第37卷第7期天津大學(xué)學(xué)報(bào)Vol.37 No.72004年7月Jourmal of Tianjin UniversityJul. 2004添加劑促進(jìn)變性還原溶菌酶復(fù)性的作用董曉燕，黃艷，孫彥(天津大學(xué)化工學(xué)院,天津300072)摘要:研究了多種添加劑促進(jìn)變性還原溶菌酶復(fù)性的作用。考察了添加劑濃度及變性劑鹽酸胍濃度對復(fù)性收率的影響.結(jié)果表明,精氨酸、乙酰胺、丙酮、硫脲及甘油均能有效促進(jìn)變性溶菌酶復(fù)性,并且存在最佳的添加劑濃度使變性溶菌酶的復(fù)性收率最大.在促進(jìn)復(fù)性中,乙酰胺等結(jié)構(gòu)類似物與鹽酸胍具有相同作用,因此,在降低復(fù)性液中鹽酸胍濃度的同時(shí),適當(dāng)提高乙酰胺濃度即可獲得較高的復(fù)性收率.當(dāng)鹽酸胍濃度為0.2 mol/L時(shí),復(fù)性收率達(dá).到90%時(shí)的乙酰胺濃度為2 molVL, 但降低鹽酸胍濃度至0.06 mol/L時(shí),達(dá)到相同變性收率的乙酰胺濃度需要4 molVL.甘油與鹽酸胍存在著協(xié)同作用,在一定濃度的鹽酸胍存在下,添加適量的甘油能獲得較高的復(fù)性收率,關(guān)鍵詞:溶菌酶;復(fù)性;稀釋劑;變性中團(tuán)分類號: 0629. 73;0643.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號: 0493- 2137(2004)07-0643-04Role of Various Dilution Additives on the Refolding ofDenatured-Reduced LysozymeDONG Xiao-yan, HUANG Yan, SUN Yan(School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China)Abstract: The role of various dilution additives on the refolding of denatured -reduced chicken egg white lyso-zyme was investigated, and the efet of the concentrations of guanidinium chloride ( GdmCl) and the additiveswas studied to find proper refolding conditions. It was found that the addition of arginine, acetamide, acetone,thiourea and glycerol was effective in improving the refolding yield. In addition, there was an optimal additiveconcentration for each additive, which made the refolding reach the highest yield. It was also found that the re-folding-promoting mechanism of acetamide, arginine , acetone and thiourea was the same as that of GdmCl,i. e.GdmCl could be replaced by these additives as the refolding promoter. For example, at a CdmCl concentationof 0.2 mol/L, the presence of 2 mol/L acetamide improved the refolding yield to 90%, while at a low GdmClconcentation (0. 