第27卷第4期南京林業(yè)大學學報(自然科學版Vo.27,No.42003 A Journal of Nanjing Forestry University( Natural Sciences Edition) Jul, 2003海藻酸錳固定化細胞的乙醇發(fā)酵宋向陽,徐勇,楊富國,勇強',余世袁(1.南京林業(yè)大學,江蘇南京210037;2.中甯大學,湖南長汐410083)攏要:以樹干畢亦酵母( Pichia stipitis為發(fā)酵茵株,利用海藻酸錳凝膠代替海藻酸鈣,固定化酵母使用壽命明顯増加。采用混合糖60g/L.(50%菊茍?zhí)恰?0%木糖)為發(fā)酵底物,以250mL三角瓶為反應器,在35℃、150r/min、pH5.0條件下,派蕩發(fā)酵。結果表明,海藻酸錳樹干畢赤固定化增殖醐母細胞能使戊糖和己糖同步發(fā)酵,海藻酸錳凝膠耐磷酸鹽能力是海藻酸鈣凝膠的3倍,海藻酸錳圊定化樹干畢赤酵母細胞乙醇發(fā)酵42d,固定化細胞穩(wěn)定,總糖利用牽為95.8%,乙醇得率為貍論得率的.3%,發(fā)酵穩(wěn)定時間明顯長于海藻酸鈣固定化酵母細胞乙醇發(fā)酵的穩(wěn)定時間(24d),關鍵詞:樹干畢赤酵母;海藻酸錳;固定化細胞;戊糖;乙醇中圖分類號:Q53文獻標識碼:A文章編號:1000-2006(2003)04--0001-04Fermentation of Ethanol by Immobilized Cells of Manganese AlginateSONG Xiang-yang, XU Yong, YANG Fu-guo',YONG Qiang, YU Shi-yuan(1. Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China; 2. Central SouthUniversity, Changsha 410083, ChinaAbstract: The life time of immobilized Pichia stipitis yeast cells was prolonged greatly when the gelwas forned with manganese alginate compared to that with calcium alginate. The ability of enduringphosphate of manganese alginate gel was inereased 3 times than that of calcium alginate gel. Fermentation of glucose-xylose mixture to ethanol was investigated in 250 mL shake-flask at 35C, pH 5.0 and150 r/min. Glucose-xylose mixture could be co-fermented to ethanol by immobilized Pichia stipitiyeast cells of nanganese alginate The results showed that immobilized cells of manganese alginate gewere still definite when fermentation of ethanol lasted 42 d, and utilization ratio of total sugar was95. 8%c, yield of ethanol rcached 92. 