中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志Chinese Journal of Pharmaceuticals 2007, 38(6)藥物制劑、cccccccce-雙氨基聚乙二醇的制備及分離純化劉敏，徐雯，朱葉歡，潘弘，陸偉躍*(復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥劑教研室，上海200032)摘要:聚乙二醇2000經(jīng)氯代、疊氮化、氫化還原3步反應(yīng)制得雙氨基聚乙二醇(1)粗品，總收率57%。采用陽(yáng)離子交換樹脂，以不同濃度的乙酸鹽緩沖液(pH 5.7)梯度洗脫，得到的1純品采用IR、'HNMR和HPLC等 方法進(jìn)行檢測(cè)，并用高效分子排阻色譜法測(cè)定相對(duì)分子量。關(guān)鍵詞:雙氨基聚乙二醇;制備;純化;檢測(cè)中圖分類號(hào): TQ314.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A文章編號(hào): 1001-8255 (2007)06-0423-04Preparation and Purification of Amino-terminated Poly (ethylene glycol)LIU Min, XU Wen, ZHU Ye-huan, PAN Hong, LU Wei-yue*(Dept. ofPharmaceutics, School of Pharmacy, Fudan University, Shanghai 200032)ABSTRACT: The amino terminated poly (ethylene glycol) (1) was obtained from polyethylene glycol 2000 bychlorination, azidation and catalytic hydrogenation with an overall yield of 57%。The title compound was purified usingcation exchange resin with gradient eluent of acetate buffer solution (pH 5.7) of different concentrations. The structureof pure product was characterized by IR, 'HNMR and HPLC. The relative molecular weight of 1 was determined by size-exclusion chromatography.Key Words: amino-terminated poly (ethylene glycol); preparation; purification; characterization聚乙二醇(PEG)是由乙醇單體聚合而成的線形Staudinger法等1911。由于疊氮化物還原法具有成本高分子，結(jié)構(gòu)式為H(OCH2CH),0H。目前廣泛用低、反應(yīng)條件溫和、胺化產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)，本研究來(lái)修飾多肽、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)體、納米粒等藥物和載采用該法以PEG 2000為原料，經(jīng)氯代、疊氮化、體[1-6]。PEG的末端羥基須在較激烈的條件才能與氫化還原3步制備了雙氨基PEG(1)，總收率57%。其它基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，因此必須通過適當(dāng)方式活化。再利用陽(yáng)離子交換樹脂分離純化，最后通過IR、可根據(jù)不同需要，用醛基、氨基、異氰酸酯基、羧'HNMR和HPLC進(jìn)行檢測(cè)，并測(cè)定相對(duì)分子量?；拖┗然鶊F(tuán)取代該羥基7,8]。傳統(tǒng)活化方法包1儀器與試藥括氰脲酰氯法和羥基琥珀酰亞胺法。其中胺化方法Akta explorer型中壓層析系統(tǒng)(瑞典安發(fā)瑪西亞包括甲苯磺酸酯法、疊氮化物還原法及Mitsunobu-公司): 1100型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司);AVATARTM360型傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)Thermo.收稿日期: 2006-07-31基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(30672545)和上海市納米科技專項(xiàng)基Nicolet公司); Mercury Plus 400MHz型超導(dǎo)核磁共振波譜儀金(0652m011)(美國(guó)Varian公司)。作者簡(jiǎn)介:劉敏(1969)， 女碩士，講師，從事高分子藥物載體和脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)研究。PEG 2000(化學(xué)純，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑E-mail: liumin@shmu.edu.cn通訊聯(lián)系人:陸偉躍(1960)， 男，教授，博士生導(dǎo)師，從事藥物靶公司)中國(guó)煤化工000、2000、 3350、向傳釋系統(tǒng)研究。6000|YHCN M H G司);單氨基聚乙二醇Tel: 021-54237040; Fax: 021-641787902000和1對(duì)照品(美國(guó)Shearwater Polymer公司)。E-mail: wylu@shmu.edu.cn424●中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志Chinese Journal of Pharmaceuticals 2007, 38(6)2方法與結(jié)果88%)。2.1 1的制備2.2 1的分離純化2.1.1試劑的預(yù)處理先前的研究中，本試驗(yàn)室已建立了檢測(cè)1純度氯化亞砜:氯化亞砜200ml中加喹啉60ml,混的HPLC法2。