2013年第21卷合成化學(xué)vol.21,2013第1期,099~102 Chinese Journal of Synthetic ChemistryNo.1,099~102·制藥技術(shù)比伐盧定的聚乙二醇化修飾何燕,鄧言波,王良友21.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)學(xué)院,江蘇蘇州215123;2.蘇州中科天馬肽工程中心有限公司,江蘇蘇州215101)摘要:將比伐盧定(BVLD)多肽鏈7甘氨酸(ly)用半胱氨酸(Cys)取代,以聚乙二醇(PEG)定點(diǎn)修飾巰基,采用多肽固相合成法制得[Cys-bld(2)2與mEG-MAL(3a-3c)偶聯(lián)合成了三個(gè)聚乙二醇化修飾的比伐盧定衍生物—【 Cys mPE200】-((mpeg50m-db和[cy(me10000-M)-Bvld(1c),其結(jié)構(gòu)經(jīng)MS確證。p和T評(píng)價(jià)結(jié)果表明,1a1c均表現(xiàn)出良好的抗凝活性,尤其是1b的抗凝活性優(yōu)于比伐盧定。關(guān)鍵詞:比伐盧定;聚乙二醇化修飾;多肽合成;抗凝活性中圖分類號(hào):0629.72;R914.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1005-1511(2013)01009904 PEGylation of Bivalirudin HE Yan', DENG Yan-bo', WANG Liang-you? (1. Institute of Radiological Medicine and Protection, Soochow University, Suzhou 215123, China; 2. Suzhou ChinaTech Peptide Co. Ltd., Suzhou 215101, China) Abstract: Three PEGylation bivalirudin (BVLD) derivatives, Cys( mPEG2000-MAL)]'-BVLD (1a), Cys( mPEG5000-MAL) ]'-BVLD(1b) and Cys(mPEG10000-MAL) ]'-BVLD(),were synthesized by addition reaction of mPEG-MAL (3a ~3c)and Cys]'-BVLD()which was prepared by replacing the 7-glycine(Gly) of BVLD by cysteine( Cys)with the solid phase peptide synthesis. The structures were confirmed by MS. The results of PT and TT evaluation showed that la~ exhib- ited good anticoagulation activities, especially 1b was better than bivalirudin. Keywords: bivalirudin; PEGylation; peptide synthesis; anticoagulation activity比伐盧定(BLD)是由20個(gè)氨基酸(D-he-250g,價(jià)格昂貴。其在腎功能正常的患者體內(nèi)proa- Pro-Cly-Asp-Phe--gly-gly-gly-a-gly--lu-的清除半衰期為25min,雖然比伐盧定于2000年lu-e-pro-glu-glu-tyr-eu)組成的水蛭素的衍被批準(zhǔn)用于經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)血管成形術(shù)的抗凝生物,是凝血酶的直接可逆的二價(jià)抑制劑U,可治療,在2005年被批準(zhǔn)用于接受經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介以與凝血酶的催化位點(diǎn)和陰離子結(jié)合位點(diǎn)(底物入治療的抗凝治療,但是昂貴的價(jià)格限制了其識(shí)別位點(diǎn))結(jié)合2BVLD于2000年12月15日在臨床上的應(yīng)用。因此,開發(fā)長(zhǎng)效、安全經(jīng)濟(jì)的被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市。類似藥物十分必要。蛋白質(zhì)經(jīng)聚乙二醇化修飾Bvld是一種合成的多肽藥物,單次劑量為( PEGylation)后能顯著改善其特性,如增加蛋白收稿日期:2012-0705;修訂日期:2012-11-01基金項(xiàng)目:江蘇省大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃”資助項(xiàng)目(5731504610)作者簡(jiǎn)介:何燕(1990-),女,漢族,新疆昌吉呼圖壁人在讀本科生,主要從事多肽的合成與修飾研究。