科技資訊200 NO.30SCIENCE & TECHNOU oev INFORMATION動力與電氣工程人|型精氨酸酶的聚乙二醇修飾條件探索郝德旺’梅丹2 劉慶洪(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院北京 100193 2. 麗水職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境工程分院園藝生物系浙江金華321 000 :3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院微生物系北京100193)摘要;精氨酸酶,叉名L-精氮酸尿素水解酶,是一種將精氮酸水解成鳥氦酸和尿素的水解酶,本身為內(nèi)源性蛋白酶在人體內(nèi)尿素楠環(huán)中起到重要作用。工業(yè)上可利用其水解活性以精氨酸生產(chǎn)烏氨酸。另外,精氨酸酶還有著顯著的抑制腫瘤細(xì)胞分裂的作用0一到。但是,在臨床應(yīng)用中，存在以下缺點(diǎn):體內(nèi)循環(huán)半表期短,易被循環(huán)系統(tǒng)清除,需要多次給藥等問題，給患者的日常生活帶來很大的不便。而聚乙二醇(Polyethylene Glyeol ，PEG)化學(xué)修飾能夠降低蛋白免疫原性以及有效延長藥物半表期,是解決上述問題的有效途徑之一團(tuán)。關(guān)鍵詞:人I型精氨酸酶聚乙二醇中圖分類號:06文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1672-3791(2009)10(e)-0090-02自上個(gè)世紀(jì)80年代以來,FDA批準(zhǔn)了第來尋找最佳的修飾辦法,為進(jìn)一步考察其種因素 ,固定反應(yīng)溫度為4C ,探討了pH值一個(gè)PEG化藥物聚乙二醇修飾的酰苷脫氨酶特性奠定基礎(chǔ)。對單修飾產(chǎn)物體外活性保留的影響,以及(PEG-. ADA), PEG修飾技術(shù)在長效藥物的制離子類型.離子強(qiáng)度.蛋白質(zhì)濃度.修飾劑/備研究中已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展,成為近年1 材料和方法蛋白質(zhì)配比、反應(yīng)時(shí)間等條件對修飾轉(zhuǎn)化來醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之- - 。目前,已經(jīng)上市(1)材料。原料:單甲氧基聚乙二醇丙醛事的影 響。的聚乙二醇藥物包括PEG化天冬酰胺酶(北京凱正生物),重組人精氨酸酶(Escheri-(1)在修飾劑類型、分子量固定的情況(PEG -L- asparaginase)4,以及重組人粒細(xì)胞集chia coli 表達(dá))。 主要試劑:牛血清白蛋白、下， 修飾反應(yīng)條件對單修飾產(chǎn)物體外活性落刺激因子(egfilgrastim)等蛋白質(zhì)藥物”。(SIGMA),丙烯酰胺(SIGMA),甲叉丙烯酰胺保 留的影響主要取決于修飾位點(diǎn)。只有修對于精氨酸酶的聚乙二醇修飾研究，(SIGMA),其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。飾位點(diǎn)遠(yuǎn)離蛋白質(zhì)活性部位的時(shí)候,修飾已經(jīng)取得了很大成果和進(jìn)展。目前已有產(chǎn)(2)方法。修飾反應(yīng):在低溫4C ,將重組人精蛋白才 能得到較高的活性保留。不同氨基品完成了臨床前實(shí)驗(yàn),為5kD線形單甲氧基氨酸酶透析到所需緩沖溶液中。使用BCA法酸殘基 ,其pKa值不同，因而在不同的pH值聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯(NHS-mPEG)進(jìn)行蛋白濃度測定,調(diào)整蛋白濃度至實(shí)驗(yàn)所條件下,其親核性有較大差別。因而溶液的修飾6,其體外活性保留為未修飾蛋白的需值,按照摩爾配比(修飾劑/蛋自質(zhì))加入pH值影響了蛋白質(zhì)的修飾位點(diǎn),是影響修50%，活性下降很多。