第20卷第6期生物學(xué)雜志Vol.20 No.62003年12月.JOURNAL OF BIOLOCYDe,2003文章編號(hào):1008 - 9632(2003)06 - 0005 - 03RNA干擾與技術(shù)孫劍,2(1. 天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,天津 300072;2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所,北京 100850)摘要:RNA 干擾(RNA iterference, RNAi)是由雙鏈RNA誘導(dǎo)的、序列特異的基因沉默機(jī)制。它是自然存在于植物、線蟲和.果蠅中抵抗外來基固(包括病毒、轉(zhuǎn)座子)入侵的方式。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,能夠人工誘導(dǎo)RNA干擾,沉黷有同源序列基因表達(dá)。這一新技術(shù)具有特異性、高效性。因此,正被用來研究人類基固組的功能腫瘤和抗病毒感染等。關(guān)鍵詞;RNA干擾;小干擾RNA;基因沉默中圖分類號(hào):Q52,Q75文默標(biāo)識(shí)碼:ARNA干擾( RNA interference, RNAi)是由雙鏈RNAdependent RNA Polymerase , RdRP)的作用下,合成新的雙誘導(dǎo)的能在細(xì)胞內(nèi)有效地抑制有互補(bǔ)序列內(nèi)源性基鏈RNA。再由Dicer 作用,產(chǎn)生新的小干擾RNA,完成因的現(xiàn)象。它是1998年Fire 等在研究反義核苷酸時(shí)發(fā)小干擾RNA的放大過程[3]?，F(xiàn),在線蟲體內(nèi)，雙鏈RNA ( double stranded RNA,2小干擾RNA誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)RNA干擾技術(shù)dsRNA)能有效地抻制有互補(bǔ)序列內(nèi)源性基因,而且抑2.1 化學(xué)合成的小干擾RNA制效果優(yōu)于單鏈反義RNA。因此提出了雙鏈RNA誘盡管雙鏈RNA在植物和果蠅細(xì)胞中誘導(dǎo)RNA干導(dǎo)的RNA干擾(。隨后的研究證實(shí),RNA干擾是自然擾將雙鏈RNA轉(zhuǎn)入常用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)(如人胚腎存在于植物、真菌、果蠅等生物中,序列特異的基因沉293細(xì)胞、小鼠成纖維細(xì)胞NH3T3等)未引起特異、有默( gene-silencing)機(jī)制。效的RNA干擾現(xiàn)象[4]。這可能與大于30個(gè)堿基的雙鑒于RNA干擾的特異性和高效率,目前,國外正研鏈RNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)引起非特異的蛋白合成抑制究如何在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)RNA干擾的技術(shù),來研等細(xì)胞毒效應(yīng)有關(guān)[5]。在改用化學(xué)合成的21個(gè)堿基究基因的功能。并希望RNA干擾技術(shù)應(yīng)用于臨床,治小干擾RNA后,可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)引起特異的療腫瘤、病毒感染等疾病。已經(jīng)取得了良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)RNA干擾現(xiàn)象06。這使RNA干擾技術(shù)應(yīng)用于哺乳動(dòng)果。本文著重介紹RNA千擾的原理和哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)物成為可能。誘導(dǎo)RNA干擾的技術(shù)?；瘜W(xué)合成法人工制備小干擾RNA,一般是分別合RNA干擾的原理成21個(gè)堿基的意義鏈和反意鏈。在細(xì)胞外,將意義鏈RNA干擾是由雙鏈RNA誘導(dǎo)的。在細(xì)胞內(nèi),雙鏈和反意鏈混合。適當(dāng)?shù)臏囟认?互補(bǔ)堿基配對(duì)形成小RNA前體由核酸酶II(RNase II) - Dicer處理為21 ~23干擾RNA。然后,采用傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染的方法,如lipfectarnin個(gè)堿基的小RNA,才能誘發(fā)RNA干擾。因此,稱這類轉(zhuǎn)染、電打孔等將小干擾RNA導(dǎo)入細(xì)胞、誘導(dǎo)RNA干小RNA為小干擾RNA( smalll interfering RNA, siRNA)。擾。此法操作簡(jiǎn)單、快速。只是引起的RNA干擾效應(yīng)小干擾RNA是由19~ 21個(gè)堿基配對(duì)形成的雙鏈,并在往往是暫時(shí)的,難以持久。因此,目前正探討哺乳動(dòng)物其3'末端有兩個(gè)游離末配對(duì)的核苷酸。它在與解螺旋細(xì)胞內(nèi)表達(dá)小干擾RNA,能維持長久的.可誘導(dǎo)的RNA酶、核酸酶等結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-干擾效應(yīng)。