第24卷第4期泉州師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué))VoL 24 No 42006 7 Journal of Quanzhou Normal University(Natural Science) JuL 2006巰基乙醇對(duì)黃粉蟲 NAGase活力的影響謝曉蘭,潘小芳,劉小強(qiáng)(泉州師范學(xué)院化生學(xué)院,福建泉州362000摘要:以黃粉蟲幼蟲為材料,采用0.05mo/LpH7.5 Tris-HC緩沖液抽提、硫酸銨分級(jí)分離提取N乙酰D氨基葡萄糖苷酶( NAGase,EC3.2.1.52),獲得比活力1025u/mg的酶制劑研究 NAGase催化 pNP-NAG水解反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù),測(cè)得米氏常數(shù)Kn=0.384mmol/L,探討巰基乙醇對(duì)該酶活力的影響結(jié)果表明巰基乙醇對(duì)該酶活力具有顯著的抑制作用,其抑制作用顯示可逆過(guò)程,研究殖基乙醇對(duì)該酶的抑制類型,顯示其抑制效應(yīng)為混合型,K1和KB分別為1.9%和9.6%關(guān)鍵詞:黃粉蟲;N·乙酰PD·氨基葡萄糖苷酶;巰基乙醇;抑制作用中圖分類號(hào):Q556.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1009-8224(2006)04-0101-05幾丁質(zhì)酶系是由內(nèi)切幾丁質(zhì)酶、外切幾丁質(zhì)酶和N乙酰D氨基葡萄糖苷酶( NAGase,EC32152)等3種不同組分組成的,它們協(xié)同作用將多聚殼聚糖分解產(chǎn)生N乙酰D氨基葡萄糖,該酶的降解產(chǎn)物在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、化工、農(nóng)業(yè)及環(huán)境科學(xué)等方面潛在的應(yīng)用價(jià)值已受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注N乙酰βD氨基葡萄糖苷酶廣泛存在于動(dòng)物植物微生物中,在抗菌防御,幾丁質(zhì)的消化吸收,昆蟲與甲殼動(dòng)物的蛻殼及孵化過(guò)程中起著重要的作用,1986年Koga等報(bào)道分別從家蠶表皮層和消化道中純化得 NAGase,并通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)分布在表皮層的酶與其蛻皮生長(zhǎng)、成蟲化蛹有關(guān),并受蛻皮激素調(diào)節(jié);而分布在內(nèi)臟的酶其主要功能是消化含幾丁質(zhì)的食物,與蛻皮生長(zhǎng)無(wú)關(guān)口,最近,黃小紅也報(bào)道了棉鈴蟲 NAGase的分離純化及酶學(xué)性質(zhì),黃粉蟲( Tenebrio molitor Linneeus)富含蛋白質(zhì)氨基酸、人體必需的不飽和脂肪酸、甲殼多糖等,是一種極具潛力和前途、經(jīng)濟(jì)的資源,被專家稱為是繼蜜蜂、家蠶之后第三大昆蟲產(chǎn)業(yè).但關(guān)于黃粉蟲 NAGase還未見報(bào)道本文以黃粉蟲幼蟲為研究材料,分離提取其 NAGase.以巰基乙醇為效應(yīng)物研究它對(duì) NAGase酶活力的影響.這將有助于了解黃粉蟲 NAGase三維空間結(jié)構(gòu)與酶活力關(guān)系;利用酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)原理研究巰基乙醇對(duì)酶的抑制類型及抑制常數(shù)的計(jì)算將有助于了解酶的催化機(jī)制及酶活力的調(diào)控,為酶的結(jié)構(gòu)與功能研究奠定基礎(chǔ),在酶學(xué)理論研究上具有重要的意義收稿日期:2006-04-25中國(guó)煤化工作者簡(jiǎn)介:謝曉蘭(1974-),女,福建惠安人,講師博士CNMH〔面的研究資助項(xiàng)目:福建省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(JA04260)102泉州師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué))2006年7月1材料與方法1.1材料黃粉蟲幼蟲購(gòu)自廈門花鳥市場(chǎng),實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)后取樣冷凍備用對(duì)硝基苯N乙酰BD氨基葡萄糖苷酶( PNP-NAG)為上海醫(yī)藥工業(yè)研究院產(chǎn)品;考馬斯亮藍(lán)試劑(G250)、結(jié)晶牛血清白蛋白分別是上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司進(jìn)口分裝、國(guó)產(chǎn)分裝;三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)等其他生化試劑均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);疏基乙醇及其它化學(xué)藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純;所用蒸餾水為單蒸水1.2方法1.21黃粉蟲 NAGase的提取以黃粉蟲幼蟲為提酶的材料,稱取定量的冷凍黃粉蟲幼蟲研磨成漿后按3:1(V/W的比例加入預(yù)冷的005mol/LpH=7.50 Tris-HCl緩沖液,置4C下抽提1h.4℃、15000rpm離心30min,虹吸中層清液,棄去沉淀與表層漂浮的油脂往所得清液中加入研細(xì)的固體硫酸銨粉末至30%的飽和度,4℃下鹽析4h,4℃、15000rpm離心30min,虹吸中層清液,棄去沉淀雜蛋白與表層漂浮的油脂緩慢追加研細(xì)的硫酸銨粉末至70%的飽和度,4℃下鹽析4h,4℃、15000rpm離心30min,棄上清液,收集沉淀.