Vol. 12,No.19精細(xì)與專用化學(xué)品第12卷第19期●12.Fine and Specialty Chemicals2004年10月6日新品介紹腺苷的合成與應(yīng)用施慶珊*許虹林小平邱玉棠(廣東省微生物研究所,廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實驗室,廣東廣州510070)摘要:腺苷是一種重要的醫(yī)藥原料,在醫(yī)藥工業(yè)中有很多重要的用途。本文介紹了腺苷生產(chǎn)的兩種主要方法,即生物合成法(發(fā)酵法或RNA降解法)和化學(xué)合成法。其中采用糖質(zhì)原料直接發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的成本最低,但在國內(nèi)此方法尚未完全成熟,國內(nèi)目前主要仍以化學(xué)合成法為主。此外,還簡要介紹了腺苷在醫(yī)藥工業(yè)方面的應(yīng)用和市場發(fā)展前景。關(guān)鍵詞:腺苷;生物合成;化學(xué)合成;醫(yī)藥原料Synthesis and Application of AdenosineSHI Qing-shan, XU Hong, LIN Xiao-ping, QIU Yu-tang(Guangdong Institute of Microbiology , Guangdong Provincial Key Laboratory ofMicrobial Culture Collection and Application, Guangzhou 510070, China)Abstract: The adenosine is a kind of important pharmaceutical raw materials ，and it is applied in pharmaceutical in-dustry widely. In this paper, two main methods i. e. chemical synthesis and biosynthesis ( by fermentation or by decomposi-tion of ribonucleic acid) for production of adenosine are introduced. Among these methods, cost of the direct fermentationof sugar is the lowest to produce adenosine, but this method has not been tally perfect in China. At present, the produc-tion of adenosine still relies mainly on chemical synthetic method domestically. In addition, the applications of adenosine inmedicine and market prospect are introduced briefly.Key words: adenosine; biosynthesis; chemical synthesis; pharmaceutical raw material腺苷是一種天然存在的遍布人體細(xì)胞的內(nèi)源性法主要有發(fā)酵法和RNA降解法兩種，由于發(fā)酵法生嘌呤核苷,是三磷酸腺苷(ATP)的降解產(chǎn)物。腺苷產(chǎn)腺苷有成本.上的優(yōu)勢,因此是今后腺苷生產(chǎn)的發(fā)以其擴(kuò)血管作用而被人們所熟知，除具有廣泛的心展方向。本文以腺苷產(chǎn)生菌為例,詳細(xì)介紹腺苷的臟效應(yīng)以及快速顯著的冠脈擴(kuò)張作用外,還具有觸發(fā)酵生產(chǎn)法,同時簡要介紹了RNA降解法和化學(xué)合發(fā)或介導(dǎo)缺血預(yù)適應(yīng)、減輕再灌注損傷等心臟保護(hù)成法。效應(yīng)。