3% of theoretical, While fermentation of ethanol by immobilizedPichia stipitis yeast cells of aluminum alginate only lasted 24 d. It provided the basis of theory for producing ethanol with immobilized cells in industry.Key words: Pichia sti pitis Manganese alginate; Immobilized cells; Xylose; Ethanol固定化細胞技術根據(jù)固定化方法大致分為吸附法、包埋法、共價法和交聯(lián)法,其中以包埋法應用最為普遍。載體是固定化細胞技術的核心部分。包埋法中的載體有多種,如聚丙烯酰胺凝膠、海藻酸鈣、角叉菜聚糖、瓊脂糖、明膠等。目前固定化細胞技術已成為國際上研究的熱點之一2-,廣泛應用于工業(yè)、醫(yī)學、環(huán)境保護、能源開發(fā)及化學分析等諸多領域海藻酸鈣是迄今應用最為廣泛的一種固定化載體。它具有網(wǎng)格孔隙大、傳質阻力小、制備方法簡單及價格低廉等優(yōu)點。但其強度較差,使用壽命短。這主要是由于培養(yǎng)基中的磷酸鹽逐漸使海藻酸鈣凝收筷日期:2002-04-25修回日期:2003-0103中國煤化工基金項目:國家自然科學基金資助項目(39970597)作者簡介:宋向陽(1965—),男,江蘇無錫人,南京林業(yè)大學化學工程學CNMHG南京林業(yè)大學學報(自然科學版)第27卷第4期膠破裂和解休。延長海藻酸鈣凝膠使用壽命的處理方法較多。筆者利用Mn3對Ca2-置換法,將低濃度的樹干畢赤酵母( Pichia sti pitis)細胞固定,通過增殖培養(yǎng),能高效地同步發(fā)酵戊糖和已糖,形成的海藻酸錳圊定化酵母細胞耐磷酸鹽能力顯著増強,其使用壽命顯著增加。為固定化細胞乙醇發(fā)酵的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。材料與方法1.1菌種和培養(yǎng)基菌種為樹干畢赤酵坶( Pichia stipitis),由南京林業(yè)大學生物化工研究所保藏,該菌種能夠同步發(fā)酵戊糖和己糖。酵母細胞培養(yǎng)基為木糖20.0g/L,蛋白胨5.0g/l.,酵母汁3.0g/L,培養(yǎng)基pH5.0;固定化增殖培養(yǎng)基為葡萄糖30.0g/L,木糖30.0g/L,蛋白胨3.0g/L,酵母汁2.5g/L,CaCl2.5g/L,MgS(25g/,KH2PO2.5g/I,培養(yǎng)基pH5.0;發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖30.0g/L,木糖30.0g/L,CaCl22.5g/L,MgSO30.25g/L,KH2PO42.5g/I,培養(yǎng)基pH51.2固定化細胞的制備與增殖將試管斜面菌種接入液體酵母細胞培養(yǎng)基,在30℃、150r/min條件下活化2d,取2mL菌液與3%海藻酸鈉溶液(68mL)于常溫下混合,注人2%CaCl2水溶液中,固化4bh,用無菌水將固化后的海藻酸鈣凝膠球(直徑2~3mm)洗3次(每次50mL),移入1.2%MnSO4溶液中,放置冰箱(4℃)固化24b。將固定化好的凝膠球〔直經(jīng)約3mm)置于增殖培養(yǎng)基中,在30℃、150r/min條件下增殖培養(yǎng)12h更換一次新鮮培養(yǎng)液,共增殖4次L.3乙醇發(fā)酵將固定化凝膠球川無菌水洗3次后,移人發(fā)酵培養(yǎng)基中。發(fā)酵容器為250mL三角瓶,發(fā)酵液體積與凝膠球的堆積體積之比為3:2,其中發(fā)酵液體積為50m1,總體積為80mL。