沉淀用少量0.05mol/LpH=7.50 Tris-HCl緩沖液溶解,并在4℃冰箱中對(duì)此緩沖液進(jìn)行透析,直到SO被檢測(cè)出為止,透析液于4C、15000rpm離心30min,收集得酶活力為246u/ml,比活力為1025u/mg的酶制劑1.2.2酶蛋白濃度的測(cè)定見文獻(xiàn)[5]方法,以結(jié)晶牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線,采用考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)合法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度1.2.3酶活力的測(cè)定酶活力的測(cè)定見文獻(xiàn)[6]體系含0.25mmol/L的底物,加入50l(酶蛋白濃度為240g/ml)粗酶液,準(zhǔn)確反應(yīng)后在721E型可見分光光度計(jì)上測(cè)定波長(zhǎng)為405nm的吸光度,以pNP為產(chǎn)物對(duì)照測(cè)得該條件下產(chǎn)物的消光系數(shù)為1.73L/( mol cm)酶活力單位定義為在上述條件下,每分鐘水解底物產(chǎn)生1mol/L產(chǎn)物的酶量1.2.4酶催化 PNP-NAG水解的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定采用以上酶活力測(cè)定的方法,改變底物濃度[S],測(cè)定酶促反應(yīng)的初速度v,以v對(duì)[S]作圖,為典型的米氏雙曲線關(guān)系,采用Lneweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖,以1/v對(duì)1/[S]作圖,從直線的截距求得該酶催化 PNP-NAG水解的米氏常數(shù)Kn和最大反應(yīng)速度Vn1.2.5巰基乙醇對(duì)酶活力作用的測(cè)定采用以上酶活力測(cè)定的方法,在測(cè)活體系中,加入不同濃度的巰基乙醇測(cè)定出酶的相對(duì)活力,分析它們對(duì)酶活力的影響1.2.6巰基乙醇對(duì)酶活力的抑制常數(shù)測(cè)定采以上酶活力測(cè)定的方法,固定底物濃度為0.25mmol/L,含不同濃度的巰基乙醇測(cè)活體系中,研究酶量與酶活力的關(guān)系,分析它們對(duì)酶的抑制機(jī)理;抑制類型的判斷是采用1.24方法,通過(guò) Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖,比較酶催化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù),包括表觀米氏常數(shù)(Kn)和最大反應(yīng)速度(Va)的變化2結(jié)果中國(guó)煤化工CNMHG2.1酶催化 PNP-NAG水解的動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定用1.2.4方法,測(cè)定黃粉蟲 NAGase粗酶制劑在pH5.2的緩沖體系下,催化 PNP-NAG第4期謝曉蘭等:巰基乙醇對(duì)黃粉蟲 NAGase活力的影響103水解的動(dòng)力學(xué)參數(shù).如圖1所示,酶促反應(yīng)初速度與底物濃度成典型雙曲線關(guān)系,說(shuō)明酶催化PNP-NAG水解反應(yīng)遵循米氏方程,以 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖,得到一條直線,由直線橫軸截距求得在pH5.2的測(cè)活體系下,酶水解 PNP-NAG的Kn值為0.384mmol/L,V為31.2mol/L/min0060.0Q0.20.40mmolL⊥,A_[s]/ mmol.·Lc/%圖1黃粉蟲 NAGase催化 pNP-NAG圖2巰基乙醇對(duì)黃粉蟲 NAGase活力的形響水解反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定2.2巰基乙醇對(duì)酶活力的影響以巰基乙醇為效應(yīng)物,在0.0~20.0%濃度范圍內(nèi)研究其對(duì)酶活力的影響,結(jié)果見圖2圖2表明巰基乙醇對(duì)該酶活力的影響呈近S型的下降趨勢(shì),剛開始,巰基乙醇對(duì)酶活力的抑制較輕微,隨著濃度的增髙,酶活力下降幅度增大,當(dāng)達(dá)到高濃度時(shí),酶活力下降趨于平穩(wěn).其致使酶活力下降一半所需的濃度(IC0)約為6.0%當(dāng)巰基乙醇的濃度為20.0%時(shí),它可以使酶活力下降95%左右.2.3巰基乙醇對(duì)酶的抑制失活作用以巰基乙醇為效應(yīng)物,在含0.25mmo/ L PNP-NAG和不同濃度巰基乙醇的測(cè)活體系中,改變酶量測(cè)定酶催化反應(yīng)的活力圖3表示酶的剩余活力與酶量的關(guān)系,結(jié)果表明:酶活力對(duì)酶量作圖得到一組通過(guò)原點(diǎn)的直線隨著巰基乙醇濃度的增高,直線的斜率降低.