科學研究食品研究與開發(fā)2009年12月B第3卷第12期桑黃多糖的提取工藝戈延茹,曹恒杰,張曉蘭,卞炯,姜樹紅,吉順莉,張春燕(江蘇大學藥學院,江蘇鎮(zhèn)江212013)摘要:篩選出桑黃多糖最佳提取工藝。采取正交設(shè)計試驗優(yōu)選桑黃多糖提取工藝;通過對醇沉法、殼聚糖吸附法的比較,選出最佳精制工藝。桑黃多糖最佳提取工藝為:按1:14的料水比進行浸泡12h,然后在100℃恒溫下,進行30min超聲提取,重復提取3次。精制方法采用殼聚糖吸附法。關(guān)鍵詞:桑黃;多糖;正交設(shè)計;含量測定TUDY ON THE OPTIMUM EXTRACTION AND PURIFICATION TECHNOLOGY FOR POLYSACCHARIDES FROMPHELLINUS IGNIGARIUSGE Yan-ru, CAO Heng-jie, ZHANG Xiao-lan, BIAN Jiong, JIANG Shu-hong, JI Shun-li, ZHANG Chun-yan(School of pharmaceutical science, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, Jiangsu, China)Abstract: Choose the best preparation of the Phellinus igniarius polysaccharide. The best extraction method ofthe polysaccharide was determined by orthogonal design; Through the compare of the ethanol extraction andchitosan absorbing purification, choosing the best extraction method. The best extraction method of thepolysaccharide of the Phellinus igniarius was: At first, the Phellinus igniarius was soaked in water about12 hours, and then when the temperature of extraction was 100 C, the solvent-water and the material is 14: 1extract 3 times during 30 min in supersonic wave. The chitosan absorbing purification was used to extractpolysaccharide. Conclusion: the Phellinus igniarius polysaccharide extracted through the best method was verypure, and the proportion is 1.46 % which means that extracting 1.46 g pure polysaccharide of the phellinus作者簡介:戈延茹(1960-),女(漢)教授博士在讀,從事中藥制劑與質(zhì)量控制技術(shù)研究。而且上下波動,沒有明顯的抑制或激活效果,參照數(shù)據(jù)鉬酸銨則是比較理想的激活劑?？傮w上看,它不屬于抑制劑。鉬酸銨對醛脫氫酶的抑制效果較為明顯,是一個抑制劑,抑制效果隨其濃度的參考文獻:增加而逐漸增加,但是,在0.5%-0.7%之間的抑制強[江波濤,黃玉賢,孟淑珍,等牛奶保鮮的幾種方法門畜產(chǎn)品加度較強,從總體上看,它的抑制效果比較穩(wěn)定,沒有上工,1997,12(6:57下波動。2]王敏常喝牛奶好處多四川奶業(yè),2007,2(2)233]孫繼明楊新春黃嘌呤氧化脫氫酶與心血管疾病中華老年心腦血管病雜志,20066(6:63結(jié)論4]皮付偉近紅外光譜技術(shù)在牛奶體細胞奶酪和奶粉成分中的應牛奶中醛脫氫酶的最適溫度為35℃;最適pH為用研究J食品工業(yè)科技,200,(10):15370;最適底物濃度為05%。相應的動力學參數(shù)Km=巧韋莉莉水牛奶乳酸脫氫酶同工酶研究廣西農(nóng)業(yè)科學,95,300063moL,vmax=00360Dmin。