inducing silencing complex, RISC)后,能引導(dǎo)RISC與互補(bǔ)2.2 細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的小干擾RNAmRNA結(jié)合將mRNA降解[2]。在轉(zhuǎn)錄后水平,抑制基這種方法是將表達(dá)小干擾RNA的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞,因的表達(dá)，因而,又稱為基因轉(zhuǎn)錄后沉默(pot-在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)小干擾RNA,誘導(dǎo)RNA干擾。根據(jù)產(chǎn)transcriptional gene silecing, PTGC)。生小干擾RNA的方法不同，可大概分為兩種類型:第在小干擾RNA誘導(dǎo)的RNA干擾過程中,可能還存-種類型是將意義鏈和反義鏈表達(dá)在同一條RNA鏈在小千擾RNA的放大過程,以維持它的RNA干擾誘導(dǎo)上，中間隔有3~9個(gè)堿基。因而，可以折疊、堿基.功能。此過程推測(cè)是以小于擾RNA為引物，互補(bǔ)配對(duì)，形成柄=環(huán)(stem-loop) 樣結(jié)構(gòu)的RNA[7]。 在構(gòu)mRNA為模板,在RNA依賴性RNA合成酶(RNA-建表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，將小干擾RNA序列按5'→3'和3'→5'收稿日期:2003-06-11作者筒介:孫鍘(1963- ),男,山東諸城人,軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士生、副教授中國煤化工TYHCNMHG5第20卷第6期生物學(xué)雜志Vol.20 No.62003年12月JOURNAL OF BIOLOGYDec ,2003的方向插入質(zhì)粒。因此，轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物是意義鏈-.過堿基互補(bǔ)形成雙鏈的小干擾RNA{8]。在構(gòu)建表達(dá)質(zhì)隔-反義鏈。第二種類型是將意義鏈和反義鏈表達(dá)在粒時(shí)，意義鏈和反義鏈序列分別插人同一質(zhì)粒上的兩不同的RNA鏈。然后，在細(xì)胞內(nèi)，意義鏈和反義鏈通個(gè)表達(dá)盒(圖1)。promoter_Antisense] C Sensc_C AmtisenseJ-5'一+ 3'3'←5']轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄后堿基配對(duì)SenseAntisense堿基配對(duì)柄環(huán)樣RNA小千擾RNA圖1兩種在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)小干擾 RNA的方法示意圄Figue 1 Scbematics of two ways producing aiRNA in mmalin cells兩種類型表達(dá)小干擾RNA的啟動(dòng)子一般都選用快人類基因組的功能分析。此外, RNA干擾也被用來RNA聚合酶川(polymerase II, Pol II)的啟動(dòng)子,如人核研究調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝的相關(guān)基因。對(duì)線蟲基因組的RNA酸酶P RNA H1 (human RNase P RNA H1)和小核RNA干擾分析發(fā)現(xiàn),305種基因功能的缺失導(dǎo)致線蟲體內(nèi)儲(chǔ)(small nuclear RNA, snRNA) - U6的啟動(dòng)子。這類啟動(dòng)存脂肪下降,而另外112種基因的失活引起體內(nèi)脂肪增子有兩個(gè)特點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是沒有聚腺背酸尾的小加。其中許多基因是新證實(shí)參與脂肪儲(chǔ)存,并在人類RNA。并且,轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)和終止點(diǎn)明確。這些特性有利有同源。因此,這些基因在人體內(nèi)的表達(dá)失調(diào)可能與于合成短鏈的小干擾RNA。因此,優(yōu)于其它啟動(dòng)子。肥胖以及相關(guān)疾病有關(guān),有望成為治療肥胖的新靶第一類的柄-環(huán)小RNA在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后,可以特點(diǎn)[10]。相信使用RNA干擾研究基因組,將發(fā)現(xiàn)參與其異的抑制同源序列基因的表達(dá)。抑制效應(yīng)與細(xì)胞外合它生理、病理過程的相關(guān)基因。成的小干擾RNA相似,環(huán)的大小明顯影響抑制效果,9RNA千擾技術(shù)正顯示出在臨床應(yīng)用的巨大潛力。個(gè)堿基環(huán)的柄-環(huán)RNA作用最強(qiáng),5個(gè)堿基環(huán)的柄-在抗病毒感染的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn),小干擾RNA在哺乳環(huán)RNA沒有作用,原因還不清楚。PAGE 電泳證實(shí),柄動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)的RNA干擾能顯著的阻止HV11]、流-環(huán)RNA在細(xì)胞內(nèi)可成熟為小干擾RNA(圖1),并且，.