2007年第10期河南省馬鈴薯Y病毒的分子檢測與鑒定吳興泉,陳士華,陳濤,薛 珍,婁玉華(河南省谷物資源轉化與利用重點實驗室,河南工業(yè)大學生物工程學院,河南鄭州450001)摘要:利用RT-PCR技術對鄭州市和信陽市的馬鈴薯Y病毒(potato virus Y, PVY )進行了鑒定。依據(jù)PVY p1基因序列設計合成1對引物，以帶毒的馬鈴薯葉片總RNA為模板,RT- PCR擴增得到0.58kb的目的DNA片段,而健康對照無此片段。對PCR產(chǎn)物進行序列測定,Blast分析表明,該DNA序列與PVY N:O株系pl基因序列相似性可達99%,證明所得DNA片段確為PVY pI基因,從而建立了PVY的RT-PCR檢測方法。在此基礎上,從節(jié)省檢測時間、優(yōu)化反應程序及反應體系等方面進行了改進。關鍵詞:河南省;馬鈴薯Y病毒; RT- PCR;檢測與鑒定中圖分類號: S435. 32文獻標識碼: A文章編號:1004 - 3268(2007)10- 0064 - 03The Molecular Detection and Indentification ofPotato. Virus Y in Henan ProvinceWU Xing- quan, CHEN Shi-hua, CHEN Tao, XUE Zhen, LOU Yu-hua(The Key Laboratory of Grain Transformation and Utilization of Henan Province,College ofBioengineering,Henan University of Technology , Zhengzhou 450001 ,China)Abstract:Potato virus Y (PVY) can infect potato and do harm to potato seriously. The PVY inZhengzhou city and Xinyang city of Henan province was detected and identified by RT- PCR mo-lecular detection technology. The spencific primers PVYP1 and PVYP2 were designed based onpVY p1 gene, which amplified a DNA fragment of 0.58kb by RT- PCR using the RNA from theinfected plant by PVY as template. However, no DNA fragment was amplified from RNA ofhealthy potato. The PCR product was sequenced. The results of Blast analysis showed that thesimilarity of the sequence with the pl gene of PVY strain N:O reached to 99%, indicating thatthe PCR product is the partial DNA fragment of PVY pI gene. Then the RT - - PCR detectionmethod of PVY was established. The detection method was improved by shortening the reactiontime ,and optimizing the PCR procedures and PCR reagent system.Key words: Henan province; Potato virus Y; RT- RCR; Detection and indentification我國是馬鈴薯生產(chǎn)大國,馬鈴薯種植面積和總從北部發(fā)病輕的地區(qū)調(diào)種。建立快速、準確的馬鈴產(chǎn)量都位居世界第一,河南省馬鈴薯種植面積也在薯病毒檢測技術是保證種薯安全調(diào)運和種薯成功脫不斷增加。但單產(chǎn)比世界平均單產(chǎn)低,單產(chǎn)水平與毒的關鍵,對馬鈴薯的有效防治具有重要的現(xiàn)實發(fā)達國家相比差距更大。馬鈴薯病毒病是馬鈴薯意義4。單產(chǎn)低的重要原因之- -.馬鈴薯Y病毒(potato vi-河南省屬于中原二季作區(qū),馬鈴薯病毒侵害比rus Y, PVY)是馬鈴薯上非常重要的一種病害[2]，我國西部和北部地區(qū)嚴重,而關于河南省馬鈴薯病可導致馬鈴薯退化，降低產(chǎn)量,嚴重時減產(chǎn)可達毒的危害情況尚未見全面的分析報道[5。為明確河80%以上問。在我國由北向南馬鈴薯帶毒率逐漸增南省馬鈴薯Y病毒的發(fā)生情況,建立馬鈴薯病毒的高，造成我國中部和南部地區(qū)不能自行留種,必須快速、準確、靈敏、特異的分子檢測與鑒定技術,開展中國煤化工MHCNMHG收稿日期:2007-07 -24基金項目:河南省教育廳自然科學基金項目(2006210003);河南工業(yè)大學校基金項目作者簡介:吳興泉(1970-),男,黑龍江克山人,副教授,博士,主要從事分子生物學與植物病理學研究。