50生物技術(shù)2011年21(3)1.7 :1.61.5-1.4豐1.3-.2手1.1日1.0拿=0.0.8-0.0010.010.1i01001000Concentrationy=(A-DV(1+(/G)+D:ABCD。STD(Standarda 美國(guó)對(duì)照:Concentration vg Men...0.94 .0.7015611.6660.9980.910.5971.131.6610088。Plot#2( Sample 2 2091111:Concentration vs Me...0.9607591.2910.99。Plot#3( Sample 3 209111:Concentration vs Mes..0.940.5821 838團(tuán)6純化的 rhKCF的活性測(cè)定與對(duì)照品的對(duì)比圖Fig.6 The mitogenie activity of purified rKCF compared with control國(guó)內(nèi)外報(bào)道的KGF的純化方法大多利用肝素親和層析對(duì)測(cè)方法的建立將為該因子的進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用提供良好rhKGF進(jìn)行有效的提純。但是考慮到肝素親和層析介質(zhì)不能基礎(chǔ)。耐受高pH,不適合工業(yè)化生產(chǎn)。我們根據(jù)hKGF等電點(diǎn)大于參考文獻(xiàn):7.而菌體蛋白大多小于7的特點(diǎn)，通過一步陽離子交換層析， [1]erey s. Rubin, Hioyuki Oad, Peul w. Finch, e al. Puifcationn對(duì)thKGF和菌體蛋白進(jìn)行有效分離。這樣,不但省去了不適and characteization of a newly idenified growth factor speeifie for epithelial合工業(yè)化生產(chǎn)的肝素親和層析,而且簡(jiǎn)化了純化步驟，提高了cells[ J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ,1989, 186 :802 - 806.純化收率,總收率達(dá)到了每升發(fā)酵液50mg以上。通過- -步離[2]harmaprojet數(shù)據(jù)庫(kù)(2011年更新).[3]Dina Ron, DonaldP. Botaro, Paul w. Finch, et al. Expression of bio-子交換層析實(shí)現(xiàn)rhKGF的高效純化還未見報(bào)道。KGF的活性專-性比較強(qiáng),主要限于上皮性細(xì)胞,尋找-logically acive recombinant keratinocyte growth factor[J]. The Journal of種專一的、敏感的檢測(cè)細(xì)胞一直是目前的研究熱點(diǎn)。我們通過Biologicacl Chemistry ,1993. 4(268) :2948 -2988.篩選,獲得了一種與文獻(xiàn)報(bào)道不同國(guó),對(duì)rhKGF較為敏感的細(xì)[4]安姆根有限公司.角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子的純化方法[P].中國(guó):1161380C. 1995 - 10-12.胞-貂肺上皮細(xì)胞Mv-1- lu,初步建立了hKGF生物學(xué)活[S]鄧林，劉孝菊，龔守良，等，重組截短型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1性檢測(cè)方法。經(jīng)檢測(cè),純化的rhKGF能刺激貂肺上皮細(xì)胞Mv的表達(dá)及純化[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào),2010 ,36<4) :629 -633.-1 - Lu的增殖,具有顯著的促有絲分裂活性,生物學(xué)活性與[6]蔡祥勝.重組截短型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子( rhKGFdesl -23)的克隆美國(guó)對(duì)照品Kepivance"相當(dāng)。表達(dá)和活性[ D].北京:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院,007.本研究建立了一種適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的制備高純度hKGF[7]許莉妍.角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)的表達(dá)及其生物學(xué)活性研究和的工藝和有效生物學(xué)活性的檢測(cè)方法。該工藝具有表達(dá)水平成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(FCFR)抑制劑穩(wěn)定轉(zhuǎn)染篩選模型的建立高、工藝簡(jiǎn)便、回收率高、產(chǎn)物活性高等特點(diǎn)。制備工藝和檢[D].廈門:廈門大學(xué),2009.聚乙二醇誘導(dǎo)雞紅細(xì)胞融合條件的優(yōu)化仇燕,李朝煒,苗芳(河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,河北石家莊050018)摘要:目的:探討聚乙二醇誘導(dǎo)雞紅細(xì)胞融合最適條件。