第27卷第4期林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)Val 27 No 42007年8月Chemistry and Industry of Forest ProductsAug.2007速生楊二步超低酸水解液發(fā)酵制取燃料乙醇的研究莊新妹',王樹榮”,袁振宏’,駱仲泱2,吳創(chuàng)之,岑可法2(1.中國科學(xué)院廣州能源研究所;中國科學(xué)院可再生能源與天然氣水合物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東廣州510640;2.淅江大學(xué)能源清潔利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州310027)要;以速生楊二步超低酸水解方法獲得的水解液為原料,在28℃、100v/min等發(fā)酵條件下選擇熱帶假絲酵母(C2.637)和釀酒酵母(S2.699)分別對第一步和第二步水解液進(jìn)行了發(fā)酵制ZHUANG Xin-shu取燃料乙醇的研究,并考查了Ca(oH)2中和、過申和、活性炭吸附等預(yù)處理方法及菌種預(yù)適應(yīng)馴化對乙醇轉(zhuǎn)化率的彩響。結(jié)果教明:熱帶假絲酵母能夠更好地利用第一步水解液生成菌體,適合生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白;菌種馴化后發(fā)酵速度和乙醇特化率均有提高,尤其是以釀酒酵母發(fā)酵第二步水解液,乙醇轉(zhuǎn)化率由1445%增至39.37%;Ca(OH)2過中和的方法處理后的水解液,乙醇轉(zhuǎn)化率有所增加;以五碳糖為主同時(shí)含有六碳糖的逮生楊第一步水解液,假絲酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇的效果好于釀酒酵母關(guān)犍詞:速生楊;二步超低酸水解液;然料乙醇中圖分類號:TQ91;TK6文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:0253-2417(2007)04-0061-05Study on Production of Fuel Ethanol from Poplar Hydrolyzate obtained byTwo-step Super-low Acid HydrolysisZHUANG Xin-shu, WANG Shu-rong, YUAN Zhen-hongLUO Zhong-yang, WU Chuang-zhi,CEN Ke-fa(1. Guangzhou Institute of Energy Conversion, Chinese Academy of Science: Key Laboratory of Renewable Energy and Gas Hydrate, CASGuangzhou 510640, China; 2. State Key Laboratory of Clean Energy Utilization, Zhejiang University, Hangzhou 310027, ChinAbstract: Choosing hydrolyzate of poplar as fermentation material, which was obtained by two-step super-low acids hydrolysisfuel ethanol production was studied by using Candida tropicalis 2. 637 and Saccharomyces cerevisiae 2, 699 respectively. Simultaneously the influences to the ethanol yield by various pretreatment methods, such as Ca( OH) neutralization, over-neutralizationactive carbon adsorption and yeast-training were carried out. The experimental results show that C. tropicalis 2. 637 is suitable tothe first-step hydrolyzate rich in pentose to produce single cell protein. Yeast-training can improve fermentation speed andethanol yield, especially to the second step hydrolyzate through which ethanol yield was increased from 14. 45 %to39. 