醫(yī)學分子生物學雜志,2009,6(6):518-520 Med Mol Biol,2009,6(6):518-520doI:10.38700/ issn1678009.2009.06.010用聚乙二醇分離富集 microRNA的方法探討駱明勇,鐘華敏廣州市婦女兒童醫(yī)療中心兒童醫(yī)院檢驗科廣州市,510120【摘要】目的探討用聚乙二醇( polyethylene glycol PEG)溶液分離富集miRNA的操作方法和分離富集效果,并與 Ambion公司的 miRNA分離試劑盒分離效果進行比較。方法用PEG溶液和 Ambion公司的 miRNA分離試劑盒從肝臟組織總RA中分離富集 miRNA,用變性瓊脂糖和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定分離效果,并在富集的 miRNA中用RT-PCR擴增miR-122鑒定是否有效地回收了 miRNA結(jié)果PEG和 Ambion公司 miRNA分離試劑盒都能有效地富集mRNA,PEG富集的RNA片段比 Ambion公司的試劑盒的大。結(jié)論PEG溶液能有效 miRNA地分離富集,和 Ambion公司的 miRNA分離試劑盒分離效果相當,并具有操作簡便、快捷及成本低廉的優(yōu)點。【關(guān)鍵詞】 microRNA;聚乙二醇;mi-122【中圖分類號】Q522 Isolation and Enrichment of MicroRNA by use of Polyethylene Glycol LUO Mingyong, ZHONG Huamin Laboratory Department of Children's Hospital, Guangzhou Medical Center for Women and Children, Guangzhou, 510120, China [Abstract] Objective To develop approaches for isolating and enriching microRNA with Poly- ethylene Glycol (PEG), in comparison with the microRNA isolation kit produced by Ambion com- pany. Methods microRNA isolation and enrichment were performed in liver tissue with PEG and Ambion microRNA isolation kit. The products produced with two methods were evaluated by electro- phoresis on denaturing agarose gel and denat lyacrylamide gel. miR-122 was detected by RT- ent fraction to verify the recovery of microRNA in isolation process. Results Peg method was able to successfully enrich microRNA, similarly to Ambion microRNA isolation kit. The RNA fragment enriched by PEG was larger than that obtained b Ambio croRNA isola- tion kit. Conclusion PEG can enrich microRNA as efficiently as Ambion microRNA isolation kit. with advantage of easy and quick manipulation and low cost.【 Key words】 microRNA polyethylene glycol;mir-122 microRNA(miRNA)是一組生物體基因組編莖環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄引物的T-PCR方法也被發(fā)展了碼的內(nèi)源的非編碼小RNA(RNnoncodimgsmalL《,RN起來,大大地提高了miRNA檢測的靈敏度但A),廣泛分布在動植物及病毒等生物體中。研由于 miRNA在細胞或組織中含量非常低,從總究表明, miRNA與動植物的發(fā)育、細胞生長分化RNA中富集mRNA是 miRNA實驗中一個重要的步和凋亡、脂肪代謝以及人類重大疾病密切相關(guān),近驟。目前,一些生物技術(shù)公司已開發(fā)出了一些用于年來成為了生命科學的研究熱點14。分離富集 miRNA的商品試劑盒,分離效果好且使隨著生命科學研究的發(fā)展, miRNA研究方法用方便,但是價格昂貴。在本研究中,我們擬對采層出不窮并不斷地得到改進。研究方法有克隆表用聚乙二醇( polyethylene glycol,PEG)分離富集達、 Northern印跡及生物芯片等;一種新的采用帶 miRNA的方法進行探討。