感病毒[12]、丙型肝炎病毒[13]感染細(xì)跑。在腫瘤的研究穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后2個(gè)月,小干擾RNA仍在細(xì)胞內(nèi)表達(dá),未發(fā)方面,RNA干擾降低癌基因- BRC/ABL的表達(dá),引起癌現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒效應(yīng)。提示,這種RNA干擾技術(shù)穩(wěn)定、細(xì)胞生長的抑制,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14)。隨著對(duì)RNA千可靠1。擾機(jī)制的進(jìn)一-步認(rèn)識(shí)和小干擾RNA技術(shù)的改進(jìn),RNA第二類細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的雙鏈小干擾RNA,在人Hela干擾技術(shù)將會(huì)有廣 闊的應(yīng)用前景。細(xì)胞系中可特異的抑制同源基因的表達(dá)。PAGE電泳參考文獻(xiàn):證實(shí),小干擾RNA在細(xì)胞內(nèi),要比對(duì)照的單鏈的意義鏈RNA或反義鏈RNA穩(wěn)定。可能是由于形成雙鏈，能抵[1]Fre A, Xu S, Montgonery MK, et al. Potent and speic geneicinterference by double-stranded RNA in Caenorhabditis egans[J].抗細(xì)胞內(nèi)核酸酶的作用。小千擾RNA的抑制作用可以Nature , 199186696 :806- 811.根據(jù)其所針對(duì)基因位置的不同而不同。最強(qiáng)的可以抑[2]Bemstein E, Candy AA, Hanmond sM, a al. Role for a bidentale制86%的基因表達(dá),最弱的沒有抑制作用。因而,小干riborueclease in the initation step of RNA interference[J]. Narure,擾RNA的效應(yīng)是靶點(diǎn)依賴性的。此外,在同一個(gè)質(zhì)粒2001 ,409(6818):363 ~ 366.上表達(dá)的兩種小干擾RNA,可以分別抑制對(duì)應(yīng)靶基因[3]Sijan T,leenoe J,Sinmner F,e adl.On the mole d RNA mplifcation in的表達(dá)。這些研究結(jié)果為以后設(shè)計(jì)小干擾RNA提供了daRNA- tiggered gene eilencing[J]. Call ,2001 107(4):465 ~ 476.良好的參考[8]。[4]Caplen NJFloenor J, Fire A, et al. deRNAndliated gene silencingin culnured Droeophila ell; a tsue culure mdel for the analysis3展望of RNA iterfence[]]. Cene ,000,2521 ~2):95 ~ 105.小干擾RNA誘導(dǎo)的RNA干擾自發(fā)現(xiàn)以來,發(fā)展迅[5]Minks MA, West DK, Benvin s, et al. Stuctural requremente o速,利用RNA干擾已成功的分析了線蟲86%基因組的oul |中國煤化工-' - oligo(A) palyoene功能[9] ,相信使用這種簡(jiǎn)捷、方便的技術(shù),將有助于加Clela Clls[J]. J BiolMHCNMHG第20卷第6期生物學(xué)雜志Vol.20 No.62003年12月JOURNAL OF BIOLOGYDec,2003Chem , 1979 254(20): 10180~ 10183.2003 ,421(6920):268 ~ 270. .[6] Elbesir SM, Harborth J, Lendckdl w,et al. Duplescs of 21-[11] Jaxque J, Tiques K, Sevenon M. Molulation of HV - 1nucleotide RNAs nodiate RNA inteference in culured mamalianreplication by RNA itererence[J]. Natue , 2002 ,418(6896):ells[J]. Nature ,2001 ,411(6836):494 ~ 498.435 -438.[7 ] Brumelkamp TR, Bemarls R, Agami R. A System for Stuable[12]Ge Q, McManus MT,Nguyen M T, Shen C, et al. RNA interferenceExpesion aof Short Inerering RNAs in Manalian Cells [J].of influenra vinus prduction by direaly trgeting mRNA forSiene ,002,2965567)550~ 553.degnadation and indirecly inhibiting all viral RNA trenseription[J].