2010No7160- Serial No 220China BrewingExperience Exchanges甜菜制燃料乙醇生產(chǎn)工藝的研究李魁,路洪義2(1河南工業(yè)大學(xué)糧油重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室與工程中心,河南鄭州45002;2河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院河南鄭州450052)摘要:以甜菜為原料采用固定化酵母細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇。所得最佳工藝條件為培養(yǎng)液糖濃度為16%,硫酸銨05gL磷酸二氫鉀008gL,硫酸亞鐵0004g,a-淀粉酶用量為5Ug,糖化酶用量為150Ug,發(fā)酵液適宜pH值為45,固定化凝膠顆粒填裝量為50%發(fā)酵醪酒精度為12.3%vol,總糖利用率9691%關(guān)鍵詞:甜菜;固定化細(xì)胞;酒精發(fā)酵中圖分類號(hào):TQ9206文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B文章編號(hào):0254-5071(2010)07-016003Processing technology of fuel ethanol with sugar beetLI Kui, LU Hongy?(. Key Laboratory of Grain Oil and Engineering Centre in Henan University of Technology, Zhengzhou 450052, China,2. College of Bioengineering, Henan University of Technology, Zhengzhou 450052, China)Abstract: Fuel ethanol was produced using sugar beet as the raw material by immobilized yeast fermentation. The optimum procedures were asfollows: concentration of sugar in medium was at 16%, and the optimum addition of inorganic salts were: ammonium 0.5 g/L, potassium dihydrogenphosphate 0.08 g/L, ferrous sulfate 0.004 g/L. addition of a-amylase was 5w/g glucoamylase 150 U/g. Adjusting pH to 4.5 and filling rate of the gelparticles was 50%. Concentration of alcohol in fermentation broth was 12.3 %(v/v)and the utilization of total sugar was 96.91%.Key words: suger beet; immobilized cells, alcoholic fermentation甜菜( Beta vulgaris)又名菾菜,屬藜科(F固定化酵母細(xì)胞活化增殖培養(yǎng)基:葡萄糖20g,玉米Chenopodiaceae)甜菜屬( Genus beta)。原產(chǎn)于歐洲西部和漿液30mL,硫酸銨0.5g,磷酸二氫鉀002g,硫酸亞鐵南部沿海,是除甘蔗外的一個(gè)主要糖源也是我國的主要003,加水至1000mL,常規(guī)高壓滅菌后冷卻吸氧備用糖料作物之一。玉米漿液的制備:L水中加入30g玉米粉,加熱為甜菜塊根的主要化學(xué)組成成分分析表明,總糖173%,水(0±2)℃,加入a淀粉酶液化35mim,冷卻降溫至(55±2)℃,分75%纖維素、半纖維素33%,果膠質(zhì)23%蛋白質(zhì)及其加入糖化酶糖化50min,即為玉米漿液。他含氮物質(zhì)15%,灰分0.6%由于甜菜生物學(xué)產(chǎn)量和含糖分批發(fā)酵培養(yǎng)基:甜菜原漿、玉米漿液和硫酸銨用自量較高,也是目前世界新興的、具有很大發(fā)展?jié)摿Φ娜剂蟻硭涑刹煌瑵舛?升溫至90℃后加入a-淀粉酶液化,然乙醇生產(chǎn)原料之后冷卻為(50±2)℃,調(diào)pH值為35,添加果膠酶水解其中的目前,我國酒精工業(yè)多以糖蜜原料或淀粉水解液進(jìn)果膠,2h后加糖化酶糖化。