第25卷第4期大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報2003年12月Journal of Dalian Medical UniversityRNA干擾技術(shù)的應(yīng)用趙洪波,張嘉寧大連醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)教研室遼寧大連116027)摘要RNA干菰 RNA interference rnai是與靶基因序列同源的雙鏈RNA誘導(dǎo)的一種特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。目前RNAi的作用機(jī)制已經(jīng)基本明確并顯示了廣闊的應(yīng)用前景。RNAi技術(shù)作為新的基因阻斷技術(shù)已經(jīng)成功地應(yīng)用于人類基因組功能的研究同時提供了一條人類抗病毒治療的新技術(shù)。另外借助RNAi技術(shù)還有望在將來于基因水平對腫瘤進(jìn)行治療。關(guān)鍵詞 RNAi siRNA基因沉默中圖分類號Q522文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號】671-72952003)4-0293-031998年Fire與Mll將與內(nèi)源性mRNA序列平端的 SiRNA不具有RNAi的功能5。同源的雙鏈RNA( dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞時,發(fā)現(xiàn)dsRBernstein等率先成功地對參與第一步反應(yīng)的NA能高效地降解該mRNA從而導(dǎo)致該基因表達(dá)核酸內(nèi)切酶進(jìn)行了提取與分析,將之命名為的沉默池他們將此現(xiàn)象命名為RNA干擾現(xiàn)象1。Dc3研究發(fā)現(xiàn),icr是RNae家族中的一在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)RNAi廣泛存在于生物界中,員。它含有一個螺旋酶結(jié)構(gòu)域,一個PAz(prin如果蠅2擬南芥菜3及哺乳動物4]等。RNAi與wgonad- wille)結(jié)構(gòu)域兩個 RNaseⅢ催化真菌的共抑制 quelling)及植物中轉(zhuǎn)錄后基因沉默域及 dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域 dsRBD) Dicer通過PAZ(post- transcriptional gene silencing PTGs存在著結(jié)構(gòu)域與其他相關(guān)蛋白的PAZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成多非常相似的基因沉默機(jī)制。故推澗,RNAi是不同亞單元復(fù)合物特異性地將dRNA切割為21~23生物體普遍存在的從RNA水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方nt的siNA。需要注意的是編碼Dcer的 Dicer式代表了一種古老的生物途徑基因?qū)儆谶M(jìn)化保守基因。因此線蟲、果蠅、哺乳動物RNAi作用的機(jī)制等不同種屬生物的 Dicer結(jié)構(gòu)與功能均很相似這可能是RNA是生物體一種進(jìn)化保守機(jī)制的結(jié)構(gòu)基RNAi的作用過程分三個步驟(1羧長的dsR-礎(chǔ)。參與第三步反應(yīng)的酶,目前認(rèn)為,是一種與NA被RNA核酸內(nèi)切酶加工成21-23-nt的小干Dcer不同的核酸酶 RNase),至于這種核酸酶如何擾 RNA Small/ short interfering RNA SiRNA)(2)將靶mRNA特異性地降解機(jī)理仍有待于進(jìn)一步研SIRNA與核酸誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA- induced究。silencing complex riSC)合。(3)合物中的siRDicer除了參與RNAi外還能將70-nt左右NA中的原義鏈與對應(yīng)的同源mRNA交換原義鏈莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RNA切割為22-nt左右的片段。由解離出來mRNA定位在原來原義鏈位置進(jìn)而被于這些片段只能在特定的階段和時間內(nèi)表達(dá)故稱降解。 SIRNA是RNAi的中心環(huán)節(jié);它由兩條21之為小時序RNA( mall temporal RNA, SiRNA核苷酸(nt舶單鏈組成其中有19-nt形成雙鏈;stR中國煤化工-7。