通信聯(lián)系人:王良友,副研究員,e-mail: liangywang gmail.com100合成化學(xué)Vol.21,2013質(zhì)對(duì)酶的穩(wěn)定性、延長(zhǎng)蛋白質(zhì)在血漿中的半衰期、CH2l2(5mL)溶液,Et6mmol和對(duì)甲苯磺酰降低抗原性和免疫原性等4,已有多個(gè)PEG修飾氯6mmol,攪拌下于室溫反應(yīng)20h(TLC監(jiān)測(cè))的蛋白藥物上市。于40℃減壓旋蒸除去溶劑,加預(yù)冷無(wú)水乙醚沉本文將BVLD多肽鏈7-甘氨酸(Gly)用半胱降,過濾濾餅用二氯甲烷溶解,依次用0.1%檸氨酸(Cys)取代,以PEG定點(diǎn)修飾巰基,采用多肽檬酸鈉溶液(3×10mL),飽和NaCl溶液(3×足固相合成法制得[Cys]-bvld(2);2與mG量)洗滌,無(wú)水Na2SO4干燥12h,于40℃減壓旋MAl(3a3c)偶聯(lián)合成了三個(gè)PEG修飾的BV-蒸除去溶劑,乙醚沉降,抽濾濾餅干燥得白色粉LD衍生物[Cys(mE2000-)]-Bld末mpeg-otsia-ic)(a),[Cys(m5000-mal)-bvld(1b)和在反應(yīng)瓶中依次加入Ia~Ic1mmol的mCys(m1000m)-Bvd(1c),其結(jié)構(gòu)經(jīng)(10m)溶液,鄰苯二甲酰亞胺鹽(pI)6mmol,MS確證。PT和TT評(píng)價(jià)結(jié)果表明,1a~1c均表N2保護(hù)下于120℃反應(yīng)4h于90℃減壓旋蒸現(xiàn)出良好的抗凝活性,尤其是1b的抗凝活性優(yōu)于除去溶劑依次加入無(wú)水乙醇與水合肼,回流反 BVLD.應(yīng)2h。于60℃減壓旋蒸除去溶劑,殘余物用二氯甲烷溶解,過濾,濾液依次用水(3×10mL),飽1實(shí)驗(yàn)部分和NaCl溶液(3×足量)洗滌,無(wú)水Na2SO4干燥1.1儀器與試劑12h,于40℃減壓旋蒸除去溶劑,乙醚沉降,抽創(chuàng)新通恒半制備高效液相色譜儀[ Phenome-濾濾餅干燥得白色粉末mpeg-nh2(a-c)nexc8柱,250mm×30mm(100A,10),流動(dòng)在反應(yīng)瓶中加入Ⅱa~Ⅱc1mmol的二氧六相A:0.05%TfA水溶液,B:0.05%TfA(三氟乙環(huán)(40mL)溶液攪拌下于80℃加馬來酸酐4酸)70%CHC/H2O,流速20mL·min-1,檢測(cè)mmol,反應(yīng)30min于55℃減壓旋蒸除去溶劑,波長(zhǎng)215mm];戴安U3000型高效液相色譜儀乙醚沉降抽濾濾餅用醋酸酐溶解加入無(wú)水醋[HPlc, Prosphere C188柱,250mm×4.6mm(100酸鈉,攪拌下于100℃反應(yīng)45min(反應(yīng)液由淡黃A,5μ),流動(dòng)相同前,流速1m·min-];Bruk-色逐漸變?yōu)楹稚后w)。加水(10倍體積),分液, er MTQ型質(zhì)譜儀。水層用CH2Cl2(3×10mL)萃取,合成并有機(jī)層,固相合成載體CTC樹脂(原始替代度為1.3用飽和NaCl溶液(3×足量)洗滌,無(wú)水Na2SO4mmolg),dcc(n,n二環(huán)基碳二亞胺)干燥12h,于40℃減壓旋蒸除去溶劑,乙醚沉降,HBt(1-羥基苯并三氮唑)以及10種Fmoc-保護(hù)抽濾,濾餅干燥得淡黃固體3a~3c氨基酸,上海吉爾生化公司;FA, Acros;EDT(乙Ia~3c的產(chǎn)量及產(chǎn)率見表1二硫醇)和TMBS(三甲基溴硅烷), Fluka;聚乙二(2)[ys]-bvld(2)的制備醇的平均分子量為m2000-0H,mpe5000CTC樹脂15.00g,HBt和HBTu為縮合劑,H和mE10000-H, Sigma;其余所用試劑為按照反應(yīng)的投料比,稱取相應(yīng)量的Fmoc-leu-oh,分析純。 Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc- Pro-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp1.2合成 (OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH,(1)mpeg-mal(3a-3c)的合成通法在反應(yīng)瓶中依次加入mp-OH1mmol的(pb)-oh,根據(jù)[Cys-blD的氨基酸順序,按表1a~3c的產(chǎn)量及產(chǎn)率 Table 1 Output and yield of Ia~3c mPEG2000() mPEG5000(5g)mpe10000(10g) Comp Ia IIa 3abⅡb3b