糖化醪經(jīng)過濾、常規(guī)高壓滅菌行酒精發(fā)酵,本研究重點(diǎn)考察了固定化酵母細(xì)胞的方法,后冷卻吸氧備用。對(duì)影響甜菜酒精連續(xù)發(fā)酵工藝的各種因素進(jìn)行了探討,連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基:依照分批發(fā)酵確定的最佳培養(yǎng)基確定了甜菜制燃料乙醇的最佳工藝技術(shù)條件,并為我國配方按照分批發(fā)酵培養(yǎng)基制備方法制備。燃料乙醇工業(yè)的發(fā)展探索出一條新路。12研究方法1材料與方法1.2l酵母菌細(xì)胞的固定化11材料將適量活性干酵母置于30℃無菌水中化開后,按比例酒精活性干酵母:“安琪牌耐高溫活性干酵母;甜菜:與含有06%海藻酸鈉的6%聚乙烯醇水溶液混勻,再用注由山西金利緣生物制品有限公司提供a淀粉酶(酶活力射器逐滴滴入含1%氯化鈣的5%硼酸液中,制成直徑為為20000L)、糖化酶(酶活力為000o):隆大生物3m左右的固定化凝膠顆粒固化50min,濾出固定化凝工程有限公司生產(chǎn);聚乙烯醇QPVA-124):日本進(jìn)口國內(nèi)膠顆粒,用生理鹽水洗滌3次浸入無菌水中備用。分裝;海藻酸鈉(化學(xué)純):上海市上?；瘜W(xué)試劑站分裝廠122固定化酵母細(xì)胞的增殖出品;無水氯化鈣(分析純):北京市北京紅星化工廠出品。將固定化酵母細(xì)胞凝膠顆粒用無菌水浸洗5次,加入收稿日期:201003-17作者簡(jiǎn)介:李魁1952)男教授研究方向?yàn)槭称放c發(fā)酵工程。[8]莊名揚(yáng)再論美拉德反應(yīng)產(chǎn)物與中國白酒的香和味門釀酒科技,⑨程偉沈毅,卓毓崇等.低度醬香郎酒生產(chǎn)工藝研究及展望2005(5):3438酸酒科技,2007(8):88-922010年第7期經(jīng)驗(yàn)交流中國釀造總第220期4161同體積的固定化酵母活化增殖培養(yǎng)基,于30℃、120rmin通以糖濃度16%玉米漿液用量為30m幾為固定值,設(shè)氣振蕩培養(yǎng),13h后酵母細(xì)胞開始增殖。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間至24h計(jì)硫酸銨濃度分別為0.3g/L、0.4gL、0.5gL、0.6g、0.7gL、時(shí),游離酵母數(shù)為3.8×10個(gè)/mL以上,即完成增殖過程0.8g/L的6個(gè)試驗(yàn)組,進(jìn)行酒精發(fā)酵作為硫酸銨添加量的123酒精分批發(fā)酵優(yōu)選,結(jié)果見表2以分批發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)游離細(xì)胞、固定化細(xì)胞進(jìn)行酒精分批發(fā)酵發(fā)酵溫度30℃,發(fā)酵時(shí)間72h表2硫酸銨添加量對(duì)甜菜酒精發(fā)酵的影響Table 2. Effect of addition of ammonium sulphate on alcoholic1.24固定化生物催化劑酒精連續(xù)發(fā)酵fermentation with sugar beet將備好的連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基用蠕動(dòng)泵恒速輸入固定化硫酸銨濃度(g1)030405060708生物反應(yīng)器中,控制發(fā)酵溫度30℃,在糖化醪流加速率為蒸餾酒精度%vo16975201188173160165mLh、停留時(shí)間32h和稀釋速率0165h條件下進(jìn)行酒發(fā)酵醪酒度%v10213122120117109精連續(xù)發(fā)酵還原糖/(g"L)1931861.391431.5215713分析檢測(cè)方法殘總糖/(gL240237233236243245發(fā)酵醪中總糖和還原糖的測(cè)定:Lanc- Eynon法;酒精度的測(cè)定間:將三角瓶中的發(fā)酵成熟醪置于500mL蒸餾燒由表2可知硫酸銨添加量以0.5gL為宜。低于0.5gL瓶中,量取100mL的蒸餾水清洗3角瓶,將清洗液倒入蒸時(shí)可能因氮素營養(yǎng)供應(yīng)不足而造成酵母發(fā)酵不良;而硫酸餾燒瓶中,裝上冷凝管,用10mnL量筒作接受器進(jìn)行蒸餾,銨添加量>05gL時(shí),可能因氮素營養(yǎng)過剩而引起酵母增收集餾出液100mL,控制酒溫20℃用酒精計(jì)直接讀數(shù)。