第31卷第6期同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)Vol.31 No.62010年12月JOURNAL OF TONGJI UNIVERSITY (MEDICAL SCIENCE)Dec.。2010doi: 10. 3969/j iss108 -0392. 2010.06. 006， 基礎(chǔ)研究●基于聚乙二醇-聚乳酸-聚乙二醇水凝膠的兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞三維培養(yǎng)孫俊，徐紅珍,蘇儉生(同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院修復(fù)科,上海2002)[摘要]目的研究新型可注射溫度敏感型聚乙二醇聚乳酸-聚乙二醇水凝膠[ poly ( ethylene glycol )-poly(psilon-caprolactone)-poly( ethylene glycol), (PEG-PCL-PEG, PECE)]的生物相容性,探討其做為細(xì)胞三維培養(yǎng)材料和組織工程支架的可行性。方法將 兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞( bone marow mesenchymal stem cells, BMSCs)接種于水凝膠,體外共同培養(yǎng)后進(jìn)行形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察,用MTT法檢測BMSCs增殖活性,DAPI和EI試劑盒觀察細(xì)胞存活和凋亡情況。結(jié)果BMSCs 在PECE水凝膠中生長及功能均比較理想。DAPVEI染色見少量紅色熒光,顯示僅有少量細(xì)胞凋亡。結(jié)論可注射溫度敏感性 PEG-PCL-PEG水凝膠生物相容性好,是一種良好的三維培養(yǎng)材料,可作為種子細(xì)胞的載體應(yīng)用于組織工程中。[關(guān)鍵詞]水凝膠;骨髓基質(zhì)干細(xì)胞;三維培蕎[中圖分類號]R24 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A[文章編號] 1008 -0392(2010)06 -0023 -053-dimensional culture of rabbit bone marrow mesenchymal stem cellsin poly ( ethylene glycol ) -poly ( epsilon-caprolactone)-poly ( ethylene glycol) hydrogelSUN Jun, XU Hong -zhen, SU Jian-shen(Dept. of Prosthetics, Stomatology Hospital, Tongji University School of Medicine , Shanghai 200072, China)[ Abstract] Objective To study the biocompatibility of a novel thermosensitive injectable [ poly(ethyene glycol )-poly ( epsilon-caprolactone )-poly ( ethylene glycol), PEG-PCL-PEG ( PECE)]hydrogel and investigate the possibility of PECE hydrogel as scaffold materials in tsse engineering.Methods BMSCs were cultured in PECE hydrogels in vitro , cell morphology was investigated andfunction cell proliferation was observed with MTT method, cell apoptosis were measured by usingDAPI/EI kit. Results BMSCS cells were attached and extended well on hydrogel , cell viabilitywere not affected. DAPI/EI double staining showed litle red fluorescence , which implied smallamount of apoptosis when cells were cultured in hydrogel. Conclusion The injectable thermosensitivehydrogel is of good biocompatibility, and can be used as a scaffold material and the carriers of seed中國煤化工收稿日期: 2010-08 -20基金項目:上海市科委資助項日(0852m03600)CHCNMHG作者簡介:孫俊( 1986- ). 