因此,其動力學中國煤化工的影響中國杜區(qū)醫(yī)方程為:V= 0.0361sL-(U/min)7]吳CNMH龍江略東濱地圖出版0063+社,2002:146硝酸鈣和硫脲是比較理想的抑制劑,而硝酸鉀和收稿日期:20007-102009年12月第30卷第12期食品研究與開發(fā)科學研究igniarius per 100 g crude drug.Key words: Phellinus igniarius; polysaccharide; orthogonal design; the determination of the content桑黃是一種珍貴的藥用真菌叫研究發(fā)現(xiàn)桑黃含有加適量去離子水溶解,轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中,加水多糖、甾醇類物質(zhì)、三萜類芳香酸氨基酸、酶和黃酮至刻度,搖勻配成濃度為0106g的標準葡萄糖溶等多種成分,具有極高的藥用價值如抗癌、抗纖維化、液備用。增強免疫力、抗血管增生、降血糖等吲。目前國外特別2.2.25%苯酚試劑的配制是韓國和日本對其研究的很多,其抗癌效果顯著,是取苯酚100g,加鋁片0.1g和 NaHcO3005g,蒸一種極具開發(fā)價值的珍貴藥用真菌;而桑黃無毒副作餾,收集182℃餾分稱取75g加去離子水150mL溶用因此也是開發(fā)保健食品的重要原料明。桑黃不僅可解,置棕色瓶內(nèi)備用。以用于制藥和生產(chǎn)健康食品,還可做為養(yǎng)顏、抗皺、防223標準曲線的制作衰老的活性成分添加到護膚保健產(chǎn)品中。精確量取上述葡萄糖標準溶液0.1、0.2、0.40.6多糖在抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、降血糖、抗病08、1.0mL,置于干燥潔凈試管中,分別加去離子水使毒等方面具有重要活性作用,而多糖是桑黃的主要成其成1.0mL,再分別加入5%苯酚溶液20mL,搖勻;分,為了很好的利用這一寶貴資源,本試驗對桑黃多然后加人濃HSO470mL,充分搖勻,室溫放置25min糖的提取精制進行了進一步的研究。在490nm波長處測定吸光度值,同時做一空白試樣以吸光度值對葡萄糖濃度做線性回歸,得回歸方程為:1儀器與試劑Y=0072017X+0022317(r=09994,n=6),葡萄糖在11儀器1.0mg/L~100mg/的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。UV-7502PC紫外可見分光光度計:上海欣茂儀器有限公司;真空干燥箱:江蘇東臺電器廠;KQ-250B3桑黃多糖提取工藝的選擇型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;HH-S數(shù)3.1制定考察因素和水平間顯恒溫水浴鍋:江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;SHZ-DⅢ循根據(jù)文獻調(diào)研及數(shù)理統(tǒng)計設(shè)計正交試驗方案,以環(huán)水式真空泵:鞏義市英峪予華儀器廠;電動攪拌器桑黃多糖粗得率為考察指標進行試驗,當采取水提取電機:金壇市中大儀器廠; BUCHI Rotavapor R-200&時,提取溫度(A)超聲時間(B)料液比比值(C)對試BUCHI Heating Bath B-490減壓蒸餾儀;H605超聲驗結(jié)果有影響所以本試驗采用這三者作為因素各取清洗機:無錫市超聲電子設(shè)備有限公司;80-2離心沉三個水平進行正交試驗。因素水平見表1,正交試驗結(jié)淀機:上海躍進醫(yī)療器械廠;DL-5低速離心機:上海果見表2,方差分析結(jié)果見表3。AN Ting科學儀器廠;電子天平 Sartorius Ltd;切片機表1因素水平表系列、中藥粉碎機:上海淀久中藥機械制造有限公司。Table 1 Levels of factors1.2材料與試劑水平溫度超聲時間min料液比/gg桑黃(吉林延吉);殼聚糖:浙江永躍海洋生物有Levels Temperature/C Ultrasound time/min Liquid-solid ratio限公司;葡萄糖(AR):中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司;其它試劑均為分析純。l:14表2正交試驗結(jié)果2含量測定Table 2 Results of orthogonal test21多糖的含量測定方法CD空列y%硫酸-苯酚法是根據(jù)多糖在濃硫酸水解作用下產(chǎn)生單糖,并與苯酚發(fā)生顯色反應的原理測定多糖濃度,中國煤化工490mm處吸收值與糖含量呈線性關(guān)系。