方法:以雞紅細(xì)胞為材料,聚乙二醇為誘導(dǎo)劑，從細(xì)胞密度、融合溫度聚乙二醇濃度及反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),并設(shè)計(jì)3因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)計(jì)算細(xì)胞融合率。結(jié)果:雞紅細(xì)胞融合的最佳條件是:細(xì)胞密度為2x 10°個(gè)/ml .聚乙二醇濃度為35% ,反應(yīng)溫度為35"C中國(guó)煤化工33. 06%。關(guān)鍵詞:細(xì)胞融合;雞紅細(xì)胞;聚乙二醇MHCNMHG中圖分類號(hào):0813.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:Adoi : 10.3969/j. issn. 1004 -311X. 2011. 03.074Optimal Condition of PEG - Induced Chicken Red Blood Cells FusionQIU Yan,LI Zhao - wei, MIAO Fang2011年21(3)生物技術(shù)51(College of Biological Science and Engineering, Hebei Univerity of Science and Technology ,hjiachuang 050018 ,China)Abstract:Objective:To find the optimal condition of chicken red blood cells fusion with PEG ( Mw= 4000) as the revulsant. Method:The effects of diferent cell density , fusion temperature, PEG concentration and reaction time on cell fusion rate were studied. Three fac-tors and three levels of orthogonal test were designed to attain the best cell fusion condition. Result: The most appropriate condition forcell fusion was cell density 2 x 10*/ml, 35% PEG, 35 centigrade and 40min. Conclusion: Under this condition, the highest cell fusionrate reached 33. 06%.Key words:cell fusion; chicken red blood clls; PEG細(xì)胞融合( cell fusion)又稱細(xì)胞雜交,是指用人工方法使1.2.2 細(xì)胞融合兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞融合成-一個(gè)異核體細(xì)胞的現(xiàn)象。細(xì)胞采用血球板計(jì)數(shù)法將已洗滌純化的雞紅血細(xì)胞懸浮液稀融合技術(shù)一方面為脊椎動(dòng)物肌生成.炎癥反應(yīng)"、抑制腫瘤[2)釋成不同的密度,取1ml細(xì)胞懸液于離心管,放人水浴鍋中預(yù)及基因定位['等理論領(lǐng)域研究提供有力的手段;另-方面也熱,同時(shí)將不同濃度 PEG溶液放人水浴鍋中預(yù)熱。待溫度恒是制備單克隆細(xì)胞株及動(dòng)植物遠(yuǎn)緣雜交育種方面的重要技定后 ,在1ml細(xì)胞懸液中慢慢逐滴加入0.5ml PEG溶液(慢慢術(shù)。依據(jù)融合過程采用的助溶劑的不同,細(xì)胞融合可分為:①沿離心管壁流~下融合劑)，且邊加邊搖勻,然后放人不同溫度生物法:病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞融合,如仙臺(tái)病毒;②化學(xué)法:化學(xué)因水浴鍋中。 細(xì)胞融合- -段時(shí)間后 ,加入GKN溶液至8ml,靜止子誘導(dǎo)的細(xì)胞融合,如聚乙二醇( PEG) ;③物理法:激光、電脈于水浴鍋中20min左右。取出離心管,2 000r/min離心3min,沖誘導(dǎo)的細(xì)胞融合。中PEC介導(dǎo)細(xì)胞融合法是最簡(jiǎn)單最常使 細(xì)胞完全沉降。棄去上清液，加入GKN溶液至8ml,再離心用的方法,由于操作簡(jiǎn)便,不需復(fù)雜儀器,融合效果好(4.)等優(yōu)1次。染色棄去上清液,用手指輕彈底壁使沉淀松散,加入少點(diǎn)成為本科生細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課中的首選方法。傳統(tǒng)教材中量GKN溶液,混勻,取少量懸液于載玻片上,加入Janus green的融合條件為:細(xì)胞濃度常選用2x 10個(gè)/ml,融合條件為B 染液,用牙簽攪勻,染色3min后蓋上蓋玻片,觀察細(xì)胞融合30心,50% PEC( MW = 40)介導(dǎo)反應(yīng)10 ~ 15minloi。但在該情況。實(shí)驗(yàn)條件下細(xì)胞融合率較低,計(jì)數(shù)困難。為此,本實(shí)驗(yàn)在單因1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)對(duì)融合率進(jìn)行了全面系統(tǒng)比1.2.3. 