(dá)到70%時(shí),沉淀中糖類物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量分布最為復(fù)雜,有大量的多糖和單寡糖同時(shí)存在,含量比約為1(相對(duì)分子質(zhì)量≥50000)(1000<相對(duì)分子質(zhì)量<50000:3(單寡糖),上清中只存在人參寡糖3結(jié)論本文采用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)人參多糖進(jìn)行了提取和沉淀分離.結(jié)果表明,乙醇體積分?jǐn)?shù)很大程度上影響著提取和沉淀分級(jí)產(chǎn)物的組成、相對(duì)分子質(zhì)量和產(chǎn)同的A參多堤供了可以參考的方法中國(guó)煤化工根據(jù)乙醇濃度對(duì)人參皂甙、人參單寡糖和不同單糖組CNMHG,依次用70%50%,30%的乙醇和蒸餾水提取,通過大孔樹脂和透析將人參皂甙、人參單寡糖和人參多糖分離同時(shí)將人參多糖分為中性多糖、含少量半乳糖醛酸的酸性多糖和含大量半乳糖醛酸的酸性多糖.第2期朱梅,等:乙醇濃度對(duì)人參多糖分離的影響159根據(jù)乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)人參寡糖和不同相對(duì)分子質(zhì)量的人參多糖溶解度的影響,用40%,60%,70%的乙醇分步醇沉可以分別得到單寡糖、相對(duì)分子質(zhì)量>1000的多糖和相對(duì)分子質(zhì)量≥50000的多糖[參考文獻(xiàn)][1]陳萍權(quán)宜淑.人參與西洋參研究進(jìn)展「].基層中藥雜志,2000,14(1):59[2]張彬林瑞超馮芳.人參多糖的研究概況「J].中國(guó)藥事,2004,18(9):566-569[3]劉國(guó)臣,李盛鈺,何大俊,等.甾體皂苷的選擇性酸水解研究[門]東北師大學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,200739(2):87-91[4]任莉莉魏影非,杜惠蘭,人參抗腫瘤作用研究進(jìn)展[門].中成藥2005,27(8):947-950.[5]傅平平,王維盅,高其品.人參根多糖化學(xué)性質(zhì)及抗腫瘤活性的研究[].白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)199420(5):439-441[6] 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The results show that the isolation and precipitation of ginseng polysaccharides were influencedby different ethanol concentrations. The produced polysaccharides were different among their molecular weight, composition by different ethanol concentration. In addition, the yields and isolation timewere different, too. Base on the results, a procedure for the isolation of ginseng polysaccharides was setup. Ginseng roots can be extracted sequentially by 70%, 50%, 30% and 0 of ethanol to give ginsenasides, oligosaccharide (including monosaccharide), neutral polysaccharides, acidic polysaccharides, respectively. In contrast, a series of polysaccharides with different molecular weight and oligosaccharides(including monosaccharides) were obtained by stepwise adding ethanol.Keywords: ginseng polysaccharide Soxhlet extractionsethaneYH中國(guó)煤化工saccharideCNMH編輯:方林)