在美國,腺苷是經(jīng)FDA批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)復(fù)陣發(fā)性室1理化性質(zhì)上性心動過速(PSVT)的一線藥物,也是經(jīng)FDA批準(zhǔn)的用于心臟藥物負(fù)荷試驗的兩種藥物之一,已成腺苷(Adenosine)學(xué)名腺嘌呤核苷(9-B-D-Ribo-為急診處理快速性心律失常和藥物負(fù)荷試驗的常規(guī)furanosyl adenine), 分子式C， H, N,0,分子量用藥。同時,腺苷還是一種重要的醫(yī)藥原料,利用腺267. 24,結(jié)構(gòu)式如圖1所示;為含1.5分子水的無色苷可制成許多藥物如ATP、環(huán)腺苷酸、阿糖腺苷等。針狀結(jié)晶,于100C真空處理失去結(jié)晶水。有微咸自從1909年首次從苦味酸鹽中提取出腺苷后，苦味,易溶于水,幾乎不溶于醇和醚,易為稀無機(jī)酸其合成和應(yīng)用就得到了廣泛的研究。腺苷的合成總水解得到腺嘌呤和D-核糖,熔點(diǎn)234 ~ 235C,比旋的來說可分為生物合成法和化學(xué)合成法,生物合成度[a125-61011 0水). nK3.5(堿性基團(tuán))，中國煤化工THCNMHG*收稿日期: 2004-07-21基金項目:廣東省科技攻關(guān)項目腺苷產(chǎn)生菌選育及發(fā)酵工藝研究(項目編號2002C1040103)資助。作者簡介:施慶珊(1966- ),男,副研究員,從事工業(yè)微生物菌種選育及發(fā)酵工藝的研究和開發(fā)工作。2004年10月6日施慶珊,等:腺苷的合成與應(yīng)用●13●12.5 (酸性基團(tuán))。有紫外吸收，紫外吸收數(shù)據(jù)見活化培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,尿素4,玉米漿6,蛋表1。白胨10,酵母膏10,鳥嘌呤0.025,pH7.0;發(fā)酵培養(yǎng)NH基(g/L):葡萄糖120,玉米漿12,藥用酵母粉18,硫酸銨10,磷酸二氫鉀1,硫酸鎂1,pH7.0。HO-(3)發(fā)酵工藝、菌種在保 藏培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后,接入裝有20mL液體活化培養(yǎng)基的500mL三角0H 0H瓶(0. 07MPa滅菌10min)中,32C于往復(fù)式搖床(振圖1腺苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)幅72cm、頻率100r/m)振動培養(yǎng)15h。液體種子按5%接種量接入裝有20mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三表1腺苷紫外吸收數(shù)據(jù)角瓶(0.1MPa滅菌15min)中,32 ~ 36C于往復(fù)式搖H1.2床(振幅76cm、 頻率100~ 120r/m) 振動培養(yǎng)72 ~λ最大/mm25726096h,同時,在發(fā)酵至4~6h時,用16%(v/v)氨水&最大x10-314. 9g260 x 10-314. 3調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至7.0,發(fā)酵至12 ~60h時,用16%λ小/nm230227(v/v)氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至6.0。發(fā)酵結(jié)束后,產(chǎn)0. 840. 78物可用離子交換樹脂或用超濾膜提取。用此方法進(jìn)As20/A2600.220.14A20/A260 .0.030行發(fā)酵,腺苷最大生成量可達(dá)18g/L。2.2 RNA 降解法RNA(核糖核酸)是生命存在的物質(zhì)基礎(chǔ),幾乎2生物合成所有的生物體內(nèi)都含有RNA(某些病毒除外),從微2.1 發(fā)酵法生物中提取RNA是工業(yè)上最實際和有效的方法。1937年,Hemut等[")報道了通過發(fā)酵得到核苷-些最常見的微生物菌體中含有豐富的核酸資源，酸,再進(jìn)行酶解得到腺苷;1954年,John等12)用腺嘌如啤酒酵母、紙漿酵母、石油酵母、糖蜜培養(yǎng)的面包呤和肌苷通過大腸桿菌發(fā)酵,用游離細(xì)胞法得到了酵母、綜合利用生產(chǎn)的白地霉、抗菌素(如青霉素)腺苷;1965年,奧村(3)用芽孢桿菌為產(chǎn)生菌進(jìn)行腺菌絲體等。