1不同細(xì)胞密 度對(duì)融合率的影響較,以優(yōu)化PEC介導(dǎo)細(xì)胞融合的反應(yīng)條件。將10%細(xì)胞懸液(經(jīng)血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)此細(xì)胞懸液密度為1材料與方法.2x10個(gè)/ml)分別稀釋10倍、20倍.40倍和100倍。1ml不1.1 材料.同濃度細(xì)胞懸液預(yù)熱后,慢慢逐滴加入0. 5ml預(yù)熱后的50%1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料PEG溶液(慢慢沿離心管壁流下),且邊加邊搖勻,然后放入.雞全血,市購(gòu)。30C水浴鍋中20min,余下步驟同1.2.3。1.1.2試劑1.2.3.2不同融合溫度對(duì)融合率的影響PEC4000為分析純(25% .35% .50% .75% ) ,美國(guó)Biobas-取1.2.3.1中融合率最高的細(xì)胞懸液1ml ,將慢慢逐滴加ic公司;Alsever液0. 85%生理鹽水、GKN液Janus green B染人0.5ml預(yù)熱后的50% PEG溶液然后放入不同溫度(30C、液。35C、37C、39C )水浴鍋中20min,步驟同上。1.1.3 儀器1.2.3.3不同濃度 PEC對(duì)雞血細(xì)胞融合率的影響TDL-60B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);倒置顯微鏡向1ml細(xì)胞懸液中慢慢逐滴加入0.5ml不同體積分?jǐn)?shù)(Nikon ELIPSE E200) ;HH -2水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有PEG 溶液(25% .35% .50%、70% )隨后放入35C水浴鍋中反限公司)。應(yīng)20min,步驟同上。1.2 方法1.2.3.4不同反應(yīng)時(shí)間對(duì) 雞血細(xì)胞融合率的影響1.2.1雞血紅細(xì)胞懸液的制備1ml雞血細(xì)胞懸液加入0. 5ml 35% PEC溶液,35C融合不參照文獻(xiàn)[7]制備雞血與Alsever 液體積比為1:4的懸同時(shí)間(20min .30min .40min、50min、60min)。液,取1ml雞血懸液,加入4ml 0. 85%生理鹽水，混勻平衡后，1.2.4正交實(shí)驗(yàn)800r/ min離心3min,棄去上清液,再按上述條件離心2次。最在結(jié)合上述單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對(duì)影響細(xì)胞融合的各后,棄去上清液,收集離心沉淀的血細(xì)胞,加入4mlGKN溶液因素,即PEG濃度融合時(shí)間及融合溫度進(jìn)行三因素三水平正混勻后離心1次。棄去上清液,加GKN液(體積比1:9),制成交實(shí)驗(yàn)(如表1)。10%細(xì)胞懸液。表1_正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)的因素與水平ab. |中國(guó)煤化工收稿日期:2010 -11 -23;修回日期:2011 -03 -18YHCNMHGin)融合溫度(C)資助項(xiàng)目:河北科技大學(xué)理工學(xué)院教研項(xiàng)目(2009Y05) ;河北科技大學(xué)教研項(xiàng)目(2009 - YB010)資助30作者簡(jiǎn)介:仇燕( 1977 -),女,河北井陘人,博士,副教授,研究方向:細(xì)240胞生物學(xué)與分子生物學(xué)，發(fā)表論文20篇, Tel:0311 - 88632198 , Email:5037qiuyan77@ yahoo,. comn. cn。52生物技術(shù)2011年21(3)1.2.5融合率的計(jì)算范圍內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,見圖2A。由圖2A可知.細(xì)胞融合率隨細(xì)每組反應(yīng)條件制備3張裝片,每張涂片隨機(jī)選取3個(gè)視胞密度的增大而增高,10%細(xì)胞懸液稀釋10倍時(shí)即細(xì)胞密度野分別置于40倍顯微鏡中,計(jì)數(shù)其中已發(fā)生融合的細(xì)胞核及為2x10*個(gè)/ml細(xì)胞完整，相鄰及融合的最多,融合率達(dá)未融合細(xì)胞核數(shù),求平均值,計(jì)算融合率(81。10. 3% ,而10%細(xì)胞懸液用于融合反應(yīng)時(shí).細(xì)胞密度過大,無融合率=視野內(nèi)發(fā)生融合的細(xì)胞核總數(shù)/視野內(nèi)所有細(xì)法計(jì)數(shù)(結(jié)果未列出)。因此將2 x 10個(gè)/ml作為融合最佳細(xì)胞核總數(shù)x 100%胞密度。2結(jié)果與分析2.2.2融合溫度對(duì)融合率的影響2.1雞 血細(xì)胞融合過程的觀察由圖2B可知,細(xì)胞融合率隨著反應(yīng)溫度的升高而增加，顯微鏡下可見細(xì)胞融合過程中兩個(gè)細(xì)胞逐漸靠近(圖37C時(shí)細(xì)胞融合率最高達(dá) 20.15% ,并發(fā)現(xiàn)有少量細(xì)胞的細(xì)胞1A) ;兩個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞膜接觸.