第22卷第6期試驗研究乙二醇對綿羊凍精效果的研究劉玉峰,李武,蘭翠(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動物繁殖教研室,哈爾濱150030摘要:以含甘油的四組稀釋液為對照組,以等量的乙二醇替換甘油作為相應(yīng)的試驗組研究乙二醇對綿羊凍精效果的影響。結(jié)果表明,試驗組凍后精子活力、頂體完整率顯著高于對照組(P<0.05)并確定了3號試驗組稀釋液為最適精液冷凍配方,其乙二醇濃度為10%時冷凍保護效果最好關(guān)鍵詞:乙二醇;綿羊;精液冷凍中圖分類號:S826.34文獻標(biāo)識碼:A文章編號:1007-9726(2002)06-0009-03從1974年開始,我國進行綿羊冷凍精液的保存液冷凍保存中作為冷凍保護劑,研究乙二醇對綿羊研究,但其發(fā)展較慢,原因主要是解凍后精子復(fù)蘇率凍精效果的影響,以期找岀更適于綿羊精液冷凍的低,異常精子多,受胎率仍低于正常受胎率,而這些新途徑主要的關(guān)鍵是對精子的防凍能力及解凍后受精力的1材料與方法維持仍沒有得到很好的解決。目前綿羊精液冷凍稀1.1材料釋液中最常用的抗凍保護劑是甘油,但在常溫下甘1.1.1實驗動物本實驗所采用的綿羊是黑龍江油對精子有毒害作用,對凍后精子的活力和精子頂省牡丹江田園牧業(yè)種羊基地于2000年從澳大利亞體完整率具有很大的負(fù)面影響12。本試驗借鑒胚胎引進的道塞特種公羊,這些羊采用放牧+舍飼的飼快速冷凍過程中,用乙二醇作保護劑較甘油易達到養(yǎng)方式,在采精期間補喂胡蘿卜和雞蛋非晶狀態(tài),不易形成冰晶,且乙二醇對細胞毒性1.1.2實驗器材羊用假陰道和集精杯,顯微鏡,溫度計,漏斗,天平,消毒鍋,0.25m冷凍細管,酒收稿日期:2精,凡士林,生理鹽水,伊紅,紅細胞計數(shù)器。各種稀第一作者簡介:劉玉峰(1978—),滿族,黑龍江雙城釋液均采用國產(chǎn)試劑配制。人。動物遺傳育種與繁殖專業(yè)在讀碩土。2方法較小,可在較高溫度下加入的特點。將其用在精1,2,1精液的采集和品質(zhì)評定常規(guī)假陰道采精;→““+-““+-“““明卵泡并沒有發(fā)育到成熟的程度。如卵泡大量發(fā)育予補飼精料或補飼量很少,日糧基本以秸稈為主的成熟,必產(chǎn)生大量雌二醇,綿山羊發(fā)情周期中激素變條件下,受胎率僅50%以下。因此,要提高波雜羊繁化證明,正是發(fā)情周期中1~2次雌激素高峰和孕酮殖率,必須注意提高日糧能量、蛋白質(zhì)水平,并提的下降對下丘腦一垂體產(chǎn)生正反饋作用,于是引起定量青綠飼料。按35kg活重計,每天代謝能必須LH濃度劇增,促使排卵從表上的數(shù)據(jù)可以看出,在9.5MJ以上,粗蛋白在140g以上,比較合適。5只羊沒有雌激素波峰,自然不可能排卵.但有2只參考文獻山羊出現(xiàn)一次小峰值,分別達23.97和23.72pg/ml,[1]程瑞禾湖羊卵泡及卵母細胞生長與閉鎖的研究但此時孕酮的峰值卻偏高,說明這類羊卵泡不可能L].中國養(yǎng)羊,1989,(2):17~19發(fā)育成熟至排卵。因此如何調(diào)整性激素之間的濃度22趙永前,蔣兆春,等復(fù)方仙陽湯對山羊生殖內(nèi)分泌關(guān)系,以恢復(fù)卵巢的機能,還需進一步研究影響[].中國獸醫(yī)雜志,2000,26(4):36~37[3]嚴(yán)忠慎.海門山羊發(fā)情周期和妊娠期外周血漿中孕3.3根據(jù)我們從不同飼養(yǎng)條件不同羊場觀察表明酮、雌二醇和睪酮的濃度變化[門].江蘇農(nóng)學(xué)院學(xué)報,這類羊受胎率各地很不一致,主要原因在于飼養(yǎng)條1990,11(1):61~6件有否改善。一些羊場在山羊發(fā)情季節(jié)采取補飼、提[4]技術(shù)講座激素繁殖調(diào)節(jié)的關(guān)鍵[J.黑龍江動物繁10中國草食動物2002年精液采岀后,肉眼觀察評定精液的顏色、渾濁度;稀1.2.3精液處理釋后鏡檢目測判斷其密度和活力。精子活力在65%1)精液凍前處理:精液采出后,立即用顯微鏡以上的鮮精,其外觀、密度及活力正常者用于冷凍保目測其活力,并用微量注射器量出其體積,自然降溫存至與室溫相同的溫度,將采出的種公羊的精液等分精子計數(shù)按原精液做200倍稀釋,滴入紅細胞成8份,按上表四種對照組及其相應(yīng)的試驗組進行計數(shù)板,立即在40倍顯微鏡下觀察,計數(shù)死精子數(shù)1:1稀釋并檢查精子的活力。