1材料和方法通訊作者:駱明勇(電話:020-81330633,-mail:luo-my@163. com) Correaponding author: LUO Mingyong(tel:86-0813063,1.1試劑和儀器 mail: luo-my@ 163. com)PEG6000和氯化鈉購自加拿大BBI公司;人肝醫(yī)學分子生物學雜志,2009,6(6):518-520 Med Mol Biol,20096(6):518-520519臟組織總RNA和 miRNA分離試劑盒(mirVana miR表1mir-122和u6rna的rt-pcr引物 NA isolation kit)購自美國 Ambion公司;糖原購自引物序列(5→3)美國 Invitrogen公司低分子量 DNA marker購自美i-122RT引物 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGC-國NEB公司;垂直電泳槽和電泳儀購自美國Bio- TATTCGCACTGGATACGACACAAACrad公司;PCR儀購自美國 MJ Research公司;低溫pcr引物 GCCGTGGAGTGTGACAATGGT正向:臺式離心機購自德國 Eppendorf公司;寡核苷酸在英反向:GTGCAGGGTCCGAGGTu6pcr引物正向:CTCGCTTCGGCAGCACA駿( Invitrogen)公司合成。反向:AACGCTTCACGAATTTGCGT1.2實驗方法1.2.1Pg6000溶液的配制分別稱取PEG2結(jié)果600013.0g,氯化鈉9.36g溶于100 ml DEPC處理液中。PEG的終濃度為13%(mv),氯化鈉的終2.1miA高集后的電鑒定濃度為1.6molL。溶解完后用0.2μm濾器過濾,肝臟組織總RNA和富集后的 LMW RNA、4℃保存?zhèn)溆谩?HMW RNA的甲醛變性瓊脂糖電泳和變性聚丙烯酰1.2.2肝臟組織 miRNA的富集過程PEG600胺凝膠電泳結(jié)果見圖1和圖2溶液富集 miRNA的方法簡要過程為:在肝臟組織A123B123總RNA(1μg/)100溶液中加入等體積的PEG6000溶液,室溫放置10min;然后在4℃,28s12000c/min離心15min?？俁NA被分為兩部分,18s28s上清液即為低分子質(zhì)量RNA( low molecular weight18sRNA, LMW RNA),沉淀為高分子質(zhì)量RNA(high molecular weight RNA, HMW RNA);在上清中加5.8s5.8s入0.1倍體積醋酸鈉(3moL,pH5.2)和糖原 5s 5s(終濃度為1ng/),再加入2.5倍體積無水乙醇,-20℃放置1h沉淀 LMW RNA, miRNA就富集在圖1甲醛變性瓊脂糖(1.2%,各條帶RNA上樣量都為0.5μg)RNA電圖 LMW RNA中。A:PEG分離電圖;B: Ambion公司 miRNA分離試劑 AmbionmiRNA公司的分離試劑盒(mirVana盒分離電泳圖 miRNA isolation kit)分離富集 miRNA按照試劑盒1:總rna;2: HMW RNA3: LMW RNA說明書進行。1.2.3 miRNA分離富集結(jié)果的鑒定分離后的12345 LMW RNA和 HMW RNA各0.5μg用1.2%甲醛變性瓊脂糖RNA電泳和15%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)鑒定其分離效果。為了驗證兩種方法是否有效地富集回收了5.8s miRNA,我們在富集的樣品中進行 miRNA的RT 5sPCR實驗。由于我們富集用的總RNA是肝臟組織 IRNA總RNA,就選取在肝臟組織特異表達的miR-122圖2變性聚丙烯酰胺凝膠(15%)電泳圖進行t-r,并同時擴增U6NA1:總RNA;2:PEG分 HMW離 RNA;3:PEG分離miR-122的Rt-Pcr簡要過程為:對mir- LMW RNA Ambion試劑盒分離 HMW RNA5:122設(shè)計一條帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄引物以及相應(yīng)的 Ambion試劑盒分離 LMW RNA一對PCR引物(序列見表1);10μ逆轉(zhuǎn)錄體系中M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶100單位、50 nmol莖環(huán)結(jié)構(gòu)從甲醛變性瓊脂糖電泳圖上可以看出用PEG的引物和U6RNA逆轉(zhuǎn)錄引物、 LMW RNA10ng;沉淀和 Ambion公司的 miRNA分離試劑盒都能將高逆轉(zhuǎn)錄后進行PCR,PCR條件為95℃15s,60℃分子質(zhì)量RA(如28 rRNA和18r)有效308,進行20個循環(huán)。同時在另一管中擴增U6地去除,只可見5rA和5.8srNA的條帶,RNA,U6RNA的PCR引物見表1。低分子質(zhì)量RNA得到了很好的富集。