它們不編碼蛋白兩條鏈3′端各有2-nt的對稱性突出。這種對稱性質(zhì)CNMH的重要調(diào)節(jié)因子突出對于 SiRNA的功能是非常必要的。研究表明些sN八習(xí)siNA介導(dǎo)的基因沉收稿日期2003-04-14修回日期2003-05-20*作者簡介趙洪波1977-)女朝陽人碩士研究生*基金項(xiàng)目國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目序號396000110大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報第25卷默過程有潛在的聯(lián)系6。3RNAi技術(shù)在抗病毒治療上的應(yīng)用2RNAi技術(shù)在基因功能研究中的應(yīng)用目前已經(jīng)證實(shí)植物中的轉(zhuǎn)錄后基因沉默能夠RNAi能夠在多種生物中被用來滅活特異序列抵抗病毒感染Ⅲ。這可能是植物的一個本能的反的基因產(chǎn)生類似基因被剔除”的效應(yīng)。它與傳統(tǒng)應(yīng)是植物在長期進(jìn)化過程中為了保護(hù)自身基因組的基因剔除技術(shù)相比具有投入少、周期短、操作簡單完整性抵御外來核酸入侵一種防衛(wèi)保護(hù)機(jī)制。這等優(yōu)勢。RNAi技術(shù)已經(jīng)作為一種新型的反向遺傳種機(jī)制可能在其他生物中也存在。學(xué)技術(shù)成為基因功能研究的重要工具。在基因的SiRNA介導(dǎo)的RNAi能夠提高人體細(xì)胞與小鼠研究中首先利用此技術(shù)剔除待研究的目標(biāo)基因然細(xì)胞對病毒的免疫水平已經(jīng)由 Gitlin等證實(shí)12。后通過細(xì)胞表型改變的觀察、免疫蛋白印跡、免疫熒他們將人與小鼠的細(xì)胞事先用sRNA加以處理發(fā)光等方法即可對基因的表達(dá)及功能進(jìn)行分析。Har-現(xiàn)這些細(xì)胞能顯著抑制脊髓灰質(zhì)炎病毒的增殖,對borth等利用RNAi技術(shù)對21個在亞細(xì)胞水平定位病毒的清除能力也大大提高。當(dāng)然這種抗病毒作用和功能不同的基因進(jìn)行了研究η并根據(jù)特異性基也是序列特異性的。實(shí)驗(yàn)中他們發(fā)現(xiàn) SIRNA所靶因沉默后細(xì)胞生長情況將所研究的基因分為細(xì)胞向的mRNA特定的基因片段即使只有一個核酸的必須基因和細(xì)胞非必須基因。迄今為止,RNAi技改變也會導(dǎo)致RNA的失敗充分說明了這種抗病術(shù)在真菌、植物、線蟲、果蠅及哺乳動物的基因功能毒作用的序列特異性洏而不是其他抗病毒系統(tǒng)或干研究中發(fā)揮了重要的作用,利用此技術(shù)成功地對許擾素的作用。多哺乳動物的基因進(jìn)行了分柝6。Bike等利用RNAi技術(shù)對呼吸道合胞病毒最近在哺乳動物的研究中發(fā)現(xiàn)只有3′端對稱(RSⅴ璂因成功地進(jìn)行了抑制汯到了抑制病毒感突出2-nt的約21-nt的siNA才能對靶基因產(chǎn)染的目的13但他們也發(fā)現(xiàn)要完全扣制RSV病生特異的沉默效應(yīng)。當(dāng) SiRNA的長度大于30-nt毒基因的表達(dá)很難做到。他們推測RSV病毒基因時由于激發(fā)了dRNA依賴的蛋白激酶和干擾素系組上可能附著了某些蛋白成分,它與核酸形成較大統(tǒng)其基因沉默效應(yīng)是廣泛且非特異的。因此要對的復(fù)合物,使 SIRNA與mRNA難以很好的接近。某一序列基因進(jìn)行特異的基因沉默必須將21- nt Jacque等則開展了利用RNA對HV-1復(fù)制進(jìn)行左右的 SiRNA直接導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞中。它涉及調(diào)控方面的研究141利用 SiRNA來靶向HV-1基兩個關(guān)鍵的環(huán)節(jié):首先,如何合成 SiRNA。自從因可以引起HV-1復(fù)制過程的抑制從而抑制病RNAi發(fā)現(xiàn)以來人們便開始嘗試各種合成方法最毒的繁殖。這項(xiàng)研究開辟了治療艾滋病的新途徑。初多采用化學(xué)合成法但這種方法成本很高且操作雖然最近有許多關(guān)于RNAi成功抑制病毒感染復(fù)雜。目前已有研究組利用T7噬菌體聚合釀(T7的報道但要將RNAi最終應(yīng)用于人體抗病毒治療phage polymerase法成功進(jìn)行了siNA細(xì)胞內(nèi)合中似乎還有很長的一段路要走許多問題還有待于成8]利用T7噬菌體聚合酶分別合成 SiRNA的原深入的研究。