22制備標準曲線CNMHG221葡萄糖標準溶液的配制精確稱取干燥恒重(10℃)的葡萄糖00106g,科學研究食品研究與開發(fā)2009年12月第30卷第12期續(xù)表2正交試驗結(jié)果4桑黃多糖精制工藝的選擇明ontinue table 2 Results of orthogonal test41桑黃的提取與含量測定稱取桑黃約100g按最佳提取方案提取,重復提I%584614622681取3次,提取液過濾,合并濾液濃縮至約400mL將其6.17倒入500mL的容量瓶中,定容,搖勻備用;從中吸取3份提取濃縮液,每份10mL,置于100mL容量瓶定容Ⅱ禪蜘/%2057231720302.113后搖勻;精確吸取1mL至25mL容量瓶內(nèi),定容即得%2.4632.103水提濃縮液供試品。用22.3的方法測其吸光度值,如05160.27003330.187表5所示。注:指標y選擇為粗多糖得率的多少。由表2正交試驗結(jié)果和極差分析可知影響桑黃表5桑黃粗多糖得率表Table 5 Yield of Phellinus linteus ribble Polysaccharide table粗多糖提取諸因素的主要順序為溫度(A)料液比(C)、編號吸光度濃度(myL)粗多糖得率%平均值/%超聲時間(B);確定最佳工藝條件為ABC3,即桑黃粉N. Absorbance concentration/(mgy)Yid% Average val碎過篩后,按1:14(gig)的料液比進行浸泡12h,在10.208257832D.197100℃恒溫下,進行30min超聲提取,最后進行過濾提2.1630.19123423取濾液;重復此操作3次,合并濾液進行濃縮后精制。注:W=1003300g喪3方差分析表Table 3 Analysis of variance tabl由此可知,由正交設(shè)計方案選出的最佳提取方案因素偏差平方和自由度F比Fa臨界值顯著可行,100g桑黃粗多糖提取率約為216%Factors Sum of square Df F Critical value Sig.42醇沉法精制20.4422取3份41中濃縮提取液,每份10mL分別加入B0.119420.119420695%的乙醇,使乙醇濃度達到70%,冰箱內(nèi)靜置24h,C0.1949019493.3500581過濾再用95%的乙醇沉淀,使醇濃度達90%,過濾程序如圖6所示。由表3方差分析結(jié)果可知,各因素對試驗結(jié)果的影響程度是溫度>料液比>時間,溫度有顯著性差異0mL濃縮桑黃水提液32桑黃粗多糖得率的測定70%醇沉24h稱取9份約50g桑黃,以最優(yōu)工藝條件提取提取后于250mL容量瓶定容,搖勻;精確吸取2mL到濾渣(蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)等雜質(zhì),棄去)25mL容量瓶定容,搖勻;按照223方法測定吸光度濾液按下式計算多糖得率%:多糖得率=(CxDW)×100%90%醇沉24h式中:C為樣品溶液中多糖的濃度,(g/mL);D為樣品溶液的稀釋倍數(shù)W為稱取桑黃的重量,go結(jié)果濾液(小分子雜質(zhì)棄去)濾渣(總多糖)見表4。表4桑黃粗多糖得率表Table 4 Yield of Phellinus linteus ribble Polysaccharide table進行定容測濃度編號桑黃重量g吸光度濃度八mgL)多糖得率/%圖6醇沉法精制圖tration/(mg/L) Yield/%Fig 6 Ethanol extraction0.2403.0227將濾渣即精制多糖定容至100mL容量瓶內(nèi),搖25.02430.247l19勻;吸取5mL定容至25mL,搖勻;按223的方法進3500260.2563.244802252.8144行含中國煤化工55.017803164.0780CNMHG65.03580.24043.1元秉吸附例配直75035803154.06412.528502260.308將殼聚糖用1%的醋酸溶液配成1%的溶液;即8558稱取約1g的精制殼聚糖粉末用100mL的去離子水2009年12月食品研究與開發(fā)科學研究60第30卷第12期表6醇沉法多糖精制得率表10.80%殼聚糖吸附法的得率為6752%,所以后者精Table 6 Yield of polysaccharides in the method of alcohol制效果較好。