稀釋后的精液采用逐和總精子數(shù)及每毫升所含的活精子數(shù),并以此算出級降溫法,在1~1.5小時內(nèi),使稀釋的溫度降到4精子的存活率。用此數(shù)據(jù)作標(biāo)準(zhǔn),衡量精液質(zhì)量和冷5C,然后置4~5C的冰箱內(nèi)平衡2~4小時凍效果,并對目測結(jié)果進行校正。頂體完整率測定采2)精液的冷凍:在4~5C將精液用0.25ml的用姬姆薩染色法觀察頂體完整率塑料細管分裝后,放在自制的液氮飄浮器上,液氮飄1.2.2稀釋液及保護液的配制及篩選按成分比浮器距液氮面1.5~2.0cm,液氮熏蒸5分鐘后,將例配制以下稀釋液,其成分見表1。裝精液的細管放入液氮內(nèi)(-196C)冷凍表1所述四種精液冷凍稀釋液配方作為對照3)精液的復(fù)蘇:將在液氮中保存的細管精液迅組,將其配方中的甘油替換為等量的乙二醇作為相速放入40C水浴中解凍30秒。解凍后立即檢查解應(yīng)的試驗組。凍后活力表1四個對照組稀釋液配方基礎(chǔ)液I液液組別乳糖檸檬酸鈉葡萄糖蒸水取基礎(chǔ)液卵黃甘油取I液甘油100ml2Og3.0g80ml94ml 6ml1.5g3.1100mlumlLOOmI71.5ml25ml 3. 5ml2結(jié)果與分析的保護作用比甘油好。根據(jù)以上稀釋液的解凍后活2.1精液質(zhì)量精液呈乳白色,似云霧狀翻騰:無力,我們確定3號試驗組(乙二醇)為最適合的綿羊異味。目測及計數(shù)活力均為0.8,密度為18.6~2.4精液冷凍配方億個/ml2.3最佳保護劑濃度的確定選用3號試驗組稀2.2不同稀釋液的冷凍結(jié)果詳見表2。釋液,將Ⅱ液中乙二醇的濃度分別改為4%、6%8%、10%和12%時進行冷凍試驗。解凍后在顯微鏡表2不同稀釋液對精液冷凍效果的影響下記數(shù)活力,分別為組稀釋后平衡后凍后目凍后計凍后頂體0.434。其結(jié)果表明,在稀釋液中乙二醇濃度為10%別活力活力測活力數(shù)活力完整率(%)(V八V)時,即冷凍精液中乙二醇濃度在5%(V/V)1對照0.750.700.300.298±0.0140.25時其保護作用最好。1試驗0.750.75.300,310±0.0346,833討論2對照0.800.750.300.291±0.0242.152試驗0.750.700.250.264±0.0345,23在家畜的精液冷凍過程中可采用的冷凍保護劑3對照0.800.700.350.346±0.0246.25種類很多,其中以甘油最常用,效果比較穩(wěn)定。但甘3試驗0.8000.400.421±0.0356,47油本身較粘稠,易阻礙精子從陰道向子宮的移動,其4對照0.750.650.300.312±0.0141.22分子較大,滲入或滲岀細胞的速度較水分子慢,在常4試驗0.750.700.350.357±0.0345.87溫時對細胞毒性也較大,會增加凍后精子的畸形通過乙二醇試驗組和甘油對照組的凍后活力比率,近年來在動物胚胎冷凍保存方面研究發(fā)現(xiàn),乙差異顯著(P<0.05)說明用乙二靜作保護劑具醇冷凍效果不亞于甘油,且其分子小毒性小,滲第22卷第6期試驗研究冷凍方面的應(yīng)用研究報道還很少。子頂體完整率的提高.使輸精后的受胎率也隨之得本試驗選用乙二醇作為精液冷凍的保護劑,并到了提高。對其適宜濃度進行了研究,試驗結(jié)果表明,綿羊冷凍參考文獻精液中乙二醇以5%(V/V)時,其保護效果最佳。試[1]謝成俠·劉鐵錚編著.家畜繁殖原理及其應(yīng)用[M南驗組精液稀釋后活力與平衡后活力相比較,變化不京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,1994大。且精液解凍后在常溫下放置12小時,其活力仍[2]邰秀林,龍翔.不同冷凍保護劑在豬精液冷凍中的作能滿足輸精要求,說明乙二醇在常溫下(15~20C)用效果[J,四川畜牧獸醫(yī)學(xué)院學(xué)報,1998,12(2):25對精子無毒害作用,用乙二醇作為精液冷凍保護劑3]趙曉娥,王光亞等.布爾山羊細管冷凍精液研制初報具有比甘油更好的效果,且能明顯提高凍后精子的J].