37% by S. cerevisiae 2. 699. The over-neutralization of hydrolyzate by Ca(OHh improved ethanol yield, too. Therefore, forthe hydrolysis of the first-step hydrolyzate, which containg mainly pentose and accompanied with hexose, more ethanol can beobtained by C. tropicalis 2. 637 than by S. cerevisiae 2. 699Key words: poplar; two-step super-low acids hydrolysis; fuel ethanol以生物質(zhì)為原料生產(chǎn)燃料乙醇有著廣闊的市場前景,對解決日益緊迫的液體燃料短缺問題具有極其重要的意義。燃料乙醇的開發(fā)應(yīng)用是當(dāng)前減少石油消耗、降低城市環(huán)境污染最直接、最有效的方法,尤其是《京都議定書》的生效燃料乙醇的應(yīng)用更被作為發(fā)達(dá)國家利用生物質(zhì)能減排CO2的一項(xiàng)有效中國煤化工收稿日期:2006-04-14基金項(xiàng)目:中科院廣州能源所所長基金人才引進(jìn)專項(xiàng)(0607651);國家自然HCNMHG作者簡介:莊新妹(1970-),女青林撫松人,副研究員博士,主要從事生物質(zhì)制取高品位燃料的研究;E-malL: zhuangs@ ms giecac en通訊作者:王樹榮,副教授博士,從事生物質(zhì)能源化利用等研究;Ema: erwang@cree,可,cdhu,cn林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)第27卷措施(。目前中國、巴西美國、歐洲一些國家和印度泰國津巴布韋南非等國都已開始實(shí)施乙醇汽油計(jì)劃。用汽油發(fā)動(dòng)機(jī)的汽車,乙醇加入量為5%~22%;專用乙醇發(fā)動(dòng)機(jī)汽車,乙醇加入量為85%-100%123。然而目前燃料乙醇大都來自糧食和糖類作物的發(fā)酵,從長遠(yuǎn)看來是沒有前途的。作者嘗試以速生楊二步超低酸水解液發(fā)酵制取燃料乙醇因速生楊是優(yōu)良的速生林樹種,為生物質(zhì)制取燃料乙醇的大規(guī)模利用打下基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料及儀器設(shè)備發(fā)酵樣品:高溫液態(tài)水解法得到的速生楊第一步水解液,以超低酸水解速生楊得到的第二步水解液,具體見文獻(xiàn)[4]。發(fā)酵菌種熱帶假絲酵母( Candida tropicalis2.637),用于發(fā)酵第一步水解液的五碳糖釀酒酵母(S. cerevisiae2.399)用于發(fā)酵第二步水解液的六碳糖,皆購置于中科院微生物所。綜合考慮前人的研究成果確定發(fā)酵溫度為28℃水解液p值為5-55搖床轉(zhuǎn)速為100rm1°儀器與設(shè)備:HZQ-Q振蕩器;HPG400光照培養(yǎng)箱哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司制造;電子顯微鏡,上海興行顯微鏡制造有限公司;手提式壓力蒸汽滅菌器,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;HITACH20PR-52D自動(dòng)高速冷凍離心機(jī);721分光光度計(jì),上海第三分析儀器廠;超凈工作臺,哈爾濱市東聯(lián)公司。1.2水解液預(yù)處理1.2.1預(yù)處理方法將第一步和第二步水解液分別以Ca(OH2中和至pH值5~6,然后用活性炭吸附脫毒處理(100mg/L,攪拌80min),用以脫色及減少乙酸糠醛、5-羥甲基-2-糠醛(HMF)等發(fā)酵抑制物的影響,過濾后以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行真空濃縮使還原糖質(zhì)量濃度達(dá)到50g/L左右。1.22過中和處理取部分速生楊第一步水解液,先以Ca(OHh調(diào)至pH值12.22,然后用1%H2PO反中和至pH值5~6,再活性炭吸附、真空濃縮。發(fā)酵液處理情況見表1?？梢娊?jīng)過中和、活性炭吸附預(yù)處理后還原糖有一定程度的損失。