首先植物實(shí)驗(yàn)中RNAi介導(dǎo)的抗病鏈和反義鏈兩段RNA在細(xì)胞內(nèi)退火連接成siR-毒反應(yīng)中,植物體內(nèi)的病毒會產(chǎn)生各種各樣的NA。這種方法較化學(xué)合成法更為經(jīng)濟(jì)簡便同時還RNAi抑制劑不同的抑制劑會作用于RNA不同的克服了RNA不穩(wěn)定易降解的弊端。 Miyagishi等環(huán)節(jié)最終都會導(dǎo)致RNAi介導(dǎo)的抗病毒作用的失建立的U6啟動子方法與此方法類似9其次如敗。哺乳動物體內(nèi)的病毒能否產(chǎn)生與植物體內(nèi)病毒何將 SiRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。目前應(yīng)用比較多的是類似的扣制劑這對RNAi的抗病毒治療的應(yīng)用致陽離子的脂類載體因其具有毒性小且不易與細(xì)胞關(guān)重要這一問題至今尚沒有較深入的報道。其次,發(fā)生融合的優(yōu)點(diǎn)但根據(jù)所應(yīng)用的細(xì)胞類型不同非目前對RNAi介導(dǎo)的抗病毒治療研究主要是在動物陽離子的脂類載體也是可取的。由于不同的載體有模型晉克注射到動物體內(nèi),它可不同的細(xì)胞特異性所以對于某一特定的細(xì)胞載體以在中國煤化富集的 SiRNA濃度不的選擇應(yīng)該是十分謹(jǐn)慎的。 McManus等利用電擊同CNMHG毒基因沉默效應(yīng)。但穿孔法將 SiRNA導(dǎo)入到細(xì)胞中101其優(yōu)點(diǎn)是導(dǎo)入要將此技術(shù)應(yīng)用于人體則必須找出一種高效且安率很高達(dá)到95%以上但細(xì)胞在導(dǎo)入過程的死亡全的 SiRNA的遞送方法使 SiRNA只能對病毒的靶率高達(dá)50%。盡管各個研究組所采用的合成導(dǎo)入基因進(jìn)行基因沉默發(fā)揮高效的抗病毒作用而不對方法各異但均取得了明顯的基因沉默效應(yīng)。人體正常的基因或組織造成損害。隨著研究的深第4期趙洪波等RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用入相信終有一天這項(xiàng)技術(shù)會被應(yīng)用于人類抗病毒[3] Wassenegger M, Pelissier T. A model for RNA- mediated的治療。gene silencing in higher plant[ J ] Plant Mol Biol, 199837349-3624RNAi技術(shù)在腫瘤基因治療方面的研究進(jìn)展4 ]Sayda ME Jens h winfried L et al Duplexes of 21-nuide rnas mediate rna interference in all cultured由于RNAi能夠在哺乳動物系統(tǒng)中被用來滅活mammalian celly J Nature 2001 A11 494-498特異序列的基因片段許多學(xué)者便考慮憑借此技術(shù)[5] Nykanen A, Haley b, Zaire pd. ATP requirements and在基因水平上對腫瘤進(jìn)行治療。但借助RNAi在基small interfering RNA structure in the RNA interference因水平上治療腫瘤并非只對單個癌基因進(jìn)行敲除就thway[ J]cll2001107309-32能達(dá)到。腫瘤是一種多基因遺傳病是多個基因相[6 Michael T, McManus Phillip As Gene silencing in mammals by small interfering RNA J ] Nature Reviews Genet互作用形成的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)果單個癌基因的ics20023:737-747阻斷不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長而目前利[7] Harborth J, Elbashir SM, Bechert K,etal. Indentification用RNAi技術(shù)對于兩個或多個基因同時敲除的研究of essential genes in cultured mammalian cells using small仍需深入。 Elbashir等成功將Hela細(xì)胞(美國黑人erfering rna[ J]. Cell Sci 2001 114 4557-456編碼核有絲蛋白核纖蛋白的基因同[81 YuJY DeRuiter SI.umrD, RNA interference by ex時敲除15。 