粘連;接觸點(diǎn)可能由于脂類分子膜破裂,可能是由于隨著溫度升高,膜流動(dòng)性加快,有利于細(xì)發(fā)生疏散使得細(xì)胞膜破潰(圖IB) ;兩個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)相互溝胞融合的進(jìn)行。但溫度過高時(shí),容易造成細(xì)胞膜的破損且融通,形成細(xì)胞質(zhì)通道,細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)通過這種通道得到轉(zhuǎn)移,兩合率下降，故將35C作為最適反應(yīng)溫度。2.2.3 PEG 濃度對(duì)個(gè)細(xì)胞連成一體(圖1C)。融合率的影響2.2 單因素試驗(yàn)PEG具有一定的毒性,且其濃度越大對(duì)細(xì)胞的毒性越大，2.2.1細(xì)胞密度對(duì)融合 率的影響極大地影響融合率和融合后細(xì)胞的存活率。由圖2C可知,融細(xì)胞密度是影響細(xì)胞融合的重要因素之一。PEG 濃度為合率隨PEC的濃度增加而升高,PEG濃度為35%時(shí)融合率最50% .30C下融合反應(yīng)20min,細(xì)胞密度在(2 - 20) x 10'個(gè)/ml高,因此,PEG的體積分?jǐn)?shù)- -般在25% ~ 50%較適宜。圖1細(xì)胞融合過程Fig. 1 The process of chicken red blood cells fusion25「B鼻8-信15￥86g 102↑下s052030353739細(xì)胞密度(x 10個(gè)/ml)融合溫度(C)cell density( x 10cel/mL)fusion temperature(C)信30c30「I; 25畫昌2:三215署號(hào)1010川員官s中國(guó)煤化工2535075MHCNMHG.PEC濃度(%)PEC concentratin(%)fusion time(min)日2 細(xì)胞密度(A)、融合溫度(B)、EC濃度(C)、融合時(shí)間(D)對(duì)細(xì)胞融合率的影響Fig.2 Efets of cell densily (A). fusion temperature (B). PEC concentntion (C) and fusion time (D) on cell fusion rate2011年21(3)生物技術(shù)532.2.4融 合時(shí)間對(duì)融合率的影響高對(duì)細(xì)胞的毒性越大,且PEG濃度過高時(shí)細(xì)胞反應(yīng)液體環(huán)境由圖2D可知,在一定時(shí)間范圍內(nèi)融合率隨反應(yīng)時(shí)間增加粘滯度升高,可能會(huì)阻礙細(xì)胞融合。本研究細(xì)胞融合的PEG而增加,反應(yīng)時(shí)間為40min時(shí)融合率最高達(dá)28. 36% ,而當(dāng)反最適濃度為35% ,融合率為26. 78%.明顯高于于李秀蘭等12]1應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)為60min時(shí)細(xì)胞膜破裂較多,細(xì)胞形狀發(fā)生改變，采用的最適濃度為50% PEG時(shí)融合率為20.72%。最適溫度、故反應(yīng)時(shí)間的適宜范圍在30 ~ 50min。PEG濃度,細(xì)胞融合的最適融合時(shí)間為40min,結(jié)果與趙詠2.3正交試驗(yàn)梅']研究結(jié)果-致。筆者認(rèn)為低濃度PEG延長(zhǎng)融合時(shí)間,可在結(jié)合上述單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對(duì)影響細(xì)胞融合的各以取得較好的融合效果,且對(duì)細(xì)胞損傷較少。前人的報(bào)道1.8]因素,即融合溫度、PEG濃度、融合時(shí)間,進(jìn)行三因素三水平正只進(jìn)行了單因素對(duì)雞血細(xì)胞融合率的影響,本研究系統(tǒng)地進(jìn)交實(shí)驗(yàn)。正交試驗(yàn)的結(jié)果(見表2)表明,三種考察因素對(duì)行了單因素實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn)。通過正交試驗(yàn)極差分析確定雞PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合效果影響程度不同,計(jì)算分析可以得出極紅細(xì)胞融合的最佳條件組合為A2B2C2 ,即PEG濃度為35%、差(R)A>C> B,即PEG濃度對(duì)雞紅細(xì)胞的融合率影響較大，反應(yīng)溫度為35C下融合40min。在此條件下進(jìn)行了3次平行其次為融合溫度、反應(yīng)時(shí)間。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),細(xì)胞平均融合率為33.06%均高于文獻(xiàn)7.8.12所報(bào)表2 1,33 正交試驗(yàn)及結(jié)果分析道融合率。在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞密度為2.0x 10°Tab.2 L3 Orthogonal test and result analyis個(gè)/ml時(shí)細(xì)胞融合率達(dá)最高,但升高到2.0x 10'個(gè)/ml時(shí),就試驗(yàn)號(hào)B細(xì)胞融合率(%)因密度過高而無法計(jì)數(shù),下一步我們將在A2B2C2條件下進(jìn)行1(25%) 1(30min)1(33C)7.5最適細(xì)胞密度的探索。