男,碩土:研究生. E-mail; sunjun-os@ hotmail. cou通信作者:蘇儉生. E-mail: ts197118@ yahoo. com. cn●23.同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)第31卷cells in tissue engineering.[Key words] hydrogel; BMSCs; 3-dimension culture傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)是二維環(huán)境中進(jìn)行的,其不同1.3 BMSCs的培養(yǎng)與傳代于活體內(nèi)同細(xì)胞外基質(zhì)共同構(gòu)成的三維立體環(huán)境。取1個月齡新西蘭大白兔1只,注射空氣處死。因此,細(xì)胞表現(xiàn)出的生物學(xué)行為與體內(nèi)存在較大差75%酒精浸泡消毒15 ~20 min,在無菌環(huán)境下取出四肢異。隨著組織工程學(xué)的發(fā)展,多種新型高分子聚合骨,去除附著在骨上的肌肉,筋膜等軟組織,反復(fù)用材料被應(yīng)用于組織細(xì)胞的三維立體培養(yǎng)"。水凝PBS與DMEM培養(yǎng)液沖洗,剪去骨兩端,用含有適量膠[2是一種能迅速吸收,并保持大量水分而又不溶肝素(625 U/ml)的DMEM液沖洗骨髓腔。獲取的骨于水的生物材料,具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),是- -類集吸髓液分別經(jīng)不同直徑大小的注射器針頭過濾制成單細(xì)水保水、緩釋于一體的功能高分子材料,和生物體胞懸液,注人含有等體積Percoll(1.073 g/L)分離液的內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)相仿。在過去的幾年內(nèi),水凝膠被廣離心管中,離心半徑10 cm,2 500 r/min,離心20 min,收泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,包括藥物緩釋體系構(gòu)建,移集中間云霧狀細(xì)胞層,再以LG-DMEM液洗滌細(xì)胞,半植材料和組織工程(34)。其中,溫度敏感型水凝膠由徑10 cm,1000 r/min,離心5 min,重復(fù)2遍,去除多余于能感受外界環(huán)境微小變化和良好的生物相容性被的脂肪細(xì)胞及組織液。加人適量含雙抗的10%胎牛血廣泛研究[56)。新型溫敏型可注射水凝膠( PECE)[7+]清LG-DMEM培養(yǎng)液吹打制成細(xì)胞懸液，計數(shù)并調(diào)整具有生物相容性好、溫度敏感性好、成膠速度快、可細(xì)胞密度為1x10* L-' ,接種于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶中,完全降解降解速度可調(diào)控、孔徑大小可控、可控釋于37 C、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和適度條件培養(yǎng)箱生物活性大分子等優(yōu)點。本研究采用BMSCs與中培養(yǎng)。48 h后首次換液,棄去未貼璧或已死去的細(xì)PECE進(jìn)行三維立體共培養(yǎng),研究水凝膠的生物相胞,以后每3d換液- ~次。至10~12 d貼壁細(xì)胞融合為容性,以探討其構(gòu)建三維培養(yǎng)基及作為組織工程支單層時,用胰蛋白酶按1:2消化傳代。1.4 細(xì)胞的三維培養(yǎng)架的可行性。將25 ml培養(yǎng)瓶中傳至第3代的細(xì)胞用0. 25%胰1材料與方法酶消化后轉(zhuǎn)人離心管中，以半徑10 cm,1 500 r/min離心10r/min,棄上清,用液態(tài)水凝膠將細(xì)胞吹打混1.1 試劑及儀器.胰蛋白酶( Hyclone公司),胎牛血清( Gibco公勻,備用。將10%培養(yǎng)基于37 C水浴鍋中預(yù)熱,置于培養(yǎng)皿中,迅速將吹打混勻的細(xì)胞與水凝膠混合物滴司)、RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司), MTT試劑人培養(yǎng)皿中然后置于37 C、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育,( Sigma公司) ,CO2培養(yǎng)箱( New Brunswick Scientific用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞在材料中的生長情況。