●64●河南農(nóng)業(yè)科學了本項研究。PCR反應程序為:94C預變性10min,然后94 C變性1 min,37 C退火1min,72 C延伸1 min,1材料和方法共進行30個循環(huán),然后72C延伸10 min.1.1 試劑1.3.2.4 PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測取植物總RNA提取試劑盒(TianGen),5X M-PCR產(chǎn)物2. 5μL,6 X Loading Buffer ( TaKaRa)MuLV反轉錄酶緩沖溶液(Promega),dNTPs1μL,瓊脂糖凝膠[1(凝膠濃度1.0%,TAE緩沖體(TianGen), RNasin inhibitor ( Promega), M-系),進行電泳分離,EB染色后,在長波紫外光下MuLV反轉錄酶(Promega), 10 X Taq Reaction Bio- RAD凝膠成像儀采像。buffer( TianGen), M - MLV RT5 X Buffer(Pro- 1.3.2.5 序列測定與分析對所獲得的 PCR產(chǎn)物mega) ,Taq DNA Polymerase(TianGen) ,6X Load-直接送至北京三博遠志生物工程有限公司進行ing Buffer(TaKaRa), D2000Marker( TianGen),引DNA序列測定。DNA序列采用Blast和Clustal X物是由大連寶生物有限公司合成,DNA膠回收試劑進行分析。.盒(大連寶生物有限公司)。2結果與分析1.2 馬鈐薯病毒樣本的采集2007年5月1日和5月6日分別依據(jù)馬鈴薯2.1馬鈴薯病毒樣本的采集結果植株發(fā)病癥狀在鄭州市古滎鎮(zhèn)和信陽市平橋區(qū)采集在鄭州市古滎鎮(zhèn)和信陽市平橋區(qū)馬鈴薯產(chǎn)地采.馬鈴薯病毒樣本。集PVY樣本,發(fā)現(xiàn)馬鈴薯田間病毒病主要有:矮化、1.3 PVY RT- :PCR 檢測方法的建立束頂、卷葉.花葉4種癥狀。采集具有明顯馬鈴薯病1.3.1植物總RNA的提取使用植物總 RNA提毒病癥狀馬鈴薯葉片帶回實驗室進行分子鑒定。取試劑盒提取帶病馬鈴薯和健康馬鈴薯葉片總2.2 PVY RT- PCR檢測技術的建立RNA,具體方法依照說明進行。RNA溶液保存在首先對鄭州市帶病馬鈴薯樣本進行了檢測，以.- 20C冰箱中備用。健康馬鈴薯樣本為對照。采用RT- PCR法擴增1.3.2 RT- PCR擴增p1基因片段PVYp1基因中581bp長的cDNA片段(圖1)。從1.3.2.1引物的設計與合成從Gen Bank中獲圖1可以看出,RT- PCR擴增產(chǎn)物與預期大小一得PVY p1基因全序列,利用Clustal軟件分析明確致,而健康對照無此擴增產(chǎn)物。利用上述方法對信其主要保守性區(qū),設計引物序列為:上游引物PV-陽市 馬鈴薯病毒樣本進行檢測，也得到相同結果。YP5:5'- CGATACAAGACTGATGTCC-3'(與證明利用引物PVYP5,PVYP3采用RT- PCR技p1基因的第397bp至426bp間序列同源),下游引術可實現(xiàn)PVY的準確鑒定。物PVYP3序列為: 5'一TTCATGCGATCCACG-CACT- -3 (與pI基因第959bp至978bp間序列互2000bp .補)。引物的合成在寶賽生物科技有限公司。1.3.2.2反轉錄[6] 取一 Eppendorf管,加人馬鈴00p0薯總RNA 5μL,引物PVYP3 1 pL, ddH2O 4pL,750bp95C下變性10min,立即取出置于冰上放置5 min.500bp再依次加人:5X M- MuLV反轉錄酶緩沖液5μL,40 mmol/L dNTPs(每種10 mmol/L)1 μL, RNasin250bp(40U/uL)1μL,M一MuLV反轉錄酶(20U/pL)100bp1μL,加人DEPC處理過的ddH2O 7μL.將反應混合物于37 C水浴1h,95C滅活5min,- 20C保存1.帶病馬鈴薯; 2.健康馬鈴薯; 3. DL2000 Marker備用。中國煤化工Y病毒1.3.2.3聚合酶鏈式反應[0] 采用 25μL反應體2.MHCNMHG定與分析系進行,反應混合物包括cDNA 2. 5p兒L,引物各則龍刃吊樸信陽巾與管署件本中RT- PCR 擴2.5μL, dNTP 1. 0pL, 10X buffer 2. 5μL (含增產(chǎn) 物直接進行序列測定,PVY鄭州分離物p1基MpCl), Taq酶0. 5μL, ddH20 13. 5μL。