說(shuō)明在考察的濃度范圍內(nèi),巰基乙醇對(duì)酶的抑制失活作用是可逆過(guò)程,巰基乙醇通過(guò)抑制酶活力而導(dǎo)致催化效率的降低,而不是通過(guò)降低有效的酶量導(dǎo)致活力的下降2.4巰基乙醇對(duì)酶的抑制失活作用類型及抑制常數(shù)的測(cè)定在測(cè)活體系中,固定加入的酶量,改變底物濃度,測(cè)定不同濃度巰基乙醇對(duì)酶活力的影響,以 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖,判斷巰基乙醇的抑制類型,結(jié)果見圖4.由圖4可知,雙倒數(shù)作圖得到一組相交于第二象限的直線,說(shuō)明巰基乙醇對(duì)酶的Km值和Vn均產(chǎn)生影響,V值隨著巰基乙胖濃度的增大而減小,而K值隨著巰凵「中國(guó)煤化工說(shuō)明巰基乙醇對(duì) NAGase的抑制作用表現(xiàn)為混合型抑制作用,巰基CNMHG又影響了酶與底物的親和力以雙倒數(shù)圖的各直線斜率及縱軸截距分別對(duì)巰基乙醇濃度作圖,均為一直線,測(cè)定其對(duì)游離酶的抑制常數(shù)K1與對(duì)酶-底物絡(luò)合物的抑制常數(shù)Ks分別為1.9%、9.6%104泉州師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué))2006年7月0.6015目0401201051015200.06E6000.040.1000205101520IS]/ moli·L圖3巰基乙醇對(duì)黃粉蟲 NAGase失活作用機(jī)圖4巰基乙醇對(duì)黃粉蟲 NAGase抑制作用類型的判斷理的判斷.直線0—4的巰基乙醇濃度分直線0-4的巰基乙酵濃度分別為:0,5%,7.5%別為:0,5%7.5%10%,12.5%10%,12.5%3討論昆蟲 NAGase主要分布在消化道及外殼膜,能催化幾丁質(zhì)的降解和合成,在昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)變化過(guò)程中舊殼的蛻換及新殼的形成起著重要作用.本文以具有廣闊開發(fā)應(yīng)用前景的黃粉蟲為材料,經(jīng)0.05mol/L、pH7.5 Tris-hCl緩沖液抽提、硫酸銨分級(jí)沉淀等生物分離技術(shù)制得酶蛋白濃度為240g/ml的粗酶制劑在pH5.2、0.1mol/ L NaAc-HAc緩沖液的測(cè)活體系下,對(duì)黃粉蟲 NAGase催化 pNP-NAG水解反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行了測(cè)定,得出米氏常數(shù)Kn=0.384mmol/L;同樣溫度下,在pH5.20.15mol/ L NaAc-HAc緩沖液下,測(cè)得凡納對(duì)蝦( Penaeus vannamei Prawn) NAGase催化 PNP-NAG水解反應(yīng)的米氏參數(shù)K。為0.254mmo/L;在pH5.8、0.05m0l/ L NaAc-HAc緩沖液下,測(cè)得鋸緣青蟹(Sylserrata) NAGase催化 PNP-NAG水解反應(yīng)的Kn為0.424mmo/Lm;在pH5.6、0.1mol/LNaH2PO4Na2HPO緩沖液下,測(cè)得棉鈴蟲( Helicoverpa armigera)蛹 NAGase催化pNPNAG水解反應(yīng)的Km為0.160mmol/L3.可見,不同來(lái)源的同種酶具有不同的催化動(dòng)力學(xué)特性,比較三種不同來(lái)源的酶的米氏常數(shù),結(jié)果顯示黃粉蟲 NAGase對(duì)底物 PNP-NAG的親和力比棉鈴蟲和凡納對(duì)蝦 NAGase低,但比鋸緣青蟹 NAGase高巰基乙醇是維持酶蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)二硫鍵的主要修飾劑80,它的導(dǎo)入可導(dǎo)致酶蛋白二硫鍵被破壞,引起酶三維結(jié)構(gòu)的松散導(dǎo)致酶的變性失活.不同的酶由于結(jié)構(gòu)不同,引起變性失活所要求的巰基乙醇的濃度也不盡相同本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示巰基乙醇對(duì)黃粉蟲 NAGase活力的影響呈近S型的下降趨勢(shì),小濃度的巰基乙醇破壞酶三級(jí)空間結(jié)構(gòu)的表面二硫鍵,這些二硫鍵對(duì)酶活性中心的影響不大,酶活性中心處于酶V中國(guó)煤化工研究豌基乙醇對(duì)酶的失活作用動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示巰基乙醇讓酶產(chǎn)生CNMHG并測(cè)其對(duì)游離酶及酶底物絡(luò)合物的抑制常數(shù),結(jié)果顯示K1值小于Ks值,顯示底物對(duì)酶的失活具有一定的保護(hù)作用第4期謝曉蘭等:巰基乙醇對(duì)黃粉蟲 NAGase活力的影響105參老文獻(xiàn)[1 Broadway RM, Williams DL, KaIn WC, et al. Partial characterization of chitinolytic enzymes from Streptomyces a Ibid-oflavus[J]. Letters in Applied Microbiology, 1995, 201271-276[2] Koga D, Nakashima M, Matsukura T, et al. Purification and properties of p-N-acetyl-D-glucosaminidase from alimenta-ry canal of the silkworm, Bombyx mori [J]. Agric. Biol. Chem., 1986, 50(9)12357-2368.