修飾劑及還原劑,混合均勻,4C反應(yīng),結(jié)束飾產(chǎn)物活性的最主要要因素.圖1顯示了pH為了解決以上問題，本研究采用10kD后,使用甘氨酸終止。蛋白質(zhì)濃度的測定:使對單修飾產(chǎn)物活性保留的影響。可以看出，單甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG- ALD)修飾用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測定"。單修飾產(chǎn)物體外活性隨著pH值的增大先增劑對精氨酸酶進(jìn)行了修飾,通過控制反應(yīng)大后減小，在pHS. 5時(shí)單修飾產(chǎn)物活性最高。條件,希望能夠獲得半衰期更長的PEG化2結(jié)果與討論推測可能由于在pH=5.5的條件下,mPEG-精氨酸酶產(chǎn)物。通過考察不同的修飾條件為考察對單修飾產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率影響的各ALD主要修飾在蛋白N端氨基酸上,從而保120%60%100%50%望80%丹40%車30%40%哥20%20%10%0% l0%4.555.566.51152pH蛋白濃度(mg/mI)圖1pH對單修飾產(chǎn)物活性的影響圖2蛋白濃度對單修飾辜 的影響30%0%‘020中國煤化工3反應(yīng)時(shí)間( h)YHCNMHG蛋白配比圖3反應(yīng)時(shí)間對單修飾率的影響圖4修飾配比對單修飾辜的影響(下轉(zhuǎn)92頁)9科技資訊SCIENCE & TECHNOLOGY INFORMATION科技資訊2009 NO.30SCIENCE & TECHNOLOGY INFOPRMATION動力與電氣工程口落差達(dá)到8m,水流條件好。隧洞進(jìn)口高程大壩右岸,全長252.56m,隧洞進(jìn)口直線段中期導(dǎo)流:第二年汛期(5月~ 10月),根為1153. 00m,出口高程為1145.00m,底坡為長42. .90m,洞線方向?yàn)镹2.59" E,轉(zhuǎn)彎段長據(jù)施工,總進(jìn)度安排,大壩澆筑到1167.50m3%。.上述兩個(gè)方案技術(shù)經(jīng)濟(jì)比較如下。78.39m,轉(zhuǎn)彎半徑為100m,轉(zhuǎn)角44.92* ,出高程 ,并在1157.00m高程大壩溢流堰右側(cè)4.1.1經(jīng)濟(jì)指標(biāo).口直線段長131.27m,洞線方向?yàn)镹47.68預(yù)留寬50m的缺口,導(dǎo)流洞、沖砂底孔和大方案-造價(jià)約為884萬元，方案二造價(jià)E。隧洞進(jìn)口底板高程為1153.00m,出口底壩缺口 聯(lián)合泄流,攔河壩進(jìn)行預(yù)留缺口兩約為869萬元,從單一的導(dǎo)流工程來看兩個(gè)板高程為1145.00m,底坡為3.2%。側(cè)的混凝土澆筑。方案經(jīng)濟(jì)指標(biāo)上兩個(gè)方案差不多,但是方4.2.2隧洞斷面型式選擇后期導(dǎo)流:第二年11月~第三年4月，案二是結(jié)合永久泄洪洞來設(shè)計(jì),對整個(gè)工考慮到導(dǎo)流洞設(shè)計(jì)與泄洪洞相結(jié)合，通過 導(dǎo)流洞過流，攔河壩進(jìn)行缺口部分混程來說方案二在導(dǎo)流工程方面幾乎是零投導(dǎo)流洞斷面采用圓型斷面設(shè)計(jì),經(jīng)過水力凝土澆筑、 壩體灌漿和金屬結(jié)構(gòu)部分施工，資(投資計(jì)入永久泄洪洞)。因此,經(jīng)濟(jì)指標(biāo)計(jì)算,確定隧洞斷面尺寸襯砌后內(nèi)徑為8m直 至攔河壩竣工。上方案二優(yōu)于方案- - 。.四洞。4.1.2技術(shù)可行性4.3圍堰設(shè)計(jì)5截流本工程上游河床寬度較狹窄,覆蓋層由于本工程粘土料場儲量豐富,對土5.1截流時(shí)段選擇較厚,主要為大塊石崩踏堆積體。其中,左石圍堰施工用料有保證,故本工程園堰設(shè)導(dǎo)流時(shí)段為11月~次年4月,根據(jù)施工岸有不穩(wěn)定崩踏堆積體,堆積體順河向長計(jì)為土石圍堰。