McManus等開展了對T細(xì)胞的CD4mammalian cell[ J ] Proc Natl Acad Sci USA, 200299和(D8同時敲除的實(shí)驗(yàn)10。他們發(fā)現(xiàn)同時對CD46047-6052和CD8敲除實(shí)際意義不大因?yàn)橛脕砬贸鼵m4的[9] Miyagishi M, Taira K.U6 promoter- driven siRNA withiNA會與用來敲除CD8的 SiRNA產(chǎn)生競爭性抑four uridine 3 overhangs efficiently surpress targeted gene制。盡管如此RNAi技術(shù)還是為胂瘤的基因治療expression in mammalian cell[ J ] Nat Biotech 2002, 19提供了一條新的思路。[10 ]McManus MT Haines BB Chen J, et al. siRNA- mediat5結(jié)語ncing in T-cells. J Immunol in the press11 ]David B RNA silencing "Diced defence J Nature .2001RNA干擾技術(shù)作為一種新的基因阻斷技術(shù)方409295-298興未艾已經(jīng)成為人類基因功能研究的得力工具同[12 I Gitlin L, Karelsky. Andino R. Short interfering RNA時它的應(yīng)用也為人類早日攻克病毒感染性疾病以及confers intracellular antiviral immunity in hu[J] Nature2002A18:30-434腫瘤等提供了新的技術(shù)手段。相信隨著相關(guān)技術(shù)的[13 J Bitko V, Barik S, Phenotypic silencing of cytoplasmic成熟,它必能為人類疾病的治療作出貢獻(xiàn)。genes using sequence-specific double- stranded short參考文獻(xiàn)interfering RNA and its application in the reverse genetcs of wild type negative- strand RNA viruses[ JI ]Fire A, Xu S, Montgmery MK, et al. Potent and specifiBMC Microbiol 2001 1 34-37genetic interference by double- stranded RNA in 14 Jacque JM, Triques K Stevenson M. Modulation of HIVCaenorhabditis elegan[ J ] Nature 1998 806-811I replication by RNA inference[ J ]. Nature 2002[2 Berstein E, Caudy A, Hammond SM, et al. Role for a418435-438bidentate ribonuclease in the initiation step of RNa inter-15 ]Elbashir SM Harborth J Weber K ,et al. Analysis of geneference J ] Nature 2001 409 363-366function in somatic mammalian cells using small interfer-RNAs[J] Methods 2(Application of RNa interference technologyZHAO Hong-bo, ZHANG Jia-ningDepartment of Biochemistry Dalian Medical University Dalian 116027, ChinaAbstract: In 1998, Fire and Mello described a new technology they called RNA interference RNAi ). RNAi is anew technology that is based on the silencing of specific genes中國煤化工 dSRNA) Now investigaters are not only using RNai to elucidate gene function in mCNMHGdevelop antiviral therapeutics this review provides a general outlook on the application of rnaiKey words: RNAi sirNA gene silencing