[3]黃小紅陳清西尤民生等棉鈴蟲N乙酰D氨基葡萄糖苷酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)[J]昆蟲學(xué)報(bào),2005,48(4)498-502[4]林志偉穆允良,賈錫云,黃粉蟲生物學(xué)特性的研究[J.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào),2002,14(4):21-23[5]李建武余瑞元,袁明秀等生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法[M門北京大學(xué)出版社,1994[6]vXie XL, Chen QX, Lin JC, et al. Purification and some Properties of P-N-acetyl- D-glucosaminidase from prawnPenaeus vannamei )[J]. Marine Biology, 2004, 146: 143-148.[7] Zhang JP, Wang Q, Xie JJ, et al. Purification and Some Properties of N-acetyl-P-D-glucosaminidase from Viscera ofGreen Crab( Scylla serrata )[]. Biochemistry(Moscow), 2006, 71(1): $$59.[8]周海夢(mèng),王洪睿.蛋白質(zhì)化學(xué)修飾[M]北京:清華大學(xué)出版社,1998.[9] Zhang RQ, Chen QX, Zheng WZ, et al. Inhibition kinetics of green crab( Sylla serrata)alkaline phosphatase activityby dithiothretiol or 2-mercaptoethanol [J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Blology, 2000,32:865-872Effects of mercaptoethanol on activity of NAGasefrom Tenebrio molitor linneeusXIE Xiao-lan, PAN Xiao-fang, LIU Xiao-qiang(School of Chem. Bioscience, Quanzhou Normal University, Fujian 362000, China)Abstract: N-acetyl-B-D-glucosaminidase(NAGase, EC 3. 2. 1. 52) from Tenebrio molitorLinneeus was obtained by extraction with 0. 05 mol/L pH7. 5Tris-HCl buffer and ammoniumsulfate fractionation. The kinetic behavior of Nagase in catalyzing the hydrolysis of pNPNAG was studied. The hydrolysis of pNP-NAG by NAGase follows Michaelis-Menten kinetics. The kinetic parameters for NAGase obtained from a lineweaver-Burk plot showed thatKm was equal to 0. 384 mmol/L. Effects of mercaptoethanol on NaGase were investigated.The result showed mercaptoethanol easily made enzyme inactivate The inhibitory kinetics ofmercaptoethanol on the enzyme was further studied. The result showed that it was reversiblemixed typed inhibitor of the enzyme. The inhibition constants of mercaptoethanol for NA-Gase K, and KIs were determined to be 1. 9% and 9. 6%, respectively.Key words: Tenebrio molitor Linneeus; NAGase; mercaptoethanol; inhibitory mechanism中國(guó)煤化工CNMHG