06 mol/L), 4 mol/L acetamide was needed to yield 90% refolding. On the other hand, the.effct of glycerol and GdmCl on protein refolding was additive. That is, increasing glycerol concentration at aproper GdmCl concentration could obtain a high refolding yield of protein.Keywords: lysozyme; refolding; dilution additives ; denaturation變性蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)外露.在復(fù)性過程中,隨著增大 ,就顯得尤為突出" ,因此,抑制肽鏈分子間的聚變性劑濃度的下降,外露的疏水基團(tuán)相互作用會生成集作用,提高變性蛋白質(zhì)的復(fù)性收率成為當(dāng)前蛋白質(zhì)大量的聚集體.這種聚集作用在變性蛋白質(zhì)濃度較低復(fù)性工作的研究焦點(diǎn).時(shí)不明顯,當(dāng)濃度升高時(shí),由于伸展肽鏈間的碰撞幾率向復(fù)性稀釋液中加入某些添加劑在很大程度上可收稿日期:0030- 03- 14;修回日期:003- 08- 19.中國煤化工基金項(xiàng)目:教育部優(yōu)秀青年教師基金資助項(xiàng)目.MYHCNMHG作者簡介:董曉燕(1962- ) ,女,教授,ysun@ tju. edu. cn.。644●天聿大學(xué)學(xué)報(bào)第37卷第7期緩解肽鏈分子間的疏水作用,提高變性蛋白質(zhì)的復(fù)性聚集促進(jìn)復(fù)性,且鹽酸胍濃度對最終的復(fù)性收率影響收率(2].添加劑價(jià)格低廉且稀釋添加法操作簡便,因較大[51].為便于觀察添加劑對變性溶菌酶復(fù)性的影而具有很大的工業(yè)化應(yīng)用前景.但添加劑促進(jìn)變性蛋響,首先確定了本實(shí)驗(yàn)條件下鹽酸胍的合適濃度;選擇白質(zhì)的復(fù)性作用與其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)密切相關(guān)(BI ,并且相了自發(fā)復(fù)性收率為50%的鹽酸胍濃度0. 2 mol/L.同的添加劑對不同的變性蛋白質(zhì)復(fù)性作用不同[4].為研究指出,鹽酸胍分子中的某些集團(tuán)與抑制分子進(jìn)一步闡明不同添加劑在促進(jìn)變性蛋白質(zhì)復(fù)性中的作間聚集反應(yīng)有密切關(guān)系[3),并且研究證明,精氨酸作用,以變性還原的溶菌酶為模型蛋白,采用稀釋添加法為添加劑也可抑制變性蛋白質(zhì)聚集,促進(jìn)蛋白質(zhì)復(fù)考察了多種添加劑促進(jìn)溶菌酶復(fù)性的作用,討論了添性').另外,向復(fù)性稀釋液中加入一-定濃度的甘油在加劑濃度對復(fù)性收率的影響,同時(shí)探討了添加劑與變一定程度 上也提高了變性溶菌酶的復(fù)性收率”.為了性劑(鹽酸胍)在促進(jìn)溶菌酶復(fù)性中的相互關(guān)系.進(jìn)一步分析添加劑在促進(jìn)變性蛋白質(zhì)復(fù)性作用上存在的共性和差異,尋找更多的有效添加劑，筆者選用了與1材料和方法鹽酸胍結(jié)構(gòu)類似的乙酰胺、丙酮、精氨酸和硫脲,與精氨酸的類似物甘氨酸和天冬酰胺,甘油及其相關(guān)的醇1.1 實(shí)驗(yàn)材料溶菌酶( lysozyme)、溶菌酶底物微球菌( M. lyso-類物質(zhì)(乙醇和D-山梨醇) ,具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的葡萄糖和deikticus) 、鹽酸胍( GdmCl)、二硫蘇糖醇( DTT)和氧化具有胺基的丙胺作為添加劑，分析比較了這些物質(zhì)對型谷胱甘肽( GSSC)均購于Sigma公司,三羥甲基氨基促進(jìn)變性溶菌酶的復(fù)性作用,如圖1所示,其中甘氨酸甲烷(Tris)購于Promega 公司,還原型谷胱甘肽和精氨酸濃度為0.5 mol/L,甘油濃度為3.2 mol/L,其(GSH)購于日本USB公司,其它試劑均為分析純.