IcⅡc產(chǎn)量g3.624.401.421.533.150.611.001.800.36產(chǎn)率/%72.488.028.442.379.543.065.451.458.4第1期何燕等:比伐盧定的聚乙二醇化修飾101moc-a.obt. HATUHATU.12min2%Kn的吡溶液(1 mmol,樹脂透明為陰檢dmf min DIPEA,DMF, CTC洗滌3×1min 2-crc min2kcn啶溶液(1mml樹脂有顏色為陰性6xdm2x1 10 min DBLK6%三酮的乙醇溶液,80%苯酚的乙醇溶液洗脫保護(hù)圖1Fmoc固相多肽合成2CTC的流程圖 Figure 1 The flow chart of the Fmoc solid phase peptide synthesis of 2-CTCv六氫吡啶):V(DMF)=1:3標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc固相多肽合成方法(圖1)合成D-1.95(2),lu4.06(4),Pro2.92(3),arg0.96 Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Cys'()-Gly-Asn(1),ly4.21(4),Ty1.06(1),Phe1.92(2) (Trt)-Gly-Asp OtBu )-Phe-Glu OtBu)-Glu( Ot- 1.01(1), Leu 0.97(1). Bu)-lle-Pro-Glu( OtBu )-Glu (OtBu)-Tyr (tBu)-leu-ctc-ct).按照8mL·g樹脂用量配1.31的抗凝活性評(píng)價(jià)制并加入裂解液,以混合溶劑[V(TFA):V(苯甲(1)1的凝血酶原時(shí)間(PT)測(cè)定硫醚):V(EDT):V(苯甲醚)=90:5:3:2]為裂將PT試劑和受檢血漿置37℃水浴中預(yù)溫5解液,于0℃反應(yīng)90min。過濾,濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除min取試1支,加人受檢血漿0.1mL,一定量去TFA,加冷凍無(wú)水乙醚(6倍體積)沉淀出白色的比伐盧定或1(用pH7.4的Tris-HC緩沖液配固體,3000rpm離心5min,濾集固體用水溶解,制成所需終濃度),置37℃水浴中預(yù)溫30s,再加冰凍干燥至恒重得白色干粉2粗品62mg人預(yù)溫的PT試劑0.2mL,混勻,立即啟動(dòng)秒表計(jì)2粗品經(jīng)HPLC純化得2,純度大于95%時(shí)。不斷地傾斜試管至液體流動(dòng)緩慢趨于停止(H),其結(jié)構(gòu)經(jīng)MS和氨基酸組成分析確證。時(shí),記錄所需時(shí)間。重復(fù)三次,取平均值,空白對(duì)由MS分析可知,在1112.2處有主峰,與理論分照為Tris-HCl緩沖液,測(cè)試結(jié)果見表2子量2223.99分子帶兩個(gè)電荷一致。2經(jīng)酸性水表21的T評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)解(6mol·L鹽酸水溶液,于110℃反應(yīng)22h, Table 2 PT evaluation data of 1下同)的氨基酸組成實(shí)測(cè)值與理論值(括號(hào)內(nèi))相等質(zhì)量濃度等摩爾濃度符:Asp1.99(2),Glu4.11(4),Pro3.09(3),Comp終濃度凝固時(shí)間/s終濃度凝固時(shí)間/sArg0.96(1),ly4.21(4),Tyr1.07(1),Phe1.92(2),e0.99(1),eu0.98(1)?？瞻讓?duì)照11.92(0.40)-11.92(0.40)(3)1a~1c的合成通法比伐盧定2.041.9(1.49)2.041.9(1.49)在反應(yīng)瓶中加入2的水(10mL)溶液,用5%22.026.5(0.85)2.026.5(0.85)碳酸氫鈉溶液調(diào)至pH7~8,加入3a~3c,于室溫1a2.015.0(0.15)4.040.3(2.08)反應(yīng)至終點(diǎn)(HPLC監(jiān)測(cè))。HPLC分離提純得12.016.2(0.64)7.051.4(0.711a~1c,純度大于95%, MALDI--tof-ms分析結(jié)12.015.8(0.90)12.044.0(0.80)果表明,在4232附近有一系列峰,相鄰兩峰分子量相差約44,具有聚乙二醇的典型結(jié)構(gòu)特征。經(jīng)終濃度/·m,凝固時(shí)間欄括號(hào)內(nèi)為標(biāo)準(zhǔn)差酸性水解的氨基酸組成實(shí)測(cè)值與理論值(括號(hào)由表2見,1a~1c不僅在等質(zhì)量濃度測(cè)定條件內(nèi))相符。1a:Asp1.99(2),Glu4.11(4),Pro下仍保留了一定的抗凝活性;而且在等摩爾濃度3.09(3),Ar0.96(1),Gly4.21(4),Tyr1.07下也保持了良好的抗凝活性,其中1b的抗凝活性(1),Phe1.92(2),0.99(1),e0.98(1)。