樣品濃縮時(shí)的泡沫主要來自于樣品中的果膠類產(chǎn)物,可以看出,以高溫?zé)崴ǖ玫降牡谝徊剿庖褐性摦a(chǎn)物含量較低,通過Ca(OH)2的過中和處理,也可以去除部分果膠衰1發(fā)酵液處理Table I Processing of fermenting liqu還原糖質(zhì)量濃度/(g·L2)樣品編號發(fā)酵菌種后p值附注t" g yeasts初始預(yù)處理后預(yù)處理后濃縮 pH value aflerAnnotationSpretreatment第一步水解液1c.2631353較易濃縮第一步水解液過中和處理易濃縮泡沫少neutralizing of8份11.1849.912.22 -5.5 easier to concentratefirst-step hydrolyzatsecond-step hydrolyzate m釀酒酵母24.8221.88第二步水解液難濃縮泡沫多hard to concentrate,more foam13培養(yǎng)基選擇馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)用于菌種的保存化培養(yǎng)H中國煤化工)進(jìn)行酵母的馴CNMHG1.4菌種的馴化將購自中科院微生物所冷凍真空保存的熱帶假絲酵母和釀酒酵母用無菌水制成菌懸液,無菌操作第4期莊新姝,等:速生楊二步超低酸水解液發(fā)酵制取燃料乙醇的研究涂布PDA培養(yǎng)基,28℃恒溫箱培養(yǎng)。3d后再用同樣的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接活化一次。將菌種接人YPD培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基中水解液的比例隨著馴化次數(shù)每次增加1/3,則到第三次馴化培養(yǎng)基就全部是水解液。其中每次馴化培養(yǎng)24h,離心分離菌體,接到下一步馴化液中,最后將第三次馴化的酵母接到以水解液和瓊脂制備的固體培養(yǎng)基上,2d后接入種子液,以便保證接種到種子液菌體的活性。1.5種子液制備種子液的制備分4步進(jìn)行:1)將3種水解液樣品以4℃,12000/min離心10min,棄沉淀,取上清液。112℃滅菌30min,保存在滅菌后的三角瓶中;2)分別取3種水解液樣品10mL,加入1%酵母粉,1%(NH4點(diǎn)2SO4,0.2%KH2PO4,0.1%MgO4·7H2O,作為種子液;3)無菌條件下以接種環(huán)將釀酒酵母接入種子液(Ⅱ)中,同樣方法將熱帶假絲酵母接入種子液(I)和(IZ);4)置于28℃、100r/min恒溫?fù)u床上培養(yǎng)種子液菌體濃度在0個(gè)/mL以上時(shí)接入發(fā)酵液。1.6發(fā)酵取30m滅過菌的水解液于250mL錐形瓶中,向其中加人1%(NH4hSO4。種子液按10%體積接入,其中釀酒酵母25×10個(gè)/mL熱帶假絲酵母3.375×103個(gè)/mL。28℃,100r/min恒溫?fù)u床上培養(yǎng),間隔12h取樣1mL,離心后測乙醇濃度。1.7分析方法及計(jì)算公式蔭體細(xì)胞濃度的測定采用血球板計(jì)數(shù)法。乙醇分析測試采用分光光度計(jì)法9。Y(EtoH) =c(EtoH)x100(n xp式中:Y(EOH)—乙醇轉(zhuǎn)化率%;c(EOH)一乙醇質(zhì)量濃度,gL;n計(jì)量系數(shù)釀酒酵母發(fā)酵葡萄糖n=0.51,假絲酵母發(fā)酵木糖,n=0.46;pm濃縮后還原糖質(zhì)量濃度,50g/L。2結(jié)果分析2.1兩種酵母菌的生長情況圖1為熱帶假絲酵母(C.2637)和釀酒酵母(S.2.399):6分別在經(jīng)過預(yù)處理的速生楊第一步水解液和第二步水解液中5的生長變化曲線,從圖中可知二者呈現(xiàn)出不同的生長趨勢,假畫4絲酵母菌數(shù)增加較快,30h已達(dá)5.5×103個(gè),30~36h長勢3緩慢,釀酒酵母24~36h基本沒有變化;二者36h后皆成快速2生長趨勢。說明假絲酵母能夠較好地利用第一步水解液中的時(shí)間h低聚木糖、木糖等生長菌體釀酒酵母對底物不是很適應(yīng),增--假絲酵母c2637;-△-釀酒酵母S.239長緩慢,總菌數(shù)不足假絲酵母的一半。故假絲酵母利用第圖1兩種酵母在水解液中的生長情況步水解液生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白用于動(dòng)物飼料,很有潛力。Fig. 1 Growths of two yeasts in hydrolyzate2.2菌種馴化對發(fā)酵制乙醇的影響將分別在第一步水解液和第二步水解液中馴化的熱帶假絲酵母和釀酒酵母分別用于發(fā)酵水解液圖2(a)為以第一步水解液為基質(zhì)馴化后的熱帶假絲酵母與未經(jīng)馴化菌種發(fā)酵情況的對比。由圖可知馴化后乙醇轉(zhuǎn)化率最高點(diǎn)出現(xiàn)在24h,為16.34%,較未馴化發(fā)酵速度加快轉(zhuǎn)化率略有提高。圖2(b)為在速生楊第二步水解液中,馴化后的釀酒酵母與未馴化菌種的發(fā)酵情況對比,可見馴化后釀酒酵母發(fā)酵能力有很大提高最高乙醇轉(zhuǎn)化率由14.45%升高到39.37%,24~48h都有較高得率。