因片段序列如下:，65●2007年第10期GCGAGGAAGAGAAGAGAGGAATATAATTTCCAAATGGCTGCGTCAAGTGTTGTGTCGAAGATCACTATTGCTGGTGGAGAGCCACCTTCAAAACTTGAATCACAAGTGCGGAGGGGTGTCATCCACACAACTCCAAGGATGCGCACAGCAAAAACATATCACACGCCAAAGTTGACAGAGGGACAAATGAACCACCTTATCAAGCAGGTGAAGCAAATTATGTCAACCAAAGGAGGGTCTGTTCAACTGATTAGCAAGAAAAGTACTCATGTTCACTATAAAGAAGTTTTGGGATCACATCGCGCAGTTGTTTGCACTGCACATATGAGAGGTTTACGAAAGAGAGTGGACTTTCGGTGTGACAAATGGACCGTTGTGCGTCTACAGCATCTCGCCAGGACGGACAAGTGGACTAACCAAGTTCGTGCTACTGATCTACGCAAGGGCGATAGTGGAGTTATATTGAGTAATACTAATCTCAAAGGAAACTTTGGGAGAAGCTCAGAGGGCCTATTCATAGTGCGTGAPVY信陽分離物pI基因片段序列如下:CGCGAGGAAGAGAAGAGAGGAATATAATTTCCAAATGGCTGCGCCAAGTGTTGTGTCGAAGATCACTATTGCTGGTGGAGAGCCACCTTCAAAACTTGAATCACAAGTGCGGAGGGGTGTCATCCACACAACTCCAAGGATGCGCACAGCAAAAACCTATCACACGCCAAAGTTGACAGAGGGACAAATGAACCACCTTACCAAGCAGGTGAAGCAAATTATGTCAACCAAAGGAGGGTCTGTTCAACTGATTAGCAAGAAAAGCACCTATGTTCACTATAAAGAAGTTTTGGGATCACATCGCGCAGTCGTTTGCACTGCACATATGAGAGGTTTACGAAAGAGAGTGGACTTTCGGTGTGATAAATGGACCGTTGTGCGTCTACAGCATCTCGCCAGGACTGACAAGTGGACCAACCAAGTTCGTGCTACTGATCTACGCAAGGGCGATAGTGGAGTTATATTGAGTAATACTAATCTCAAAGGAAACTTTGGGAGAAGCTCGGAGGGCTTATTCATAGTGCGGG利用Blast分析軟件分析,結果表明:PVY鄭州技術可實現(xiàn)PVY的準確鑒定。分離物和信陽分離物的pI基因序列與PVY N:O2)河南省馬鈴薯種植區(qū)中鄭州市馬鈴薯的株系的序列相似性均可達到99%,說明所得DNA PVY 帶毒率高,信陽市馬鈴薯帶毒率低。片段確為PVY p1基因。利用此對引物對帶毒樣本3)河南省馬鈴薯所感染的PVY與PVY N:O可擴增得到0.58kb的PVY pI基因片段,而健康馬的基因序列相似性 極高,說明該病毒應為PVY N鈴薯樣本無此片段出現(xiàn),因此,可用于PVY的準確株系[”。檢測與鑒定。4)采用優(yōu)化的PCR反應方案可實現(xiàn)PVY的2.4 PCR 檢測方法的改進與應用快速、準確檢測,且成本低廉。為縮短PVY RT- PCR檢測技術所需時間及參考文獻:試劑的用量,對反應程序進行了修改。具體如下:首[1] 魏延安.世界馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及特點[J].世界農(nóng)先,將反應循環(huán)中的變性時間和退火時間縮短為業(yè)，2005(3) ,29-32.30s,并將循環(huán)次數(shù)減為25次。其次,將反應循環(huán)[2]謝聯(lián)輝,林奇英,吳祖建. 植物病毒名稱及其歸屬[M].中的退火由37 C提高到47 C,再將PCR反應試劑北京:中國農(nóng)業(yè)出版社, 1999:137-142.中除cDNA外的其他試劑按比例預混進行PCR擴[3] Hooker WJ.馬鈴薯病害及其防治[M].石家莊:河北增試驗時,按cDNA:混合試劑=1+9混合取樣進科學技術出版社，1992:129- 131.行,總反應體積由通常的25pμL降至10μL.上述改[4] 吳興泉,陳士華,吳祖建,等. 分子生物學技術在馬鈴薯病毒檢測中的應用[J].中國馬鈴薯, 2003(3) :175-進均可達到良好的PVY檢測效果。此改進措施可節(jié)省PCR反應時間40 min,得到了更高的檢測特異[5] 高凱,趙愛菊 ,劉忠玲,等.洛陽市馬鈴薯二季作區(qū)病毒性,試劑用量更少,成本更低。侵襲狀況調(diào)查[J].河南農(nóng)業(yè)科學,2002(9);33-34.利用此方法對來自河南省鄭州市和信陽市的馬[6]吳興泉. 福建馬鈴薯病毒的分子鑒定與檢測技術[D].福州:福建農(nóng)林大學,2002. .鈴薯樣本進行了檢測,結果表明,鄭州市馬鈴薯樣本[7] Weilguny H, Singh R P. Separtion of Slovenian iso-帶毒較高,發(fā)病率可達20%以上，信陽市馬鈴薯樣lates of PVY (NTN) from the North American iso-本帶毒率較低,在田間僅有零星發(fā)生。分析其原因lates of PVY(N)by a 3-primer PCR[J]. J Virol Meth-ds,1998,71(1):57- 68.可能是因為信陽市的馬鈴薯種薯是從黑龍江省引進的,其種薯帶毒非常低導致田間發(fā)病率也較低。中國煤化工3結論MHCNMHG1)利用引物PVYP5,PVYP3通過RT- PCR●66●