將三角瓶置于恒溫振蕩器中,在35℃、150r/min條件下進行乙醇發(fā)酵。利用固定化細胞重復式發(fā)酵,每一批發(fā)酵結束后,收集發(fā)酵液,接入新鮮發(fā)酵液。1.4分析測定當一批發(fā)酵結束后,傾去發(fā)酵液,稱取三角瓶與固定化細胞質量,減去空三角瓶質量,即為固定化細胞凝膠顆粒濕重。利用髙效液相色譜法測定乙醇含量。釆用3,5-二硝基水楊酸(D丶`S)法測定還原糖2結果與分析2.1固定化凝膠顆粒耐磷酸鹽能力海藻酸鈣是∽種應用較為廣泛的固定化載體,但其強度較差,使用壽命短。在制備海藻酸鈣凝膠顆粒過程中添加活性炭、Al2O3、SO2、MnCl2等,盡管表1固定化細胞凝膠顆粒耐磷酸鹽能力可不同程度地增加海藻酸鈣的機械強度及穩(wěn)定性, Table 1 Test of enduring phosphate of gel bends但由于發(fā)酵培養(yǎng)基中的磷酸鹽逐漸使海藻酸鈣凝膠on cells immobilization顆粒破裂和解體,所以海藻酸鈣凝膠使用壽命提高實驗添加物添加物質凝膠顆粒溶凝膠顆粒破量分數(shù)%解時間/min裂時間/min并不明顯。試驗通過Mn2對Ca2-置換法,形成的1A2O3(A)藻酸錳固定化酵母細胞耐磷酸鹽能力明顯增強。2A!O(B試驗過程為:分別稱取1g固定化凝膠顆粒,溶于MnCl4A)50m濃度為0.1mol/l的磷酸鹽中性緩沖液中4 MoCk(B5 Sick(A240于35℃條件下,間歇振蕩,確定固定化凝膠顆粒開65)(B)裂及溶解的時間,以測試凝膠顆粒耐磷酸鹽能力,7活性炭(A結果見表18活性炭(B)9空H從表1可見,海藻酸鈣凝膠顆粒中添加劑不同,10中國煤化工其耐磷酸鹽能力也不同。添加活性炭的固定化凝膠顆粒耐磷酸鹽能力沒有明顯提高,由于活性炭表面YHCNMHG如物在滅后加人203年總第106期末向陽等:海藻酸錳固定化細胞的乙醇發(fā)解積比較大且具有多孔性添加到海藻酸鈣凝膠顆粒屮,增加了固定化細胞的通透性,但其耐磷酸鹽能力提高不多,開裂時間為30min,比空白(不添加物的)多10min,溶解時間均為120min。添加SO2比Al2O)3效果要好,耐磷酸鹽能力提高2倍,這是由于SO2為原子型晶體強度較高,添加至凝膠顆粒中可增加其強度。而采用詈換法形成海藻酸錳、海藻酸鋁的固定化細胞耐磷酸鹽能力增強顯著,因為Mn3、A}把Cn-從海藻酸鈣凝膠顆粒屮置換出來,磷酸鹽對海藻酸錳、海藻酸鋁的凝膠顆粒破壞性減少,故海藻酸錳、海藻酸鋁的圊定化細胞耐磷酸鹽能力提高3倍。2.2MnSO4溶液濃度對固定化細胞乙醇發(fā)酵的影響配置0.4,0.6%,0.8%,1.0%,1,2%,1.4%,1.6%的MnSO溶液,利用Mn2對Ca2+置換法,分別制備成海藻酸錳固定化酵母細胞。通過增殖培粟養(yǎng),使凝膠株表面的樹干畢赤酵母細胞密集,形成高濃度的固定化酵母細胞,高效地利用戊糖、己糖同步發(fā)酵成乙醇。MnSO4溶液濃度對固定化細胞乙醇0.40.60.81.01.21.41.6發(fā)酵糖利用率的影響見圖1。hs04溶液質量分數(shù)%由圖1可見,MnSO溶液濃度對固定化酵母細圖1MsO溶液質量分數(shù)對固定化細胞乙醇胞乙醇發(fā)酵的影響較大。當MnSO4溶液質量分數(shù)為發(fā)酵糖利用率的影響0.4%~1.2%時,隨著Mn2濃度的增加,還原糖利Fig.1 Effects of concentration of MpSO, solution用率逐漸升高。如MnSO4溶液質量分數(shù)為0.4%,lization ratio of sugar of ethanol fermentation0.6%,0.8%,1.0%時,還原糖利用率分別為by cells immobilization91.7%,92.8%,93.6%,94.6%,當MnSO4溶液質量分數(shù)為1.2%時,還原糖利用率達最大值95.8%。