發(fā)殖過快發(fā)生早衰,其發(fā)酵結(jié)果亦不理想。酵醪酵母細(xì)胞數(shù)的測(cè)定:血球計(jì)數(shù)板法。21.3硫酸銨與無機(jī)鹽對(duì)固定化酵母細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的影響14簡(jiǎn)要工藝流程固定化酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖與無機(jī)鹽的添加劑量有玉米漿液、硫酸銨著密切的關(guān)系,尤其以甜菜糖為碳源的酒精發(fā)酵,適宜的甜菜→清洗→磨漿→過濾→配料→滅菌→固定化細(xì)胞發(fā)酵→蒸餾無機(jī)鹽可以補(bǔ)充酵母細(xì)胞所需的營養(yǎng),促進(jìn)其生長(zhǎng)繁殖。因此研究選定硫酸銨、磷酸二氫鉀和硫酸亞鐵作為試驗(yàn)殘?jiān)?因素。各試驗(yàn)因素水平見表3。料配料脫水、變性→燃料乙醇表3正交試驗(yàn)因子與水平2結(jié)果與討論Table 3 Factor and levels of orthogonal experimental design2.1培養(yǎng)基配方的確定水平A硫酸銨/(g“L) B KH PO./(gL) C FeSO/(g"L00022]發(fā)酵液糖濃度的確定設(shè)計(jì)發(fā)酵液糖濃度分別為12%、13%、14%15%0016%、17%18%的7個(gè)試驗(yàn)組,進(jìn)行酒精發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束測(cè)定發(fā)酵醪酒精度,結(jié)果見表1。根據(jù)所確定的因素與水平,選擇正交表L39進(jìn)行試表1發(fā)酵液不同糖濃度對(duì)酒精產(chǎn)率的影響驗(yàn),結(jié)果見表4,方差分析見表5。Table 1. Effect of concentration of sugar on yield of alcohol由表4極差數(shù)值(R)可以看出,硫酸銨的添加劑量>糖濃度%12131415161718磷酸二氫鉀>硫酸亞鐵,由此可知,在酵母菌的培養(yǎng)過程發(fā)酵醪酒精度%vol10211,312212.011.710.910.7中,各影響因素主次順序?yàn)榱蛩徜@>磷酸二氫鉀>硫蒸餾酒精度%ol9617126139143142140酸亞鐵,其最佳添加劑量分別為硫酸銨05g/L,磷酸二氫殘?zhí)?(gL)2492072092.022.122532鉀0088L,硫酸亞鐵0.004gL由表5可知, QNHD SO4KH2PD、FeSO43因素引起的由表1可知發(fā)酵液糖濃度為16%時(shí)酒精產(chǎn)率最高。發(fā)偏差平方和分別為0153、0.144和0.133,均方為0765酵液糖濃度高于16%的2個(gè)試驗(yàn)組酒精產(chǎn)率并沒有增加,0072和00665,對(duì)應(yīng)的F值=765、72.0、66.5>F=19,說明檢測(cè)發(fā)酵醪殘?zhí)蔷哂谄渌囼?yàn)組,其原因可能是因?yàn)?因素對(duì)固定化酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯影響。發(fā)酵液糖濃度高而導(dǎo)致發(fā)酵環(huán)境滲透壓偏高、溶氧差,酵2.1.4發(fā)酵培養(yǎng)液最適pH值的確定母細(xì)胞增殖速度緩慢,在限定的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)未能充分利酵母菌適宜在偏酸性環(huán)境中生長(zhǎng),因此,設(shè)計(jì)環(huán)境pH用糖所致值分別為30、35,40、4.5、50、55的6個(gè)試驗(yàn)組。環(huán)境pH值硫酸銨添加量的對(duì)甜菜酒精發(fā)酵的影響見表62010No7162. Serial No 220China BrewingExperience Exchanges表4正交試驗(yàn)結(jié)果表7固定化凝膠顆粒填裝量對(duì)酒精產(chǎn)量的影響Table 4. Resutts of orthogonal designTable 7. Effect of filling rate of gel particles on yield of alcohol試驗(yàn)號(hào)A硫酸銨/ B KH PO C FesO細(xì)胞數(shù)/凝膠顆粒填裝量/%(gL)(gL)(g“L)《xl0個(gè)mL)蒸餾酒精度/%vo20.921.32252222170.002由表7可知,當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃、固定化凝膠顆粒填裝量為50%時(shí),酒精的產(chǎn)量較其他試驗(yàn)組高。