優(yōu)于比伐盧定。b:Asp2.00(2),glu4.31(4),Pro3.18(3),(2)1的凝血酶時(shí)間(TT)測(cè)定Arg1.03(1),gly4.13(4),tyr1.02(1),Phe取受檢血漿0.1mL于試管中,加入一定量的1.82(2),e1.06(1),Leu1.03(1)1c:Ap比伐盧定或1(用p7.4的ris-Cl緩沖液配制102一合成化學(xué)Vol.21,2013成所需終濃度),置37℃水浴中,預(yù)溫5min,再加果見表4。由表4可見,1a~1c仍保持了良好的0.1mL標(biāo)準(zhǔn)化“凝血酶”試劑,同時(shí)啟動(dòng)秒表抗凝活性,其中,1b的抗凝活性最佳。記錄血漿凝固時(shí)間。重復(fù)三次,取平均值,測(cè)試結(jié)果見表3。從表3可以看出,1a~1c均具有較好2結(jié)果與討論的抗凝活性(正常對(duì)照平均值18.0s)。比伐盧定的構(gòu)效關(guān)系研究表明,其氨基端帶表31的T評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)正電荷區(qū)域d-phe-pro-arg-Pro)和羧基端帶負(fù)電 Table 3 evaluation data of 1荷區(qū)域(Asn-ly-asp-he-glu-lule-pro-glu-glu-Comp終濃度/gml凝固時(shí)間/s標(biāo)準(zhǔn)差/sy-e)是其與凝血酶結(jié)合的兩個(gè)關(guān)鍵區(qū)域而比伐盧定0.0529.01.427位或8-位的甘氨酸進(jìn)行聚乙二醇修飾是理想的20.2029.10.81位點(diǎn)。初步活性評(píng)價(jià)表明,本研究合成的三種不 1a0.0532.81.11同平均分子量的1a~1c能保持較好的體內(nèi)抗凝 1b0.0532.51.33活性,在相同摩爾濃度下,1b的抗凝活性優(yōu)于比 le0.1026.60.70伐盧定,有望進(jìn)一步開發(fā)成具有比比伐盧定更長(zhǎng)半衰期的抗凝藥物。表41的APTT評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)(等質(zhì)量濃度) Table4 APTT evaluation data of 1參考文獻(xiàn)Comp凝固時(shí)間/s標(biāo)準(zhǔn)差/s1]eedbd. 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European Heart Joumal, 2010,(3)1的活化部分凝血酶時(shí)間(PT)測(cè)定31:561-572.取APT反應(yīng)液0.1mL和受檢血漿0.1mL[]王良友劉克良多肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾方法[]有機(jī)化學(xué),2003,23(11):1320-1323于塑料離心管中,并加入5μL的比伐定或15] Ryan Mantovani Wang et al Advances in(用pH7.4的Tris-HCl緩沖液配制成終濃度0.04 PEGylation of important biotech molecules: Deliverygml-的溶液),置37℃水浴中預(yù)溫3 min aspects]. pert Opinion Drug Delivery00再加入預(yù)溫的APTT催化劑0.1mL,混勻,立即啟(4):3712383.動(dòng)秒表計(jì)時(shí)。不斷地傾斜試管至有絮狀沉淀生成時(shí),記錄所需時(shí)間。重復(fù)三次,取平均值,測(cè)試結(jié)(上接第76頁(yè)) [10] Raposo MM M, Garcfa-Acosta B, Abalos T, et al. (II) ion selective electrodes with PVC membranes Synthesis and study of the use of heterocyclic thiosem- based on two bis thioureas as ionophores: 1, 3-Bis icarbazones as signaling acaffolding for the recognition (N-benzoylthioureido benzene and 1, 3-bis N-fu- of anions[ J]. J Org Chem, 2010,75 2922-2933. roylthioureido) benzene]. Joumnal of Hazardous [11] Wilson D, Aradab M A, Alegreta S, et al. Lead Materials,2010,181:140-146.