而當MnSO4溶液質量分數(shù)超過1.2%時,隨著Mn2+濃度的增加,還原糖利用率反而下降。即MnSO4溶液質量分數(shù)1.2%為轉折點。這是因為Mn2濃度對海藻酸鈣的置換影響較大。當MnSO4溶液質量分數(shù)為0.4%,由于Mn2+濃度低,海藻酸根螯合及置換出海藻酸鈣中的Ca2-形成的海藻酸錳凝膠的作用較弱凝膠株強度差,穩(wěn)定性低。顯微鏡下觀察,醪液中溢出的游離細胞較多,還原糖利用率為91.7%;當MnSO溶液質量分數(shù)超過1.2%時,雖然凝膠株的機械強度有所提高,醪液中游離細胞減少,但是凝膠株彈性變小,且凝膠株介質表面過于稠密降低了底物及營養(yǎng)鹽通過酵母細胞的傳質能力,故還原糖利用率下降。結果表明,當MnSO溶液質量分數(shù)為1.2%時,形成的海藻酸錳固定化酵母進行乙醇發(fā)酵最佳2.3發(fā)酵液pH對固定化細胞乙醇發(fā)酵的影響將海藻酸錳固定化增殖酵母凝膠顆粒各30mL表2發(fā)酵液pH對海藻酸錳固定化細胞分別放入體積為50m不同pH混合糖(混合糖濃乙醇發(fā)酵24h的影響度為60g/L,木糖和葡萄糖各占50%)的發(fā)酵液中, Table 2 Effects of pH value of the broth on ethanol在35℃、150r/min條件下,發(fā)酵24h,結果見表2。fermentation for lasting 24 h by cells從表2可見,發(fā)酵液pH在3.0~6.0范圍內(nèi)immobilization of manganese alginate發(fā)酵液殘?zhí)沁€原糖利固定化酵母乙酵得率比發(fā)酵液pH越低,越不利于海藻酸錳固定化酵母細pH濃度/g·1.用率%細胞濕重/R理論得率胞的生長和繁殖。當發(fā)酵液pH3.5時,殘?zhí)菨舛?028.5452.442.3高達16.72g/L,乙醇得率為理論得率的32.1%。3.516.727218.5顯微鏡下觀察酵母細胞,部分形態(tài)已不圓滑,單細胞03.9393.50.8960.918較多,芽孢少,即酵母細胞長時間在pH3.5以下發(fā).52.5395,80.923生變形,其生物功能降低或喪失,糖代謝能力下降,6.0己醇得率顯著降低。當發(fā)酵液pH為4.0時,酵母細胞形態(tài)圓滑,糖利用率高,殘?zhí)莾H3.93g/L,乙醇得率為理論得率的896%。發(fā)酵液pH5.5時,乙醇得率為理論得率的92.3%。發(fā)酵液pH大于5.5時乙脾得率雖有提高,但工業(yè)生產(chǎn)時高pH發(fā)酵液易染菌。H中國煤化工*藻酸錳固定化細胞乙醇發(fā)酵較適宜,此結果與海藻酸鈣固定化酵母乙醇發(fā)CNMHG南京林業(yè)大學學報(自然科學版)第27卷第4期2.4海藻酸鈣、海藻酸鋁及海藻酸錳的乙醇發(fā)酵利用海藻酸鈣、海藻酸鋁和海藻酸錳的固定化7增殖樹干畢赤酵母細胞,在35℃、150r/min條件下對濃度為60g/1混合糖(50%葡萄糖、50%木糖)分別進行發(fā)酵試驗(圖2)。結果表明,3種固定化增殖墼4樹干畢赤酵母細胞前24d乙醇發(fā)酵均較穩(wěn)定,但蛋卷立24d以后差異明顯發(fā)酵至36d,海藻酸鈣固定化細胞乙醇發(fā)酵中,122428364248殘?zhí)菨舛扔?.87g/I(24d)上升至3.53g/L-,其固醇周期/d定化細胞重量由59.4g下降至53.6g、減少5.8g;圖2海藻酸鈣、海藻酸鋁、海藻酸錳而海藻酸錳固定化細胞乙醇發(fā)酵穩(wěn)定,固定化酵母固定化細胞的乙醇發(fā)牌細胞流失少,僅減少2.6g。