公司) ,倒置相差顯微鏡( Nikon) ,Microplate Reader1.5 MTT法檢測ModeBS0 (BIO-RAD公司),熒光顯微鏡,超凈工作當(dāng)細(xì)胞長至80%滿時,用0. 25%胰蛋白酶消臺(蘇州凈化儀器廠) ,96孔平底型培養(yǎng)板(Costar公化,吸管反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度為司) ,細(xì)胞計數(shù)板等。5x 10*/ml,以100 μ/每孔接種于96孔板,即細(xì)胞1.2 水凝膠材料制備密度為5x10'/孔,置于37 C、5% CO2培養(yǎng)箱中孵本實驗所使用的聚乙二醇聚乳酸-聚乙二醇水育。6h后實驗組按不同組別分別加入含DECE水凝膠(PECE) ,由同濟(jì)大學(xué)先進(jìn)材料與納米生物醫(yī)凝膠10~50 μ/ml的培養(yǎng)基,每組設(shè)6個復(fù)孔,對學(xué)研究院提供。PECE 是一種新型可注射的溫度敏照組不加水凝膠邊緣孔用無菌PBS填充,繼續(xù)在感性水凝膠,孔徑為6~11 um, 37 C為其臨界溫37C5垃美第中孵夯10 h待細(xì)胞貼壁匯中國煤化工度,當(dāng)溫度達(dá)到37 C時,60 s內(nèi)水凝膠將轉(zhuǎn)化為固合成MYH加入5 mg/ml的態(tài),當(dāng)溫度低于或超過37C時,水凝膠將逐漸轉(zhuǎn)化MTTCN M H Gg培養(yǎng)液后，每孔為液態(tài)。加入二甲基亞砜(DMSO)液150 μ,室溫下于微孔第6期孫俊等:基于聚乙二醇-聚乳酸聚乙二醇水凝膠的兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞三維培養(yǎng)板振蕩器上振蕩10 min,使結(jié)晶物溶解,在酶標(biāo)儀上選擇波長490 nm檢測各孔的吸光度值(D) ,結(jié)果以O(shè)D實驗組/OD對照組表示。1.6 DAPI和EI法檢測細(xì)胞凋亡情況將PECE水凝膠和BMSCs共培養(yǎng)48 h后,用PBS液洗滌2遍后制成5x10*/ml的細(xì)胞懸液,按圍2 BMSCs 在PECE水凝膠中的相差顯微團(tuán)( x200)DAPI和EI試劑盒說明依次進(jìn)行染色,，在熒光顯微可見長梭形BMSCs被包含在PECE水凝膠中鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。Fig.2 BMSCs in PECE hydrogel under microscopy( x200)1.7統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均用x ts表示,用SPSS14. 0統(tǒng)計軟1件行單因素方差分析( ANOVA),P <0.05為有統(tǒng).8 1計學(xué)意義。6↓0.6 12結(jié)果.4-.2 t2.1 BMSCs 的培養(yǎng)與傳代倒置顯微鏡下觀察分離出的BMSCs形態(tài)呈圓l020 30400PECE濃度(μm)形,約72h后絕大多數(shù)細(xì)胞貼壁,細(xì)胞形態(tài)為梭形、多角形(圖1a),7 ~10 d可達(dá)80%融合,此時細(xì)胞呈圖3 PECE 水凝膠對BMSCs增殖活動的影響Fig,3 Cell vibility when cultured with PECE hydrogel長梭形,傳代細(xì)胞較原代細(xì)胞成長快(圖1b),5 ~7 d基本鋪滿瓶底。2.3細(xì) 胞凋亡情況DAPVEI雙重染色后在熒光顯微鏡下觀察,可見細(xì)胞布滿整個視野。大部分細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,發(fā)出藍(lán)色熒光,僅有少量紅色熒光。48 b后, BMSCs細(xì)胞能夠在水凝膠構(gòu)建的三維環(huán)境中存活和增殖,極少數(shù)細(xì)胞凋亡(圖4)。圖1 BMSCs 培養(yǎng)Fig.1 Culture of BMSCsa:72h(x100);b: I周( x100)BMSCs與PECE水凝膠復(fù)合生長情況BMSCs細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng),貼壁生長良好。傳至第3代時,約鋪滿80%瓶底,用倒置相差顯微鏡觀察,細(xì)胞圖4 DAPV/EI 雙重染色檢測細(xì)胞凋亡情況被包裏在凝膠內(nèi),大多呈現(xiàn)圓形或梭形(圖2)。