進(jìn)度安排,結(jié)合黃泥河水文條件,確定在10約100m,距壩址約80m,垂直河向長50m,體4.3.1.上游圍堰設(shè)計(jì)月截流.因?yàn)?1月份P=20%月平均流量為積約8萬m'。經(jīng)過與中國地質(zhì)大學(xué)進(jìn)行的專圍堰設(shè)計(jì)為土石混合圍堰,園堰頂寬108m/s, 截流難度不大。為能盡早進(jìn)行圍題分析,專題設(shè)計(jì)提出將該部分需進(jìn)行清為6.5m,軸線長度為48m,最大堰高為16.堰填筑,以便于為大壩基坑施工創(chuàng)造條件，除處理。3m,堰頂高程為1160.30m.上游側(cè)為堆石體因 此截流安排工程開工第一年11上旬進(jìn)采用方案一，圈堰布置在峽谷中上部，截流戧堤,邊坡為1: 1.5, 下游側(cè)堆石體邊施工技術(shù)上難度不大，可行性強(qiáng)。導(dǎo)流洞施坡為1 : 2.0,采用防滲土工布結(jié)合控制水5.2 截流施工工受到崩踏堆積體處理的施工干擾小,可泥灌漿進(jìn)行防滲處理。截流方式采用單戧立堵截流，單向進(jìn)獨(dú)立施工,而且,導(dǎo)流洞的封堵簡單;缺點(diǎn)4.3.2下游圍堰設(shè)計(jì)占.截流前先進(jìn)行備料,對壩前蹦踏堆積體是隧洞較長,施工時(shí)間長。根據(jù)導(dǎo)流洞出口水位~流量關(guān)系曲處理 和壩肩看挖碴料進(jìn)行篩選大粒徑料單采用方案二，圍堰布置在峽谷中部,施線, 選定導(dǎo)流流量對應(yīng)的水位為1144.50m，獨(dú)儲 備。截流時(shí)先采用大粒徑料進(jìn)行填筑，工技術(shù)上難度不大，可行性強(qiáng)。缺點(diǎn)是導(dǎo)流圍堰軸線處河底高程為1137.9m.堰型為然后再用開挖碴料進(jìn)行填筑。洞施工受到崩踏堆積體處理的施工干擾，土 石圍堰,設(shè)計(jì)堰頂高程為1145.0m,堰頂截流戧堤料采用1. 5m'挖捆機(jī)裝15t自優(yōu)點(diǎn)是導(dǎo)流洞可與泄洪洞結(jié)合,減少工程寬為3m, 背水面坡度為1: 1.5,迎水面坡度卸汽車運(yùn)輸 ,推土機(jī)推平進(jìn)占。投資,同時(shí)有利于大壩的安全運(yùn)行。為1: 2。因此,選擇方案二為本工程的推葬方4.4導(dǎo)流程序6結(jié)語根據(jù)本工程的特點(diǎn),攔河壩施工導(dǎo)流對修建在高山峽谷地帶徑流量大的高4.2導(dǎo)流洞設(shè)計(jì)分為前期、中期和后期三個(gè)階段。水頭水電站,施工導(dǎo)流是工程能否實(shí)施的4.2.1洞線布置前期導(dǎo)流:第一年2月一10月,河道過關(guān)鍵， 同時(shí)也關(guān)系到項(xiàng)目技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)。在由于導(dǎo)流洞和永久泄洪洞結(jié)合,導(dǎo)流流,進(jìn)行導(dǎo)流洞施工:第- -年11月-第二年進(jìn)行施工導(dǎo)流設(shè)計(jì)時(shí)，應(yīng)緊密結(jié)合工程的洞布置在滿足導(dǎo)流要求的前提下還應(yīng)盡可4月,河床截留,通過導(dǎo)流洞過流,攔河壩進(jìn)總體設(shè)計(jì)考慮,盡可能臨時(shí)和永久工程結(jié)能滿足泄洪洞要求。所以,導(dǎo)流隧洞布置于行河床基礎(chǔ)開挖和壩基混凝土澆筑。合，節(jié)約工程投資,從而使工程順利進(jìn)行。(上接90頁) .作為最佳反應(yīng)條件(見圖3)。度為10mg/mL時(shí),修飾劑/蛋白摩爾配比為留了較高的體外生物學(xué)活性(見圖1)。(4)修 飾配比。飾配比對單修飾轉(zhuǎn)化率4:1的情 況下，反應(yīng)10h.在最佳反應(yīng)條件(2)修飾反應(yīng)條件對單修飾產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的影響見圖4.可以看出，單修飾產(chǎn)物的轉(zhuǎn)下，單修飾轉(zhuǎn)化率可達(dá)到50%。本研究的修的影響。1)離子類型和離子強(qiáng)度:實(shí)驗(yàn)在相化率隨 著修飾劑/蛋白配比的增加而增大。