即海藻酸鈣、海藻酸鋁和i.2F: thanol fermentation of inmumolilizcd cells of calcium海藻酸錳的固定化酵母細胞乙醇發(fā)酵可分別穩(wěn)定發(fā)lginate, aluminum alginate and manganese alginate酵24、36及42d。這是因為發(fā)酵培養(yǎng)基中磷酸鹽逐■海藥酸鈣固定化細胞乙醇發(fā)酵殘?zhí)菨舛?◇漸使海藻酸鈣凝膠破裂,而海藻酸鋁、海藻酸錳的圊酸錳定化細胞乙醇發(fā)酵殘?zhí)菨舛?·海藻酸鋁同定化細胞耐磷酸鹽能力明顯強于海藻酸鈣固定化細化細胞乙牌發(fā)酵殘?zhí)菨舛?“▲-海灤酸鈣固定化胞凝膠顆粒重:-×一海藻酸鋁固定化細胞膠顆莉重胞。海藻酸錳圊定化酵母細胞乙醇發(fā)酵穩(wěn)定性長于-?！Ｂ渌嵴`因定化組胞凝膠顆粒重海藻酸鋁的固定化酵母細胞,因為海藻酸錳凝膠顆粒強度雖然略差于海藻酸鋁固定化細胞,但海藻酸錳凝膠顆粒富有彈性,細胞固定得牢固·凝膠顆粒不容易破碎。海藻酸鋁固定化細胞凝膠顆粒強度較大但凝膠顆秈比海藻酸錳固定化細胞凝膠顆粒脆性大,容易產(chǎn)生裂痕,最終導致細胞流失及凝膠顆粒自溶。所以,海藻酸錳固定化細胞乙醇發(fā)酵要比海濚酸鋁固定化細胞乙醇發(fā)酵穩(wěn)定時間長6d3結論(1)Mn3-對Ca置換形成的海藻酸錳固定化酵母細胞耐磷酸鹽能力明顯增強,而MnS(.溶液濃度對固定化酵母細胞乙醇發(fā)酵糖利用率的影響較大。以不同質量分數(shù)MnSO4溶液分別制成的海藻酸錳固定化細胞進行乙醇發(fā)酵,當MnSO.溶液質量分數(shù)為1.2%時,海藻酸錳圊定化酵母乙醇發(fā)酵的糖利用率最高,達95.8%(2)耐磷酸鹽能力試驗表明海藻酸鈉溶液中添加SiO效果較好,形成的海藻酸鈣固定化細胞耐磷酸鹽能力是不添加的2倍。而以置換法形成的定化酵母細胞要比以添加法形成的好,形成的海藻酸錳固定化酵母細胞耐磷酸鹽能力是不添加SiO2的3倍。〔3)采用置換法形成海藻酸錳固定化細胞,其發(fā)酵穩(wěn)定性由24d延長至42d,乙醇得率為理論得率的92.3%。[1張樹政酶制劑工業(yè):上[M].北京:科學技術出版社,998:350.[2j Lata A, Garria L. A Dhazm. Analysis and description of the evolution of alginate immobilized cells systems[J] Journal of liotechnola-8y2000,80:203-2153JMassirmilano F Federico F.Laura S, et al. Repeated-batch production of pigments by immobilized Monascus Purpureus.J.Journal ofiotechnology.2000,80:271-276.1 J Mahesh S K, Maria B, Christopher K S,et al. Ethanol production from glucose and xylose by immobilized Z ynzomonas nzohitis CPI[_. Applied Biotcchmistry and Biotechnology, 2000.84-86,525-5415]嚴復,曲立民,金夙燮,等.高聯(lián)海藻酸鈣固定化酵母的制備及其化學穩(wěn)定件的研究[].牛物工科學報,1985,11):81-816]田小光,海藻酸鋁固定化釅母生產(chǎn)高濃度酒精的研究[].微生物學通YH中國煤化工CNMHG李燕文)