西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1999,27(2):19~2頂體完整率。其原因可能是這種保護劑在溫度較高4]王鋒,金穗華.乙二醇、丙二醇對牛凍精效果的影響時加入,既無毒性又可充分滲透到精細胞內(nèi),使精子LJ].黑龍江動物繁殖,19986(4):11~13在快速冷凍過程中更易達到非晶狀態(tài),不易形成冰[5] Graham w, Frances H P. Animal Reproductive Sci晶,從而降低細胞內(nèi)冰晶的數(shù)量和體積,對精子起到1986,(10):317~324.保護作用精子頂體完整率與受精能力密切相關(guān),精[6]RoyH, James K G. Cryobiology,192,29:26~3844(上接第21頁)在遺傳結(jié)構(gòu)上彼此非常接近。這可度的遺傳分化,但總體上群體之間的遺傳分化程度能是長期以來,灘羊產(chǎn)區(qū)自然生態(tài)環(huán)境惡劣、人民生仍然處于一個非常低的水平,群體間在遺傳結(jié)構(gòu)上活水平低、飼養(yǎng)管理條件落后且相對封閉加之一些彼此非常接近。續(xù)完)自然災(zāi)害和疾病等突發(fā)因素造成的瓶頸效應(yīng)使得灘參考文獻羊群體遺傳多態(tài)性不是十分豐富。1]李積友,韓建林,等.灘羊種質(zhì)及血液遺傳標(biāo)記研究結(jié)論L.中國養(yǎng)羊,1993,13(4):21~24.1根據(jù)有效等位基Ne)、多態(tài)基因座百分2李積友,自雅琴等灘羊血紅蛋白(Hb)分布的地區(qū)數(shù)(P)、 Shannon指數(shù)()及Nei氏預(yù)期基因雜合差異研究[].甘肅畜牧獸醫(yī),1995,25(2):6~度(HD)等指標(biāo)得出:甘肅灘羊地方群體存在一定程[3]李積友韓建林等血清運鐵蛋白多態(tài)性的研究中國畜牧雜志,1995,(4):21~23的遺傳變異,但變異程度不是很高4]李積友韓建林,等.堿性磷酸酶和淀粉酶活性分布4.2甘肅灘羊地方種群之間的平均基因多樣度研究[].草食家畜,1995,(3):6~6,26(D)和基因分化系數(shù)(G)以及Nei氏遺傳同質(zhì)度51]李積友,韓建林,灘羊地方種群親緣關(guān)系的生化透(ⅠD)和遺傳距離(D)均說明:甘肅灘羊是由共同祖?zhèn)鲗W(xué)研究[A].中國動物遺傳育種研究,北京:中國先繁衍進化而來的,盡管灘羊群體之間存在一定程農(nóng)業(yè)科技出版社,1995.206~211歡迎訂閱2003年《乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)》《乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)》原名《上海奶?！?1978年創(chuàng)辦至今,已連續(xù)按期出版24年100期?！度闃I(yè)科學(xué)與技術(shù)》為集奶牛與乳品兩大行業(yè)為一體的綜合性科技期刊,主要內(nèi)容有:乳品研究、乳品加工、新品開發(fā)、乳品微生物、乳質(zhì)檢驗、乳業(yè)機械;奶牛繁殖育種、生理生化、飼養(yǎng)管理、飼料營養(yǎng)、疾病防治與環(huán)境衛(wèi)生以及乳業(yè)論壇、乳業(yè)法津法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量、經(jīng)營管理、讀者信箱及商品市場信息等。《乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)》的主要讀者和服務(wù)對象是從事奶牛業(yè)、乳品業(yè)及相關(guān)行業(yè)的各級科研、生產(chǎn)、經(jīng)營、管理、教學(xué)人員以及廣大的奶牛養(yǎng)殖人員《乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)》為季刊,每年出版4期國內(nèi)外公開發(fā)行,刊號ISSN1671-5187CN31-1881/大16開本,彩色封面,全銅版紙,每期單價7.50元,全年30元。自辦發(fā)行,可隨時匯款隨時訂閱,匯款地址