在較系統(tǒng)篩選的某些酵母菌(所謂的高苷發(fā)酵,生成量為1.1g/L ;1968年,小西真八等(4)核酸酵母)如白假絲酵母(Candidautili)、啤酒酵母使用枯草桿菌的異亮氨酸缺陷型在含有異亮氨酸(Sarcharomyces Cereisiae) ,以糖蜜和醋酸為碳源，培0.03%的培養(yǎng)基中積累1. 26g/L的腺苷(最高可達(dá)養(yǎng)過程中加入氣化鋁或硫酸鋁,pH控制在4.5,菌2.45g/L);1976年,中山清']用耐2-氟腺嘌呤的產(chǎn)體RNA含量可高達(dá)16%以上。氨短桿菌ATCC21709在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)RNA降解法生產(chǎn)腺苷主要包括幾個步驟:96h,腺苷生成量為2. 1g/L;1986年,美國的Howaird(1)RNA粗品的制備培養(yǎng)好的 菌體離心收集ML等l6)用酵母菌進(jìn)行腺苷發(fā)酵的研究,產(chǎn)量小于后,用10%干菌體、10%NaCl、90~100C高溫抽提,5g/L;用發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷最成功的是日本的Haneda.抽提液可用超濾分離出RNA,也可用苯酚沉淀蛋白等'),他采用芽孢桿菌P53-18菌株以葡萄糖為原料質(zhì),離心,去沉淀,取上清液用乙醇沉淀,收集沉淀物進(jìn)行發(fā)酵,腺苷最大生成量達(dá)16g/L。下面以本研干燥后即得到RNA粗品。究組篩選的腺苷產(chǎn)生菌(芽孢桿菌突變株)為例,詳(2)RNA的酶解RNA0. 5%、酶液(如桔青霉細(xì)介紹腺苷的發(fā)酵法生產(chǎn)。酶液)10%(v/v)、pH5、溫度70 ~75C、降解2h,得(1)菌種肌苷產(chǎn)生菌枯草芽孢桿菌CMI-到4種單核苷酸混合物。741(8)為出發(fā)菌株,通過多因子誘變選育出具有黃(3)核苷酸混合物分離用離子交換樹 脂分離嘌呤缺陷型、喪失腺嘌呤脫氨酶的腺苷產(chǎn)生菌CMI-出AMI中國煤化工Xn200(Xan^)。YHCNMHG年H為5.0或(2)培養(yǎng)基保藏培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨4,牛5.5條件下,5*-AMP回流40h脫去磷酸根得到腺肉膏14,酵母膏7,鳥苷0.05,瓊脂20,pH7.0;液體苷, 產(chǎn)率為80%。精細(xì)與專用化學(xué)品第12卷第19期氣-9-<(B-D-2' ,3' ,5'三乙?；秽颂?嘌呤[12);3化學(xué)合成最后氨解步驟同由次黃嘌呤合成腺苷的一樣。3步腺苷的化學(xué)合成方法很多,如:①由2, 8-二氯反應(yīng)的總收率約為50% ~60%。 合成路線如圖3嘌呤合成腺苷;②由2-甲基硫代腺苷合成腺苷;③所示。由5-胺4-氰基-1-瞇唑_D-核糖呋喃或其衍生物合成OFOH腺苷;④由8-巰基-9-甲基腺嘌呤合成腺苷;⑤由.2' ,3' ,5'三乙?；吸S苷合成腺苷。上述方法起始原料價格較貴,難以應(yīng)用于大規(guī)模合成中。由于HOH2C、0、 |AeOH2C、0近幾年來,國內(nèi)肌苷發(fā)酵水平大幅度提高,肌苷生產(chǎn)POCI3成本已下降到5萬元/t左右,因此以肌苷為起始原HO OHAcO OAc料進(jìn)行腺苷的合成目前已進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)階段;另CI外,以肌苷為原料合成抗病毒藥物三氮唑核苷( Ribavirin,利巴韋林)時,有大量副產(chǎn)物次黃嘌呤產(chǎn)生,因此,以次黃嘌呤為原料合成腺苷在成本上也是AeOH2C、s可行的。CHgOH-NH，， 腺苷3.1由 次黃瞟呤合成腺苷AcO 0Ac由次黃嘌呤為起始原料合成腺苷時,首先次黃圖3由肌苷合 成腺苷的路線嘌呤與三氯氧磷( POCI,)反應(yīng)制得6-氯嘌呤,6-氯嘌呤再與四乙酰核糖在特制的催化劑作用下發(fā)生縮4應(yīng)用與展望合反應(yīng)(130 ~ 140C),生成縮合物6-氣-9-(B-D-2',腺苷作為藥物，由日本藤澤藥品工業(yè)公司( Fu-3', 5'-三乙?