因此,固定0.0041.12化凝膠顆粒填裝量應(yīng)以50%為宜。23固定化酵母細(xì)胞酒精連續(xù)發(fā)酵按照最佳培養(yǎng)基配方將糖化醪泵入生物反應(yīng)器中在糖化醪流加速率為169mL/h停留時(shí)間為31h、稀釋速率為0155h條件下進(jìn)行酒精發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后,取成熟發(fā)KKK2088的42.732.59酵醪作各項(xiàng)發(fā)酵指標(biāo)測(cè)定,結(jié)果見表8。3.032.782.84265表8固定化酵母細(xì)胞酒精連續(xù)發(fā)酵結(jié)果Table 8. Resutts of continuous alcoholic fermentation游離細(xì)胞數(shù)游離細(xì)胞游離細(xì)胞醪液酒精殘總糖/殘還原糖表5方差分析結(jié)果(個(gè)·mL)出芽率%死亡率%度%vol(gL)(gL)Table 5. Results of variance analysis39×103未檢出131260.65因素偏差平方和自由度均方F值顯著性NHSO40.153顯著由表8可知,研究成熟發(fā)酵醪液殘余總糖和殘余還原2222720顯著糖含量均較低,游離細(xì)胞數(shù)較常規(guī)發(fā)酵低1個(gè)數(shù)量級(jí)以上Feso顯著總糖利用率高達(dá)9691%,充分表明了固定化酵母細(xì)胞酒0002精連續(xù)發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)。表6環(huán)境pH值對(duì)甜菜酒精發(fā)酵的影響24聚乙烯醇(PVA)凝膠顆粒穩(wěn)定性的確定Table 6. Effect of pH on alcoholic fermentation with beta vulgaris研究連續(xù)發(fā)酵30d后終止,用蒸餾水連續(xù)清洗3次固定檢測(cè)項(xiàng)目pH值化凝膠顆粒,然后對(duì)其檢查,未發(fā)現(xiàn)有破損現(xiàn)象凝膠顆粒303.54.04.5505.5仍具有良好的機(jī)械強(qiáng)度。由此表明以聚乙烯醇(PVA)為蒸餾酒度%vol17318920220.5197182載體的共固定化方法是可行的發(fā)酵醪酒度%vol1211.712512.712011,3殘還原糖/gL0909309090909參考文獻(xiàn):殘總糖(gL2n21262622692余小軍以甜菜為原料酒母長(zhǎng)條件的研究門釀酒科技,199(4):27-28由表6可知醪液pH值對(duì)酒精發(fā)酵有一定影響。當(dāng)醪史淑芝程大友馬風(fēng)鳴等生物質(zhì)能源作物能源甜菜的開發(fā)利用液pH值為4045時(shí),酒精發(fā)酵效果良好,出酒率髙于其中國農(nóng)學(xué)通報(bào)2007,(11:4164193]王克明,王雪筠固定化雙菌種發(fā)酵乙酸的研究門中國釀造,1995他試驗(yàn)組。由于糖化酶的最適pH值為4045,發(fā)酵過程隨即調(diào)整醪液pH值可以提高糖化酶糖化效率。當(dāng)環(huán)境pH黃祥斌于淑娟制糖工藝中的淀粉檢測(cè)研究門]中國甜菜糖業(yè),2001值低于或高于4045時(shí),則不利于酵母的發(fā)酵作用,產(chǎn)酒率較低。[5]孫長(zhǎng)平段鋼.酒精工業(yè)中的新型酶制劑及其應(yīng)用技術(shù)門酸酒22固定化酵母細(xì)胞凝膠顆粒填裝量的確定2007,34:73-806]賈樹彪,李盛賢,吳國峰新編酒精工藝學(xué)[M北京:化學(xué)工業(yè)出版設(shè)計(jì)酵母菌固定化凝膠顆粒填裝量為30%、40%、社50%60%709%的5個(gè)試驗(yàn)組。發(fā)酵溫度30℃發(fā)酵時(shí)間72h,7 DORFLER, Applied Bioethanol Technology in Brazil [] Sugar In-結(jié)果見表7。dustry,2007,132:694697《中國釀造》2009年被評(píng)為中國科技核心期刊