它添加劑濃度為1 mol/L.1.2溶菌酶的變性將20 g/L溶菌酶溶液(含有30 mmol/L DTT,6D.山梨醉8|mol/L GdmCl和0. 1 mol/L Tris-硫酸緩沖液,pH =甘油8.5),置于37 C ,120 r/min的搖床中反應(yīng)1 h,使溶菌葡萄糖酶徹底變性和還原.天冬酷鞍甘氨酸1.3溶菌酶的復(fù)性用適量的復(fù)性緩沖液(0.1 mol/L Tris-硫酸緩沖液,pH=8. 5,1.0 mmol/L EDTA,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)量的GSSG乙酸妝和GSH)稀釋變性溶菌酶,并添加適量的GdmCl和添020406080100020406080100加劑,于37 C,150 r/min下復(fù)性并在不同的復(fù)性時(shí)間R.1%R,1%取樣測活.復(fù)性液中酶的終濃度為0.2 g/L.(a)復(fù)性時(shí)間為60 min(b)復(fù)性時(shí)間為24 h1.4 溶菌酶活性的測定圈1各種添加劑對溶菌酶復(fù)性影響以0.25 g/L微球菌(溶于60 mmol/L磷酸鹽緩沖Fig.1 Lysozyme refolding in the presence液,pH =6.2)為底物測定溶菌酶活性.向1.5 mL底物of various additives溶液中加入0.1 mL一定濃度的溶菌酶復(fù)性液,測定反由圖1可見，與自發(fā)復(fù)性相比,加入乙酰胺、丙酮、應(yīng)液在450 nm下的吸光值變化,以2 min內(nèi)吸光值的精氨酸及硫脲都可有效提高變性溶菌酶的復(fù)性收率.降低速率與100%酶活性相比即得相對酶活性(R、).實(shí)特別是精氨酸,復(fù)性1 h的復(fù)性收率可達(dá)80%,比自發(fā)驗(yàn)中考察了各種添加劑對測活的影響,未發(fā)現(xiàn)有干擾復(fù)性收率(48%)提高了30%以上.雖然加入丙酮,乙?，F(xiàn)象.胺在反應(yīng)1 h的復(fù)性收率相對較小(60%和58%) ,并且加入硫脲的復(fù)性收率僅為40%(不及對照組的自發(fā)復(fù)2結(jié)果與討論性)(圖1a ),但延長復(fù)性時(shí)間至24 h, 復(fù)性收率均顯著升高,尤其是添加丙酮時(shí)的復(fù)性收率可升至100%2.1不同添 加劑對溶菌酶復(fù)性的促進(jìn)作用中國煤化工內(nèi)某些相似基團(tuán)可能對研究表明,高濃度的鹽酸胍雖然是蛋白質(zhì)的變性劑,但較低濃度的鹽酸胍可很好地抑制肽鏈分子間的CN M H要雖然精氨酸能有效促心x江他馬用如取問大時(shí)氨基酸(天冬酰胺與甘2004年7月董曉燕等:添加劑促進(jìn)變性還原溶菌酶復(fù)性的作用●645●氨酸)不僅不能促進(jìn)變性溶菌酶復(fù)性,反而使復(fù)性收2.3添加劑與鹽 酸胍在促進(jìn)溶菌酶復(fù)性中的相互率下降.同樣,甘油能很好地促進(jìn)溶菌酶復(fù)性,另兩種關(guān)系結(jié)構(gòu)相似的醇類物質(zhì)(D -山梨醇和乙醇)沒有促進(jìn)復(fù)以上結(jié)果分析認(rèn)為，與鹽酸胍結(jié)構(gòu)相似的乙酰性作用.說明只有與鹽酸胍結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì),才可發(fā)揮胺、丙酮、硫脲及精氨酸對促進(jìn)變性溶菌酶的復(fù)性作用抑制分子間聚集和提高復(fù)性收率的作用.甘油的作用可能與鹽酸胍相同,而甘油則不同.為了進(jìn)- -步探明不可能與其特殊的物化性質(zhì)有關(guān)同添加劑與鹽酸胍之間的相互作用,在較低鹽酸胍濃2.2添加劑濃度對溶菌酶復(fù) 性的影響度(0.06 mol/L)下,進(jìn)- - 步研究了5種添加劑濃度促從圖1可以看出,添加相同濃度(1 mol/L) 的丙進(jìn)變性溶菌酶復(fù)性的作用,如圖3所示.酮、乙酰胺和硫脲雖然都能促進(jìn)變性溶菌酶復(fù)性,但復(fù)性收率相差較大,因此認(rèn)為各種添加劑可能存在最佳甘乙酰胺的濃度使復(fù)性收率最高.