；秽颂?嘌呤,縮合物在0C飽.jisawa)的子公司Lyhomed于1989年首先投人美國和的氨甲醇作用下氨解(100C,氨解10 h。)制得腺市場,隨后又在英國、比利時、法國等多個國家獲得苷,3步反應(yīng)的總收率約為45%。合成路線如圖2批準(zhǔn),在美國,目前腺苷的年銷售額約3000萬美元。所示(10)。在國內(nèi)，以腺苷為原料生產(chǎn)腺苷制劑的廠家比較多，0Cl Ac0- \ OAc如沈陽光大制藥有限公司生產(chǎn)的腺苷注射液，法國P0C]z .OAc OAc的SamifeWintrp公司曾于1996年在我國申請腺昔注射劑品種的注冊登記。另外,腺苷也是合成其它.核苷類藥物的中間體,利用腺苷可制成許多藥物如C嘌呤霉素、高瓜氨基腺苷、賴氨酰氨基腺苷、琥珀酰-5' -腺苷酸、S-腺苷蛋氨酸、腺苷乙硫氨酸等核苷類AcO- pNH,-MeOH腺苷抗菌素,由于它們是肽合成的抑制劑,具有廣譜抑菌OAc 0Ac作用,可用于治療乳腺癌及其他病毒性疾病等()。圖2由次黃嘌呤合成腺苷的路線利用腺苷為原料還可合成阿糖腺苷、單磷酸阿糖腺3.2由肌苷合 成腺苷苷(Ara-Amp)、ATP 、環(huán)腺苷酸等藥物。其中,阿糖20年前,肌苷發(fā)酵水平很低、價格很高,是由腺腺苷現(xiàn)市場價60萬~80萬元/kg,有廣譜的抗DNA苷在亞硝酸作用下脫氨而產(chǎn)生的;而現(xiàn)在情況相反，病毒、RNA病毒活性,用于抗單純皰疹病毒HSV-1是以肌苷為起始原料合成腺苷,合成過程主要包括和HSV-2;本品的單磷酸酯(單磷酸阿糖腺苷)有抑酰化氯化和氨解3個步驟。?；饕菫榱吮Ｗo(hù)中國煤化工于治療肝癌;環(huán)腺核糖上的3個羥基,-般用肌苷與醋酐-冰醋酸進(jìn)行營酸YHCNMH包分化、癌變、逆轉(zhuǎn).乙酰化反應(yīng)"，制成三乙酰肌苷;然后在三氯甲烷等多種生理生化過程,具有重要的調(diào)節(jié)控制作用,是中用氯亞叉進(jìn)行三乙酰肌苷6-羥基的氯化,得到6-一種 效果明顯、毒副作用較小的非強(qiáng)心苷類藥物,現(xiàn)2004年10月6日施慶珊,等:腺苷的合成與應(yīng)用●15.市場價7萬元/kg;ATP(三磷酸腺苷)是生物體內(nèi)能物8-氯腺苷等,因此,它具有廣闊的市場和發(fā)展前量代謝的重要中間物質(zhì),它作為能量的載體可將分景。口解代謝所獲得的能量傳遞給合成代謝系統(tǒng),在生物參考文獻(xiàn)體內(nèi)的能量交換中,占有中心地位,臨床上可用于治[1] Hellmut B. Adenosine( P]." CE 650 874,1937療心臟病、腦動脈硬化及肌肉萎縮等癥,目前市場價[2]- John 0. Formation of adenosine by ellftee extacts of escherichiacoli[J]. Arch Biochem Biophys, 1954, 48: 483 ~ 484每噸100萬元左右,年需要量約為150t。[3)奧村.特許公報24278,1965腺苷原料目前國內(nèi)的市場價為60萬~70萬[4) s Konishi, K Kubota, R Aoki,et al. Amino Acid and Nucleic Acid元/t,采用糖質(zhì)原料直接發(fā)酵生產(chǎn)腺苷成本最低,如1968，18 (15)果發(fā)酵水平達(dá)到20g/L以上,提取總收率80%以(5].中山清(協(xié)和發(fā)醇).特許公報15115, 1976上,則生產(chǎn)成本可控制在10萬元/t以下。與日本旭( 6] Howard M, Laten. Production of adenosine by mutants derived fromyest[J]. Journal of Bacteriology，1986 , 168(3):763 ~ 768化成公司相比,國內(nèi)發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷起步較晚，目前[7] K Haneda, A Hirano, R Kodaina, et al. Accumulation of nucleie有2 ~3家研究單位進(jìn)行研究,技術(shù)尚未完全成熟,工acid-related substances by microorganisms part I. Production of a.