這說明經(jīng)過馴化,這兩種酵母對水解液的適應(yīng)性增強(qiáng),尤其是釀酒酵母能夠較好地利用基質(zhì)。因時(shí)間所限,沒有進(jìn)行最佳發(fā)酵條件的摸索故本研究得到的乙醇得率并非最隹中國煤化工2.3樣品過中和處理的發(fā)酵情況以熱帶假絲酵母對速生楊第一步水解液進(jìn)行發(fā)酵研究,夏,CNMHG內(nèi)妞下后反中和再進(jìn)行炭吸附處理的樣品,發(fā)酵情況好于直接以Ca(OH)2中和至pH值5~6然后炭吸附。由圖3可見,兩種處理方式發(fā)酵規(guī)律基本一致,乙醇轉(zhuǎn)化率最高點(diǎn)皆出現(xiàn)在36h,但過中和處理后的樣品乙醇轉(zhuǎn)化率提高64林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)第27卷約4個(gè)百分點(diǎn)。時(shí)間幾時(shí)間hO一菌種馴化 acclimatised yeasl;-△-菌種未馴化or圖2速生楊第一步水解液(a及第二步水解液(b)菌種馴化發(fā)酵情況對比Fig2 Comparison of fermentation properties of the first hydrolyzate(a)and the second hydrolysate( b)withthe original yeast and acclimatized yeast2.4菌種對速生楊第一步水解液發(fā)酵制取乙醇的影響從水解液的高效液相色譜(HPLC)分析可知第一步水解液主要成分為木糖等五碳糖,同時(shí)又含有葡萄糖,所以分別用兩種菌種對其進(jìn)行發(fā)酵研究(見圖4)。發(fā)現(xiàn)釀酒酵母乙醇轉(zhuǎn)化率低于假絲酵母?？赡艿脑蚴堑谝徊剿猱a(chǎn)物中葡萄糖含量過低,再則熱帶假絲酵母發(fā)酵速度快于釀酒酵母,24h即出現(xiàn)乙醇轉(zhuǎn)化率最高點(diǎn),釀酒酵母乙醇轉(zhuǎn)化率最高點(diǎn)出現(xiàn)在60h左右,這也說明了假絲酵母在相同基質(zhì)中生長速度快于釀酒酵母。10020406080100020406080100時(shí)間時(shí)間h一過中和 over-neutralizing;-△-原液 original liquid一假絲酵母C2637;-△一釀酒酵母S2399圖3第一步水解液過中和處理與水解原液發(fā)酵對比圖4馴化后的兩種酵母用于第一步水解液發(fā)酵對比Fig 3 Fermentation of over- neutralizing and originalFig. 4 Fermentation of the first hydrolyzate with twosample of the first-step hydrolyzatekinds of acclimatized yeast3結(jié)論3.1以Ca(OH)中和、過中和然后活性炭吸附等預(yù)處理方法選擇熱帶假絲酵母(C2637)和釀酒酵母(S2.699),并對菌種進(jìn)行了預(yù)適應(yīng)馴化,在28℃、100m/min等的發(fā)酵條件下,對速生楊二步超低酸水解液分別進(jìn)行了發(fā)酵制取乙醉的研究。從兩種酵母菌生V中國煤化工多更好地利用第步水解液生成菌體適合生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白。CNMHG32沒有馴化的菌種表現(xiàn)出對水解液的不適應(yīng),乙醇轉(zhuǎn)化既,醇迷度度;們擁化后對速生楊水解液發(fā)酵效果優(yōu)于不馴化,尤其是以釀酒酵母發(fā)酵第二步水解液,乙醇轉(zhuǎn)化率由14.45%提高到第4期莊新姝等速生楊二步超低酸水解液發(fā)酵制取燃料乙醇的研究39.37%,且發(fā)酵速度提高。33以Ca(OH)2過中和的方法處理后的水解液濃編時(shí)易起泡的果膠等物質(zhì)減少,且乙醇轉(zhuǎn)化率有所增加。3.4做為五碳糖和六碳糖混合物的速生楊第一步水解液,熱帶假絲酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇的效果好于釀酒酵母。參考文獻(xiàn):[1JIEA Biotechnology for the conversion of lignocelluloses to ethanol[r]. IEA Bioenergy Newsletter, 2000.[2 ]BADGER P C. EthanoL from cellulose: A general review [m]// JANICK J, WHIPKEY A. Trends in new crops and new uses. vA: AlexandriaASHS Pres, 2002.