3dFig.4 Cell apoptosis after DAPI/EI staining of后,大約70%水凝膠降解,在培養(yǎng)皿底部可以看見endothelial cells in bhydrogel部分貼壁細(xì)胞,這可能是水凝膠降解后所釋放出藍(lán)色熒光表示存活細(xì)胞,紅色熒光表示凋亡細(xì)胞來的。.3討論2.2細(xì)胞增殖能力測定MTT法用來研究水凝膠對BMSCs細(xì)胞活性的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞( bone mesenchymal stem cells,影響(圖3)。結(jié)果表明,當(dāng)100 μl細(xì)胞溶液中加入BMSCs)縣日前號細(xì) 織T程帚有臨床應(yīng)用前景的種水凝膠在10~50μl之間時,實驗組和對照組的吸子細(xì)中國煤化工容易體外培養(yǎng)光度比值均在1左右,統(tǒng)計學(xué)分析顯示水凝膠對細(xì)時增死;YHC N M H G達(dá)成骨細(xì)胞表型、胞增殖能力沒有顯著的影響(P>0.05)。植入體內(nèi)可保持成骨活性等優(yōu)點。在本研究中,它●25 .同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)第31卷被用來檢測新開發(fā)的水凝膠作為組織工程材料的可PECE網(wǎng)絡(luò)狀的聚合物鏈具有高度溶脹功能,彈性行性。類似天然組織,它的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有利于氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)在大多數(shù)體外細(xì)胞研究中,細(xì)胞都是在二維的以及其他水溶性代謝產(chǎn)物的交換。它的聚合物能夠培養(yǎng)皿或玻片上生長的,當(dāng)細(xì)胞在二維環(huán)境培養(yǎng)時,在低于37 C時呈溶液狀態(tài),有利于生長因子,細(xì)胞它們的代謝基因表達(dá)模式、胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)以以及其他生物活性分子進(jìn)人其中而成為混合體,而及形態(tài)學(xué)都會發(fā)生改變,這種二維培養(yǎng)模式并不能達(dá)到適當(dāng)?shù)臏囟葧r,它將轉(zhuǎn)變成為固態(tài),產(chǎn)生類似于反映細(xì)胞在體內(nèi)環(huán)境的生物學(xué)功能。細(xì)胞外基質(zhì)的作用。在本實驗中,當(dāng)溫度低于37 C正常細(xì)胞的三維環(huán)境構(gòu)成-個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò),細(xì)時,水凝膠逐漸轉(zhuǎn)化為液態(tài),作為一-種細(xì)胞載體,能胞外基質(zhì)( extracellular matrix, ECM)創(chuàng)造各種有利夠?qū)⒓?xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)以及參與血管形成過程的--于細(xì)胞生長的局部微環(huán)境。細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分些調(diào)控因素如激素、生長因子、各種藥物等構(gòu)成-一個是膠原、彈力纖維、蛋白聚糖、糖蛋白等,ECM不僅有機(jī)整體,當(dāng)溫度達(dá)到37 C時,60 s內(nèi)水凝膠將轉(zhuǎn)是細(xì)胞分泌代謝的產(chǎn)物,而且對細(xì)胞功能有重要的化為三維立體固態(tài)結(jié)構(gòu),從而使實驗結(jié)果能更加真調(diào)節(jié)作用。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展與完善,國內(nèi)實地反映活體組織中的生物學(xué)特性。外學(xué)者開始利用生物材料創(chuàng)造一個類似于體內(nèi)微環(huán)本研究結(jié)果顯示，新型可注射的PECE溫度敏境的三維結(jié)構(gòu)。細(xì)胞三維培養(yǎng)-方面能夠 為體外培感性水凝膠對BMSCs細(xì)胞的增殖及凋亡和相關(guān)功養(yǎng)細(xì)胞提供與其組織來源相似甚至相同的細(xì)胞生長能均無明顯影響,能夠作為細(xì)胞外基質(zhì)為細(xì)胞提供微環(huán)境和細(xì)胞聯(lián)系,從而既有利于各類細(xì)胞的分化必要的營養(yǎng)和屏障保護(hù)作用,BMSCs細(xì)胞在這種水定向誘導(dǎo),又有利于細(xì)胞分化表型的維持和增殖;另凝膠中生長良好,增殖、分泌等功能不受影響,該水-方面可望在體外構(gòu)建與各類組織、器官相應(yīng)的細(xì)凝膠能為細(xì)胞生長提供-個很好的 三維微環(huán)境,可胞三維生長類似物或等同物。