飾反 應(yīng),為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。同pH值下(pH5.5),考查了不同離子類型對修 飾劑/蛋白配比進(jìn)行進(jìn)一- 步的探討:隨對單修飾轉(zhuǎn)化率的影響。選取了磷酸緩沖著 修飾劑/蛋白配比的逐漸增加，多修飾蛋參考文獻(xiàn)液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、檸檬酸一白 的轉(zhuǎn)化率逐漸增加,單修飾產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率[1]李大力,鄭迎迎.人工型精氨酸酶基因檸檬酸鈉緩沖液3種緩沖體系,發(fā)現(xiàn)離子類先增大后減小, 在4:1的條件下存在最大的克隆及其酵母表達(dá)[J].化學(xué)與生物工型對單修飾轉(zhuǎn)化率的影響并不明顯,在磷值。 可能原因是由于蛋白質(zhì)濃度以及修飾程,2008,23:47~49.酸氫二鈉-檸檬酸緩沖體系中,修飾轉(zhuǎn)化事劑/蛋白質(zhì)配比的增加,使得蛋白質(zhì)和修飾[2]楊成麗,鄭迎迎,柯前進(jìn),李大力.人工略大于其它兩種溶液。為繼續(xù)考查離子強(qiáng)劑分 子的碰撞機(jī)會增大,從而促進(jìn)了修飾型精氨酸酶基因的克隆及其在大腸桿度對對單修飾產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的影響,選取了反 應(yīng)的進(jìn)行(見圖4)。菌中的表達(dá)[J].化學(xué)與生物工程, 2007,5. 20.35mmol/L四個(gè)離子強(qiáng)度,發(fā)現(xiàn)單修飾綜上所述,得到10kD聚乙二醇丙醛修飾24:53~ 55. .產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率隨著離子強(qiáng)度變化較小，20精 氨酸酶的優(yōu)化修飾條件,即在4C下,在[3] Pool R.Hairy enzymes stays in themmol/L之后基本不變。2)蛋白濃度:蛋白濃20mmol/L, pH5.5的磷隱氫二鈉-檸檬酸緩blood. Science， 1990,248:305.度對單修飾轉(zhuǎn)化率的影響見圖2.單修飾產(chǎn)沖溶液中 ,蛋白濃度為10mg/mL時(shí),修飾劑/[4] Abuchowski A, Kazo GM，Verhoest物的轉(zhuǎn)化率隨著蛋白質(zhì)濃度的增加而增大。蛋白摩爾配比為4:1的情況下,反應(yīng)10h.該CR. Cancer therapy with chemically但是由于過高濃度下蛋白質(zhì)很不穩(wěn)定,容易種條件下,單修飾產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率可達(dá)50%。modified enzymes. Cancer Biochem聚集沉淀，因此選擇蛋白濃度10mg/mL作為Biopys, 1984,7(2):175~ 186.最佳反應(yīng)條件(見圖2)。3結(jié)語中國煤化工rmacopoeia, appendix 29.(3)反應(yīng)時(shí)間。反應(yīng)時(shí)間對修飾轉(zhuǎn)化率本研究采用分子量為1000-armacopoeia Comittee,的影響見圖3.單修飾和多修飾產(chǎn)物均隨著聚乙二醇 丙醛對精氨酸酶進(jìn)CNMHC民共和國藥典2005版,附錄反應(yīng)時(shí)間的增大而增加，10h后,單修飾產(chǎn)討了各修飾反應(yīng)條件的影響,委員會, 2005.物的增加不加明顯。反應(yīng)到10h的時(shí)候,單反 應(yīng)條件，即在4C下，在20mmol/L,pH5.5修飾產(chǎn)物的含量不再增加。因此,選擇10h的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中,蛋白濃92旁數(shù)據(jù)"gIENCE & TECHNOLOGY INFORMATION