同時變性520駱明勇,等.用聚乙二醇分離富集 microRNA的方法探討PAGE電泳圖上都可以清楚地看見,兩個方法富集的、具有顯著優(yōu)越性的方法,在一般的RNA實驗都可以清楚地看見 LMW RNA的tRNA、5 rRNA室即可進行操作。和5.8 rRNA的條帶,并且在 HMW RNA中較少 miRNA由于在細胞和組織中含量低,所以不看到5.8srna以下的RA;EG富集的LMW管是 miRNA克隆、 Northern印跡還是生物芯片檢RNA條帶的加樣孔 Ambion中的亮度比公司的miR測都需要對總RNA進行分離富集。分離方法也層NA分離試劑盒分離的亮,并且PEG富集后HMW出不窮,最開始研究人員采用PACE電泳分離,RNA條帶中的剩余的5.8S條帶較暗,而 Ambion miRNA,此方法難度大、復(fù)雜且操作繁瑣;公司的 miRNA分離試劑盒分離后的 HMW RNA條等率先采用PEG的方法分離富集miR帶中可以較多地看到5.8SRNA部分,說明 PEG NA,取得了滿意的結(jié)果。該方法具有操作簡便、方法富集的低分子質(zhì)量RNA部分包括有較多的成本低廉等優(yōu)點,且不影響 miRNA的后續(xù)反應(yīng),5.8s部分綜上所述,兩種方法都能有效地富集的 miRNA可以進行各種酶學反應(yīng)。近年來,富集低分子質(zhì)量RNA(包括 mRNA部分),PEG生物技術(shù)公司開發(fā)出了各種 miRNA分離試劑盒,富集的RNA片段比 Ambion公司的試劑盒的大這些試劑盒方便使用,為研究工作者提供了方便,2.2miR-122的RT-PCR檢測但是試劑盒都比較昂貴。本研究用PEG的分離方PCR產(chǎn)物的電泳圖見圖3。miR-122的PCR產(chǎn)法和 Ambion公司的 mRNA分離試劑盒進行了比物長度為59bp,u6的PCR產(chǎn)物長度為94bp。從較,兩種方法都能有效地分離富集 miRNA,但RT-PCR結(jié)果可以看出,兩種方法富集的低分子質(zhì)PEG的方法具有成本低廉操作便捷,為研究工量RNA中都能很好地擴增出miR-122和U6RNA。作者提供了另一個較好的方法選擇。說明兩種方法都能有效地富集回收 miRNA。在用乙醇沉淀回收低分子質(zhì)量RNA時,加入糖元是必需的。糖元作為核酸沉淀的載體可以使 bp U6 MiR-122 bp miRNA不易丟失且操作更方便,糖元也可以用如766 Takara公司的核酸共沉淀劑等替代。 Ambion公司500的 miRNA分離試劑盒也是一個使用較方便的試劑350盒,但是價格較昂貴,另外我們在使用 Ambion公300250司的 miRNA分離試劑盒的過程中也發(fā)現(xiàn),由于試200劑盒的洗滌緩沖液在低溫下容易析出鹽結(jié)晶,如果15010094使用前溶解不充分就會將鹽分殘留在富集的miR7559NA中,從而影響后面的酶學反應(yīng)。5025參考文獻 [1] BARTEL D P. MicroRNAs: genomics, biog圖3肝臟組織miR-122和U6 RNA RT--PCR電泳圖 function[j.cell,204,116(2):281-29 [2] YANG M, L Y, PADGETT R W. MicroRNAs: Small regulators with a big impact]. Cytokine Growth Factor Rev, 2005, 16(4-3討論5):387-393. [3] WIENHOLDS E, PLASTERK R H. MicroRNA fu miRNA是近年來生命科學的研究熱點,研究4] MISKA的方法也發(fā)展得較多,但由于 miRNA在細胞和組 and death[].織中含量很低,所以 miRNA大部分的的研究方法 [5] CHEN C, RIDZON D A, BR cation of microRNAs by都需要預(yù)先對其進行分離富集。本研究對PEG分Res,20053(20):e79[6]駱明勇,楊戎,張亮,等M對肝癌細胞基因表達離富集 miRNA的方法進行了探討,成功地摸索出譜的影響[]中國生物化學與分子生物學報,007,23(8):644651了用PEG6000溶液離心沉淀分離 miRNA的方法。[7 BASKERVILLE. BARTE鑒定結(jié)果顯示PEG溶液能有效地分離富集 miRNA, NAs reveals frequent co with neighboring miRNAs and host genesjrna200511(3):241-247并和 Ambion公司的 miRNA分離試劑盒分離效果相 THOMSON PARKER PEROU et al cust當,PEG分離富集的RNA片段略大于 Ambion公司 platform for analysis of mieroRNA gene expression[ J]. Nat Methods,20041(1):47-53的 miRNA分離試劑盒。但PEG分離富集的方法具(200908-17收稿有操作簡便、快捷及成本低廉的優(yōu)點,是一種實用