其中生物材料是細(xì)胞以作為構(gòu)建三維細(xì)胞培養(yǎng)基的基礎(chǔ)材料。附著的基本框架和代謝場所,其形態(tài)和功能直接影基于水凝膠的優(yōu)良性能,構(gòu)建三維細(xì)胞培養(yǎng)基響所構(gòu)成的組織形態(tài)和功能,是組織工程中的關(guān)鍵。的難題仍有很多難題,如組織的內(nèi)源性因子必須在生物材料為細(xì)胞的停留、生長提供三維空間和新陳凝膠里全面的體現(xiàn),必須制定更好的方法把這些因代謝的環(huán)境,并決定新生組織器官的形狀和大小，與子在合適的時間以合適的順序?qū)苏_合適的位單純的細(xì)胞培養(yǎng)基相比具有明顯的優(yōu)越性'9]。置。隨著組織工程的發(fā)展,基于水凝膠的三維培養(yǎng)此外,理想的支架材料需要滿足幾個方面的要體系的建立以及水凝膠支架是十分有前景的。求:(1)合適的表面化學(xué)性能以利于細(xì)胞黏附、分化及增生;(2)適當(dāng)?shù)慕到饴?無害的降解產(chǎn)物;[參考文獻(xiàn)](3)無細(xì)胞毒性;(4)足夠的機(jī)械強(qiáng)度;(5)最小的免疫及炎癥反應(yīng);(6)生產(chǎn).純化及加工的簡單性; [1] Ho E, Lowman A, Marcolongo M. Synthesis and(7)滿足組織的連接及血管化的孔洞。目前組織工characterization of an injectable hydrogel with tunable程細(xì)胞最常用的支架材料之一是智能水凝膠材mechanical properties for soft tssue repair [ J].Biomacromolecules, 2006,7: 3223 - 3228.料10]。它是一種能迅速吸收及并保持大量水分而又不溶于水的低交聯(lián)度材料,具有高分子電解質(zhì)特[ 2 ] Melinda C, Cushing S,Kristi s. Hydrogel Cell Cultures[J]. Science, 2007 ,316: 1133 - 1134.性和三維立體的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),自身能感知外界環(huán)境[3] Wei x, Gong C, Gou M, a al. Biodegradable poly(如溫度、pH值、光、電、壓力等)微小的變化或刺(pilon-caprolactonc)-poly( ethylene glycol) copolymers激,并能產(chǎn)生相應(yīng)的物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)變化。as drug delivery system [J]. Int J Pharm, 209 ,381本實驗所使用的水凝膠是一種溫度敏感性的水中國煤化工凝膠,當(dāng)溫度低于或高于體溫37C時,PECE水溶[4]r al. Bidegradble液顯透明狀態(tài),具有流動性;在溫度為37 C時，YHc N M H GL.PEG hydrogel forPEG-PCL-PEG水溶液顯透明固體態(tài),失去流動性。bFGF anigen delivery to improve humoral inmunity.26●第6期孫俊等:基于聚乙二醇聚乳酸秦乙二醇水凝膠的兔骨臂基質(zhì)干細(xì)胞三濰培養(yǎng)[]. Growth Factors, 2009 ,27(6): 377 -383.[8] GongCY, Shi s, Dong PW, et al. Biodegradable in[5] Yang B, Gong C, QianZ, et al. Prevention of post-situ gel-forming controlled drug delivery system basedsurgical abdominal adhesions by a novel biodegradableon thermosensitive PCL-PEG-PCL hydrogel; part 1-thermosensitive PECE hydrogel [J]. BMC Biotechnol,synthesis , characterization, and acute toxicity evaluation2010,10(1): 65.[]. J Pharm Sci, 2009 ,98( 12) : 4684一4694.