[8]Miyngishi M,Tairn K. U6 prumoler-driven siRNAs with four uridineProc Nar1 Aoad 8xi USA ,2003, 100(5):2718 ~ 2723.3’ overhangs eficienty suppress targeted gene expression in[13]Wilon JA,Jnyasena s, Khvorova A, ex al. RNA iterference blocksmarunalin ells[J]. Nat Biotech, 2002 ,20(5):497 - 500.gene exrossion and RNA synthesis from bepettis C[9]Kanath RS, Fraser AG,Dong y,et al. Syetemic funcinal analysis ofrepliconspropagated in bunen liver cll[J]. Proc Natl Acad Saithe Caenothabdis elegans genome using RNAi[J]. Nature ,2003,USA ,2003, 100(5):2783 ~ 2788.421(6920):231 ~ 237.[14]Wilda M, Fuche U, Wosman w, et al. Klling of Ieukenic cells[10]Ashra6i K,Chang FY,Wats JL,et al. Gemome wide RNAi analysiswith a BCR/ABL fusion gene by RNA iterference (RNAi)[J].of the Caenochabditis elegans fat regulatory genes[J]. Nature,Oncogene ,2002,21(37) :5716~ 5724.RNA interference techniqueSUN Jian(ollege of Phammaceuticals and technology , Tianjin University ,Tianjn,300072, China)Abstact: RNA interference(RNAi) was dsRNAs (double-stranded)-induced sequence-secific gene-silencing mechanisn. Itwas a natural resistent way against invasion of foreign genes ( like virus, transposon) in plants, C. elegans and Drosophila.RNAi can be induced by small interfering RNA ( siRNA) to silence expression of homologous gene in maenmalian cells. RNAiwas used in functional analysis of human genome , and would be potential therapeutie approach to treat cancer and prevent virusinfection due to its highly speificity and eficiency.Key words: RNA interfering; siRNA; gene silencing(上接第10頁)[7]Slter D, Gearhatr J. Puting stem cells to work[]. Science , 1999分化[J].生物學(xué)通報(bào),2002,37(1);1-3.283:1468 ~ 1470.[3]叢笑倩,夏漢順,徐露露,等.外源TCF-B1基因在小鼠ES細(xì)[8]Evans MJ, Kaufman MH. 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Myoblast cell galting into heart muecle:Cllular Biology and Potenial Apcacins.Theory and research advances on stem cellsQIAN Fang(Gaoyou camp, Yangzhou Educational College, Gaoyou, 2256000 China)Abstract: The stem cells research was the most active area in curment cell engineering. The stem cells were lassified anddefined . The comparative study between embryonic and the adult stem cell was taken, and the applications of stem cells techniquewere introduced . The great potentiality of the stem cells particularly the embryonid stem cells in medical science and the wholelife science were revealed, and the great reforns were made in the medica中國煤化工Key words: stem cll; embryonic stem cll; adult sten cellTYHCNMHG7