[3]劉軍利蔣劍春論生物質(zhì)能源標(biāo)準(zhǔn)體系(Ⅱ)—生物質(zhì)燃料乙醇標(biāo)準(zhǔn)化研究進(jìn)展[門]生物質(zhì)化學(xué)工程,006,40(5):53-57[4]王樹榮,莊新妹駱仲泱,等木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)超低酸水解試驗(yàn)及產(chǎn)物分析研究[J]工程熱物理學(xué)報(bào),200,27(5):741-74.[S]LUO Cai-dian, BRINK D L, BLANCH H W. Identification of potential fermentation inhibitors in conversion of hybrid poplar hydrolyzate toethanol [ j]. Biomass and Bioenergy, 2002, 22: 125-1386]劉小杰.廉氏木霉纖維素酶的發(fā)酵及其對稻草降解利用的初探[D]杭州:浙江大學(xué)博士學(xué)位論文,2003:6.7]奧斯伯F金斯頓RE賽德曼JG精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南[M].北京:科學(xué)出版社,199[8]樓純菊簡易的乙醇定量測定法[J]微生物學(xué)通報(bào),1984(5):21925[9]馬純艷,王升厚.菌糠單細(xì)胞蛋白飼料生產(chǎn)技術(shù)的研究[門]食用菌,2005(3)56-58[10]梁希林產(chǎn)制造化學(xué)[M],北京:中國林業(yè)出版社,1983.[1莊新姝生物質(zhì)超低酸水解制取燃料乙醇的研究[D]杭州:浙江大學(xué)博士學(xué)位論文,2005:12《生物質(zhì)化學(xué)工程》2006年增刊出版《生物質(zhì)化學(xué)工程》2006年增刊是配合“中國林業(yè)生物質(zhì)能源發(fā)展研討會(huì)”出版的論文集,共刊出主題報(bào)告、考察報(bào)告、特邀報(bào)告和研究報(bào)告共74篇,384頁,定價(jià)100元(含郵資)。需要者請直接匯款至《生物質(zhì)化學(xué)工程》編輯部訂購。地址:210042南京市鎖金五村16號林化所內(nèi);聯(lián)系電話:(02585482492;htp:/lchg. chinajournal.net.cn;E- mail: Ichg@ chinajoural.net.cn;銀行信匯:中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所4301012509001028549工商銀行南京板倉分理處增刊目錄如下:文章題目發(fā)揮資源優(yōu)勢、強(qiáng)化科技創(chuàng)新、大力促進(jìn)林業(yè)生物質(zhì)能我國亞熱帶能源林研究展望源加快發(fā)展建立灌木能源林概念并構(gòu)筑林業(yè)可再生能源新產(chǎn)業(yè)鏈德國瑞典林業(yè)生物質(zhì)能源利用技術(shù)考察報(bào)告木本生物質(zhì)能源的發(fā)展現(xiàn)狀和對策生態(tài)能源林—未來生物質(zhì)燃料油原料基地典型戶用農(nóng)村生物質(zhì)能源工程能量流動(dòng)研究生物質(zhì)能源與能源林業(yè)若干問題研究生物質(zhì)能源發(fā)展問題與對策植物纖維制備燃料乙醇的關(guān)鍵技術(shù)木質(zhì)生物質(zhì)的能源化及功能性環(huán)境材料制備生物質(zhì)能源開發(fā)與應(yīng)用現(xiàn)狀和前景桉樹生物質(zhì)能源的優(yōu)勢、現(xiàn)狀和潛力生物質(zhì)基高分子新材料——能源替代的重要方向?qū)υ颇夏颈旧锬茉促Y源培育的初淺設(shè)想林業(yè)生物質(zhì)熱化學(xué)轉(zhuǎn)化利用研究現(xiàn)狀木質(zhì)能源麻瘋樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展對策研究林間剩余物熱電聯(lián)產(chǎn)綜合開發(fā)關(guān)鍵裝備與技術(shù)研究黃連木優(yōu)樹選擇與良種繁育技術(shù)的研究能源柳研究現(xiàn)狀與國內(nèi)引種栽培黃鼠樹引種及栽培試驗(yàn)發(fā)展中國林木生物質(zhì)成型燃料香膠樹組織培養(yǎng)繁殖技術(shù)四種木本植物油制取生物柴油的研究橡樹資源—優(yōu)質(zhì)林木生物質(zhì)能源發(fā)展戰(zhàn)略研究中國薪炭林培育技術(shù)云南小框甘生物些油陌魁林廄策略我國生物柴油產(chǎn)業(yè)化制備技術(shù)及其發(fā)展趨勢西北沙E中國煤化工木質(zhì)纖維生物轉(zhuǎn)化乙醇技術(shù)油楠作CNMHG生物質(zhì)熱裂解和化學(xué)液化制燃料油技術(shù)現(xiàn)狀及展望‖蒸汽爆破處理胡枝子的同步糖化發(fā)解制備乙醇研究下轉(zhuǎn)102頁)