[6] Liu CB, Gong cY, Huang MI, et al. Thermoreversible[9] Criffth LG, Naughton G. Tissue engineering curentgel-sol behavior of biodegradable PCL-PEG-PCLchallengesand expanding opportunities [ J]. Science,triblock copolymer in aqucous solutions [J]. J Biomed2002 ,295: 1009 - 1014.Mater Res B, 2008,84: 165- 175.[10] GongCY, Shi s, Dong PW, et a1. Thermosensitive[7] Hwang M, Suh JM, Bae YH, et al. CaprolactonicPEG-PCL-PBG hydrogel contolled drug delivrypoloxamer analog: PEG-PCL-PEG [J]. Biomacromole-system; sol-gel-sol transition and in vito drug releasecules, 2005 ,6(2): 885 - 890.study [J] J Pharmn Sci, 2009 ,98( 10): 3707 - 3717.(上接第22頁)[5] Shin YW, Bae EA, Lee B, etal. In viro and in vivo[參考文獻(xiàn)]antillegic efects of Gilyeyrthiza glabra and itscomponents[J]. Planta Medica, 2007 ,73(3): 257 -261. .[ 1 ] Koleckar V, Brojerova E, RchakovaZ, etal. In viro[6] 張世蘋,周翌婧,劉艷,等.甘草黃酮誘導(dǎo)肝癌SMMC-antiplatelet activity of flavonoids from Leuzea7721細(xì)胞凋亡及其對相關(guān)蛋白survivin表達(dá)的影響carthamoides[J]. Drug Chem Toxicol, 2008 ,31(1):[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2008 , 28(3):27 - 35.330 - 334.[2] Miura D, Miura Y, Yagasaki K. Effet of apple[7] 王艾麗，鄭航,鄭新民,等.異甘草素對人前列腺癌細(xì)polyphenol extract on bepatoma proliferation anc胞體外增殖的抑制作用[J].臨床泌尿外科雜志，invasion in culture and on tumor growth, metastasis,2007 ,22(11): 867 - 868. .and abnormal lipoprotein profiles in hepatoma-bearing[8] 劉強(qiáng),陳興興,孫學(xué)剛,等.甘草黃酮對荷瘤(S180)小rats[J]. Biossci Biotechnol Biochemi, 2007,71(11):鼠免疫細(xì)胞數(shù)量的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2000 ,2743 - 2750.22(12): 904 -906.[3] Sekine C, Sugihara T, Miyake s, et al. Successful[9] 劉春宇,顧振綸,杜宗民,等.沙苑子黃酮抗裸鼠人肝treatment of animal models of rheumatoid arthritis with癌移植瘤的實驗研究[J].中國藥理學(xué)通報,2007 ,23small- molecule cyclin-dependent kinase inhibitors[J]. J(6): 781 - 789.Immunol, 2008,180(3); 1954 - 1961.[10] Zhu BH, Zhan WH, Li ZR, et al. Epigallocatechin-3-[4] Wttshier N, Lengsfeld C, Vorthemss, et al. Largegallate inhibits growth of gastric cancer by reducingmolecules as anti-adhesive compounds against PathogensVEGF production and angiogenesis[J]. World J[J]. J Pharmacy Pharmacol, 2007 ,59(6):777 - 786.Gastroenterol, 2007 ,13(8): 1162 - 1169.中國煤化工MYHCNMHG●27.