al stagnation Extraction編號吸光度濃度mgu)重蠶加ng多糖精刮率%平均值A(chǔ)bsorhance Concentration(mg/lYe% Average value%5討論1l342567101)植物多糖近年來越來越被人們所重視,其廣泛12314存在于動物細胞膜、植物和微生物細胞壁中,是構(gòu)成生注:W糖糖=6.22g/L·10mL=6122mg命的四大基本物質(zhì)之一。經(jīng)過研究由于其具有多種功效,因此對多糖的研究已成為醫(yī)藥食品界的熱門領(lǐng)域。溶解,搖勻;再慢慢加入1mL的純冰乙酸,用力搖勻,2)正交設(shè)計是有效的試驗設(shè)計方法,通過它們的于65℃下恒溫水浴放置,待其成為澄清透明的溶液,應用既可以節(jié)約大量時間,又可以較好的達到試驗目放于冰箱中待用。的越來越多的應用于科學實驗43,2殼聚糖吸附劑用量確定3)本試驗含量測定方法采用目前國內(nèi)應用較多取20份濃縮桑黃水提液每份5mL,置于干燥潔的苯酚一硫酸法,機理為:多糖在硫酸作用下先水解成凈的試管中,加入殼聚糖吸附劑充分搖勻,置于冰箱單糖并迅速脫水生成糖醛化合物,在490mm左右有中靜置24h;然后經(jīng)兩次離心后,上清液倒入20支干較大吸收,具體測定波長可根據(jù)掃描結(jié)果得到。燥潔凈試管中,比較一下經(jīng)殼聚糖吸附以后溶液的澄4)通過本次試驗,優(yōu)選出最佳桑黃多糖提取精制明度。工藝:通過正交試驗得出最佳提取工藝為按114的料最后判定:在每5mL桑黃濃縮水提液中加入水比進行浸泡12h,然后在100℃恒溫下,進行30min35滴(約18mL)殼聚糖溶液精制后的溶液澄明度最超聲提取;兩種精制方法比較,醇沉法的多糖損失較好,即按這種比例進行精制得到的多糖較純。多,而殼聚糖能夠在溶液中形成立體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),網(wǎng)住4.3.3殼聚糖吸附法精制工藝蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)所以殼聚糖法精制效果比較好。取2份桑黃濃縮水提液每份70mL(由于500mL濃縮液用量有限),按比例加入殼聚糖吸附劑490滴參考文獻(約25mL),置60℃恒溫水浴上加熱并以攪拌速度11劉波中國藥用真菌M太原山西人民出版社197471-73為100rmin攪拌15min,放置至澄清為止,離心過2)江蘇新醫(yī)學院中藥大詞典M上海:上?？萍汲霭嫔?995濾濾液置250mL容量瓶中定容,搖勻;在第一號容1徐雙陽桑黃多糖提取分離純化及理化性質(zhì)研究浙江工業(yè)大學2006量瓶中精密吸取1mL于25m容量瓶(I)中定容,王莉魯建江劉志勇微波輔助提取紅景天根多糖及含量測定的搖勻;繼續(xù)從一號容量瓶中精密吸取2mL置于25mL研究小中醫(yī)藥學刊,2002,202)227-253容量瓶(Ⅱ)中定容搖勻;接著從二號250mL容量瓶群鄭麗伊方積年改良的苯酚一硫酸法測定多糖和寡糖的研中精密吸取1mL置于25mL容量瓶(Ⅲ)中定容,搖究中國藥學雜志,1996,31(9550勻;用223的方法測其吸光度值,如表7所示。6]周永治馬志慶醫(yī)藥數(shù)理統(tǒng)計M]北京:科學出版社20047]段丹丹紅景天分散片制備工藝的研究門江蘇大學學報200,17表7殼聚糖吸附法多糖精制得率表(5):403-406Table 7 Yield of polysaccharides in the method of chitosan8]吳瓊李三鳴姜愛萍等紅景天提取液精制工藝的考察印時珍stagnation Extraction國醫(yī)國藥2005,165):395-396編號吸光度濃度(叫)重址a多糖猜制率%平均值%9]賀蕊劉保琴鐘紅玲等ZTC1+1澄清劑法與水醇法制備荊防口Average value%服液的比較研究中草藥1998,2911734-73546612291336798[10] Gi-Young Kim, Hyung-Sik Park, Byong-Hyok Nam. PurificationⅡ281916578and characterization of acidic proteo-heteroglycan from the fruiting47167body of Phellinus linteus(Berk. &M.A. Curtis)Teng J]. Bioresource注:W=70ml×6122(gL)=42854Technology 2003, 89(1): 81-8644精制多糖含量的比較嗎由表6和表7的結(jié)果可知醇沉法的多糖得率為中國煤化工收稿日期:200302CNMHG