2( 40min)2(35C)11.59 .參考文獻(xiàn):3(50min)3(37C)9.2[1]Clas B. Johansson, Sawsan Youssef, Kassie Koleckar, et al. Extensive2(35%)24. 13fusion of haematopoietic cells with Purkinje neurons in response to chronic216.78infammation[J]. Nature Cell Biology, 2008 ,10:575 -583.322. 39[2]Zhi Hu, Shihui Liu, Xuancheng Mai, et al. Anti - tumor efects of fu-3(50% )7.0sion vaccine prepared by renal cell carcinoma 786 - 0 cell line and periph-14. 28eral blood dendritic cells of healthy volunteers in vitro and in human im-10.53mune reconstituted SCID mice[J]. Cellular Immunology, 2010, 262T8.29%8.63%44.17%(2);112-119.T263.3%42. 65%46.25%[3]Claire Robinsona and Andreas F Kolb. Analysis of mammary speiegene loeus regulation in diferentiated cells derived by somatic cell fusionT:31.81%42. 12%30. 98%[J]. Experimental Cell Research,2009 ,315(3): 508 -522.R35.01%4.02%I5. 27%[4]Anna Piliszck, Jacek A Molinski, Kazimiera Pyniak, et al. Foetal fi-注:TI、T2.T3分別為各因素不同水平含量之和,R為極差。broblasts introduced to cleaving mouse embryos contribute to full - lerm de-velopment[J]. Reproduction ,2007 ,33(1): 207 -218.3討論[5]Elizabeth H. Chen and Eric N. Olson. Unveiling the mechanisms ofPEG對(duì)水有極高的親和性,可與水分子借氫鍵結(jié)合,產(chǎn)生cell fusion[J]. Science ,2005 ,308: 369 - 373.滲透梯度導(dǎo)致細(xì)胞間或囊泡間的聚集。較高濃度時(shí)(40% ~[6]楊漢民細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].2版.北京:高等教育出版社,50% ,分子量為4000 ~8000),由PEG產(chǎn)生的高滲透壓破壞1997:109 -110.互相接觸處的細(xì)胞膜的磷脂雙分子層,使得細(xì)胞間的接觸點(diǎn)[7]趙詠梅，郭云婷,馬蕊，等.PEC介導(dǎo)細(xì)胞融合的最適條件探究質(zhì)膜變得不穩(wěn)定9”,隨后形成-一個(gè)大的雙核或多核融合細(xì)胞。[J].西安文理學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2007, 10(3):7 -78.有文獻(xiàn)報(bào)道以兔血細(xì)胞、鴿血細(xì)胞及小鼠血細(xì)胞([7.10]為材料，[8]趙彥禹,張艷華,馮照軍.雞紅細(xì)胞融合最適條件得探討[J].生物但這些材料成本高,且實(shí)驗(yàn)效果不佳。筆者也試用小鼠血細(xì)磁學(xué),2006,6(1):43 -44.胞為材料,但由于細(xì)胞小且無核,使得判斷融合與否非常困[9]SW Hui, TL Kuhl, YQ Guo, el al. Use of poly( ethylene glycol) t0o難。而雞血紅細(xì)胞體積較大且細(xì)胞核清晰,易于觀察與統(tǒng)計(jì)control ell aggregation and fusion[ J]. Colloids and Surfaces B: Bioint-融合細(xì)胞。erfaces, 1999 ,14: 213 -222.細(xì)胞密度決定細(xì)胞間發(fā)生融合的有效距離,進(jìn)而影響細(xì)[10]中國(guó)煤化工作細(xì)胞融合材料的可行性胞融合率。通過比較不同細(xì)胞密度對(duì)融合率影響，結(jié)果得出研究33(3): 244- 245.密度為2x 10*/ml為最適條件。同一時(shí)間下雞血紅細(xì)胞融合[1]HC N M H G胞融合條件的正交設(shè)計(jì)優(yōu)的最適溫度為37C ,膜的流動(dòng)性隨溫度上升而加快,有利于細(xì)化[J].生物技術(shù),2009,19( 6):44-45.胞融合的進(jìn)行。但溫度為39C時(shí),細(xì)胞膜破裂，融合率降低，[12]李秀蘭,姜日水.聚乙二醇誘導(dǎo)細(xì)胞融合影響因素探究[J].菏澤其結(jié)果與魯云風(fēng)等["的研究結(jié)果-致。PEG 的體積分?jǐn)?shù)越學(xué)院學(xué)報(bào).2007 ,29(5):79 -82..