為探索各種添加劑的最佳的▲丙酮濃度,研究了以上5種有促進(jìn)復(fù)性作用的添加劑濃度-口-精氨酸對變性溶菌酶復(fù)性的影響,結(jié)果如圖2所示,其中R,0 tHd為活性收率,c,為添加劑濃度.x 40102心乙酰胺圄3較低鹽酸胍濃度下添加劑濃度0F+丙酮對溶菌酶復(fù)性收率的影響--精氨酸.Fig.3 Additive concentration dependence of lysozyme+硫脲refolding with various additives in lowerconcentration of GdmCl°十26廣8從圖2和圖3可以看出,在兩種不同鹽酸胍濃度團(tuán)2添加劑濃度對溶菌酶復(fù)性收率的影響下,甘油濃度均達(dá)到3.2 mol/L時(shí)變性溶菌酶的復(fù)性Fig.2 Additive concentration dependence of lysozyme收率最高.當(dāng)鹽酸胍濃度為0.2 mol/L 時(shí),復(fù)性收率達(dá)refolding with various additives80%(圖2) ;鹽酸胍濃度降至0. 06 mol/L 時(shí),復(fù)性收率由圖看出,在本實(shí)驗(yàn)條件下,5種添加劑均存在最只有40%(圖3).與此相比，乙酰胺等其他4種添加劑佳濃度使變性溶菌酶的復(fù)性收率最大.除甘油外,其余最佳濃度值隨鹽酸胍濃度的降低而增大.例如，當(dāng)鹽酸4種添加劑均表現(xiàn)為隨濃度的升高復(fù)性收率不斷上胍濃度為0.2 mo/L時(shí),復(fù)性收率達(dá)90%時(shí)的乙酰胺濃升,但當(dāng)濃度升到--定值時(shí),繼續(xù)增大添加劑的濃度,度為2 mol/L;當(dāng)鹽酸胍濃度降至0.06 mol/L時(shí),乙酰復(fù)性收率明顯下降.此結(jié)果與鹽酸胍濃度對溶菌酶復(fù)胺濃度需升至4mol/L才可獲得同樣高的復(fù)性收率.性收率影響的結(jié)果一致[1] ,說明這些添加劑的作用類此結(jié)果進(jìn)-步證實(shí)了上述分析,說明不同添加劑對促似于鹽酸胍,當(dāng)濃度適當(dāng)時(shí)能保護(hù)變性蛋白質(zhì)伸展肽進(jìn)變性蛋白質(zhì)的復(fù)性作用不同.鏈和部分折疊片斷的疏水基,有效抑制肽鏈間聚集促在Yasuda等人”的研究中,相同的鹽酸胍濃度進(jìn)復(fù)性;當(dāng)濃度過高時(shí),不僅抑制了肽鏈分子間的聚集下,添加1.4 mol/L和3 mol/L的乙酰胺獲得了相同的作用,同時(shí)也抑制了分子內(nèi)折疊,使復(fù)性收率下降.對溶菌酶復(fù)性收率(實(shí)驗(yàn)條件與本文相近) ,因此他們認(rèn)于甘油而言,隨著復(fù)性液中甘油濃度的升高,變性溶菌為,乙酰胺能抑制肽鏈間的聚集作用,但不影響分子內(nèi)酶的復(fù)性收率雖然也隨之升高,但當(dāng)濃度升至- -定值的折疊.筆者的研究發(fā)現(xiàn),乙酰胺、丙酮硫脲和精氨酸時(shí)(3.2 mol/L) ,繼續(xù)增大濃度,復(fù)性收率不再明顯變均存在最佳濃度使變性蛋白質(zhì)的復(fù)性收率最高(圖2化由此可見甘油與其他添加劑不同,甘油的存在可能和圖3).該結(jié)果夷明:這些物質(zhì)對促進(jìn)變性溶菌酶的增大了天然態(tài)蛋白質(zhì)在溶液中的熱力學(xué)穩(wěn)定性”,促復(fù)性作中國煤化工濃度過低時(shí),變性蛋白質(zhì)!Y臺CNMHG效抑制，表現(xiàn)出較.進(jìn)蛋白質(zhì)復(fù)性反應(yīng)向正確折疊的方向進(jìn)行.●646●天津大學(xué)學(xué)報(bào)第37卷第7期低的復(fù)性收率;隨著濃度的增大,分子間的疏水性相互參考文獻(xiàn):作用的抑制作用逐漸增強(qiáng),因而復(fù)性收率不斷升高;當(dāng)添加劑濃度過高時(shí),不但抑制了蛋白質(zhì)折疊過程中的[1] Kurganov B 1. Kinetics of protein aggregation:Qutitaive es-分子間疏水作用，同時(shí)也抑制了分子內(nèi)的疏水作用timation of the chaperone-like activity in test-systems based(折疊)，使復(fù)性收率轉(zhuǎn)而下降.