業(yè)上還未采用,但本研究組目前已取得比較好的進(jìn)denosine by mutants derived from bacillus sp[J]. Amino Acid and展,相信不久就可用于工業(yè)生產(chǎn)中;采用化學(xué)合成生Nucleic Aeid, 1972 ,25 :106 ~ 112產(chǎn)腺苷的生產(chǎn)成本為35萬~40萬元/t左右,目前[8]邱玉棠,施慶珊,李崇,等.0Cor射線輻照選育肌苷高產(chǎn)菌株MI.-41的研究[]].核農(nóng)學(xué)報，1995 ,9(3);175 ~179.仍是國內(nèi)生產(chǎn)腺苷的主要方法,廣東肇慶、山東明水[9] Akira T. Preparation of nuclesides by the hydrolysis of 5' -nucle-等地的藥物就是采用肌苷為原料生產(chǎn)腺苷;RNA降tides (J]. Yakugaku Zssh,1965,85 (7) : 658 ~ 661解法曾經(jīng)是生產(chǎn)腺苷的主要方法,以前福建莆田廣[10]楊西寧,董春紅,榮桂榮.腺苷的合成新工藝研究[J].精細(xì)化東湛江?？诘鹊氐墓S曾用此法生產(chǎn)腺苷,但因為工,2001, 18 (6) :317 ~318RNA產(chǎn)量有限，成本太高,目前基本不采用此法。[11]周濤、三氮唑核苷合成工藝的改進(jìn)[J].中國藥物化學(xué)雜志，1996, 27.(2) : 133-135.國內(nèi)腺苷的年需要量為300t左右。腺苷本身是一種心血管藥物,又是其它核苷類([12]周樂,史遠(yuǎn)剛,王建辰.6.氣-B-D.呋喃 核糖嘌呤的合成[J].化學(xué)通報,1996 ,5:31 ~32藥物合成的前體,隨著腺苷下游研發(fā)工作的深入,一([13]R.J蘇哈道尼克著.核苷類抗菌索[M]_北京:科學(xué)出版社，些新的用途還在不斷開發(fā)出來,如治療惡性腫瘤藥1982,1 ~153(上接第6頁)要原材料對羥基苯乙酸的優(yōu)勢,又有工業(yè)化技術(shù)水4市場需求、前景預(yù)測及發(fā)展趨勢平高的優(yōu)勢,所以該產(chǎn)品有很強(qiáng)的市場競爭力,目前目前皮膚病外用藥品大部分都是甾體激素類藥產(chǎn)品供不應(yīng)求?，F(xiàn)在正積極開拓國外市場,特別是品，副反應(yīng)多,不宜長期使用;還有一部分銷準(zhǔn)字產(chǎn)西歐市場,相信該產(chǎn)品定會有好的發(fā)展前景。品,科技不成熟,療效不確切,市場不穩(wěn)定。目前該產(chǎn)品的市場參考價格在80萬~90萬丁苯羥酸主要用做非甾體抗炎藥,以丁苯羥酸元/t,是個高附加值的產(chǎn)品,很值得研究和推廣。0為原料藥,制成丁苯羥酸乳膏(國家新藥)已在湖南迪諾制藥和海南三葉制藥有限公司批準(zhǔn)生產(chǎn)。該品具有消炎鎮(zhèn)痛作用,外用可在局部組織達(dá)到較高濃[1] Xadhad Hoch. 1990,34(3). 212 ~214( Korea)度,而很少進(jìn)入體循環(huán)。適用于濕疹和神經(jīng)性皮炎、(2) Kokai Tokkyo Koho[P]. JP 81 118 004 ,1986接觸性皮炎等皮膚炎癥疾病。(3] Kokai Kokuy([P] JP 8062050 ,1980國內(nèi)外市場都需求該產(chǎn)品,國內(nèi)預(yù)計每年需求[4]徐燕.丁苯羥酸的合成[J].中國藥物工業(yè)雜志(信息版) ,1995,8:20丁苯羥酸1t左右,隨著該藥品的推廣, 需求量還會[S)李慶中國煤化工，廣東藥學(xué)院學(xué)報，上升,國外需求量較大。中昊宣化公司接到的訂單1999MYHCNMHG中,意大利曾超過10t,日本曾超過4t,印度、韓國超[6]科技查新報告201500030丁0苯羥酸新產(chǎn)品新工藝研究過2t。隨著中昊宣化開發(fā)該產(chǎn)品的成功,加上有主.[7]中華人民共和國衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)(試行)WS-249(X-214)-96