與此相比,甘油對溶菌on suppression of protein aggregation [ J]. Biochemistry(Moscow) , 2002, 67(4): 409- 422.酶復(fù)性雖有促進(jìn)作用,但它沒有抑制肽鏈間聚集的作2] Dong Xiaoyan, Wang Ying, Sun Yan. Kinetics of lysozyme re-用,僅是通過提高天然態(tài)溶菌酶的熱力學(xué)穩(wěn)定性,促進(jìn)flling faitiated by arificial chaperones[J]. Journal of變性溶菌酶向天然態(tài)折疊.因此,在較低的鹽酸胍濃度Chemical Eninering of Chinese Uniersities , 2002, 16(3):下單純增大甘油濃度不能使復(fù)性收率明顯提高,同時(shí)306--310( in Chinese).甘油不抑制溶菌酶分子內(nèi)折疊,因?yàn)樵谳^高甘油濃度3] Masahiro Y, Yumi M, Ayumu s, et al. Etect of aditives下繼續(xù)提高甘油濃度,復(fù)性收率并無顯著變化(見圖2on refolding of a denaturated protein[J]. Biotechnol Prog ,與圖3).1998, 14: 601- -606.綜上所述,甘油和鹽酸胍在促進(jìn)變性溶菌酶復(fù)性[4] Goldberg M E, Rudolph R, Jaenicke R. A kinetic study of過程中具有協(xié)同的作用,即二者的作用是加成的.而乙the competition between renaturation and aggregation during酰胺等4種添加劑和鹽酸胍促進(jìn)變性溶菌酶復(fù)性的作the refolding of denatured-reduced egg white lysozyme[J].Biochemistry, 1991, 30; 2790- 2 797.用機(jī)理相同,即二者可以相互替代5] Shi Jinhui, Dong Xiaoyan, Sun Yan. Efeet of guanidiniumchloride concentration on the refolding of denaturated lyso-3結(jié)語zyme[J]. Acta Biochimica of Biophysica Sinica, 2001, 33(4): 447- 451( in Chinese).精氨酸、乙酰胺、丙酮、硫脲及甘油均能有效促進(jìn)[6] Johannes B, lra P, UIrich B. A mehod for increasing the變性溶菌酶復(fù)性,并且都存在最佳的添加濃度使變性yield of properly folded recombinant fusion proteins : Single-溶菌酶的復(fù)性收率最大.但乙酰胺等鹽酸胍類似物在chain inmunotoxins from rfolding of bacterial inclusion促進(jìn)復(fù)性中,與鹽酸胍具有相同作用,因而在降低復(fù)性bodies[ J]. Analytical Biochemistry, 1992, 205: 263- -270.液中鹽酸胍濃度的同時(shí),適當(dāng)提高乙酰胺等濃度即可[7] Maeda Yoshitake, Yamada Hidenori, Ueda Tadashi. Efet獲得較高的復(fù)性收率.而甘油與鹽酸胍則存在協(xié)同作of additives on the refolding of reduced lysozyme in the pres-用,只有在- -定濃度的鹽酸胍存在下,添加適量的甘油enceof4 M urea[J]. Protein Engineering, 1996,9(5):461- 465.才能獲得較高的復(fù)性收率.中國煤化工MYHCNMHG