利用TSK-GELG4000 PW xu凝膠滲勻，放置過夜。過濾，濾液蒸餾，收集約72C的餾透色譜柱上存在的少量荷負(fù)電的基團(tuán)與酸性條件分。所得餾分重蒸餾，收集76~78C的餾分，避光下荷正電PEG的氨基之間的離子交換作用，用低密閉保存。離子強(qiáng)度的流動(dòng)相洗脫，無(wú)氨基取代的PEG 2000乙醇:取鎂條2.5 g和碘0.5g置無(wú)水乙醇50ml首先被洗脫，單氨基聚乙二醇次之，1再次之。中，80C回流30min。 補(bǔ)加無(wú)水乙醇600ml,回流色譜條件如下:色譜柱TSK-GEL G4000 PWxr柱30min后蒸餾，收集78C的餾分，避光密閉保存。(7.8mmx 300mm，10μm)， 示差折光檢測(cè)器，流動(dòng)甲苯、二氯甲烷、DMF和吡啶等試劑均經(jīng)無(wú)相5mmolL氯化鈉溶液(pH 4.0)，流速0.5ml/min,水處理。柱溫25"C， 進(jìn)樣量20μl。 色譜圖見圖1。購(gòu)得的2.1.2雙氯代聚乙二醇(2)PEG 2000、單氨基聚乙二醇和1保留時(shí)間分別為取PEG 2000 80g (0.04mol)溶于甲苯350ml中,21.2、23.6和30.6min, 測(cè)得自制的1粗品主峰保留再加入吡啶8ml和氯化亞砜23ml，120C回流2h。時(shí)間基本與購(gòu)得品相同。照峰面積積分法計(jì)算，粗反應(yīng)液冷至室溫，過濾，濾液減壓蒸除甲苯，冷至品中1的含量為78%。室溫。所得黏稠液體中加入二氣甲烷300ml和Al2O33200g(2mol)，攪拌2h,過濾。濾液減壓蒸去二氯1000 A甲烷。剩余物滴至冷無(wú)水乙醚2.5L中，析出白色8000沉淀，抽濾，濾餅減壓干燥，得白色粉末狀固體24000.(60g，以PEG 2000計(jì)，收率為75%)。R 0.59[展開劑:氯仿-二氯甲烷-甲醇-正丁醇(5:3:3:0.1)，1020040碘蒸氣顯色]。2.1.3雙疊氮聚乙二醇(3)2000.如上所得2 (60g, 0.029mol) 溶于DMF 400ml中，加入疊氮化鈉35g(0.54mol)，115C回流2h,冷至室溫，過濾。濾液減壓蒸除DMF,冷至室/min30溫，用二氯甲烷300ml溶解，過濾，濾液濃縮后滴A:購(gòu)得品，B:自制粗品1-1; 2-單氨基聚乙二醇2000; 3-PEG 2000至冷無(wú)水乙醚3L中沉淀，抽濾，濾餅減壓干燥，得圖1 HPLC圖譜白色固體3(52g,以2計(jì)， 收率87%)。Rq 0.71[展開劑:氯仿-甲醇-丙酮-正丁醇(8.2:1:1:1.6)， 碘采用UNOsphereTM Q強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱(美國(guó)蒸氣顯色]。Bio-Rad, 25mmx 120mm，100μm)， 用10mmo/L2.1.4雙氨基聚乙二醇(1)乙酸鹽緩沖液(pH 5.7) 平衡色譜柱。取1粗品3g,將如上所得3(52g，0.025mol) 溶于無(wú)水乙醇二以注射用水10ml溶解，上柱。 梯度洗脫[洗脫液氯甲烷(6: 1)混合溶劑300ml中，加10%鈀炭3g,A: 10mmol/L乙酸 鹽緩沖液(pH 5.7),洗脫液B:室溫5atm氫化24h。反應(yīng)液經(jīng)0.22μm微孔濾膜抽60m中國(guó)煤化工，100min內(nèi)洗脫濾，濾液濃縮后滴至冷無(wú)水乙醚3L中沉淀，抽濾，液從基3m/min。用上述濾餅減壓干燥，得白色1粗品(46g,以3計(jì)， 收率TYHCNMH(氨基聚乙二醇組分HPLEAwuumw.口口4中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志Chinese Journal of Pharmaceuticals 2007, 38(6)●425●的洗脫液，用氫氧化鈉溶液調(diào)至pH 9.0，凍干。取1600 1凍干品2g上Sephadex G-15柱，以注射用水為洗脫1200 -液脫鹽，收集洗脫液凍干，得1純品[1.5g, 精制率800 -50%，純度>95% (HPLC法)]，色譜圖見圖2。2.3結(jié)構(gòu)表征與相對(duì)分子量測(cè)定)十1(203002.3.1紅外光譜和'HNMRt/mir紅外光譜: KBr壓片，結(jié)果見圖3。與PEG1-12000的紅外光譜比較，1純 品圖譜中3400cm附近圖2 1純品的色譜圖出現(xiàn)-一個(gè)弱的寬吸收帶，其強(qiáng)度遠(yuǎn)低于v。u(中等強(qiáng)度)，可能為UN特征峰;兩者均在2887cm '出現(xiàn)一等強(qiáng)度; 1114cm 處出現(xiàn)強(qiáng)的尖吸收帶為Uo。特征個(gè)很強(qiáng)的尖吸收帶，即亞甲基的v。:特征峰;另外峰。亞甲基對(duì)應(yīng)的剪式振動(dòng)吸收帶位于1467cm'處，中3p10.0Ai2B ;8.0t9t6.04.02.02t4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500圖3 PEG 2000(A)和1 (B)的紅外圖譜'HNMR:溶劑為重水，樣品濃度為10mg/ml, .-CH2-CH2-0- (PEG分子中): 83.3~3.8(多重結(jié)果見圖4。1純品，-NH2: 82.9(2H, 三重峰)，峰)。87654321876iB圖4 PEG 2000(A)和1 (B)的'HNMR圖譜2.3.2高效分子排阻色譜法測(cè)定1相對(duì)分子量中國(guó)煤化工TSKGELG2000照中國(guó)藥典2005年版附錄VH和右旋糖酐20SWx.MHCNMHG0.7%硫酸鈉溶液(P88)的分子量與分子量分布項(xiàng)下方法測(cè)定1相對(duì)(含0.02%疊氮化鈉)，柱溫35C，流速0.5m/min,。426●中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志Chinese Jourmal of Pharmaceuticals 2007, 38(6)進(jìn)樣量20μ1。1純品加流動(dòng)相制成濃度為10mg/ml的各種特征峰都存在，包括C-H的伸縮振動(dòng)峰、的溶液，作為供試品溶液。另取5個(gè)已知分子量的-CH2-的剪式振動(dòng)峰和C-0-C的伸縮振動(dòng)峰PEG對(duì)照品，同法制成10mg/ml的溶液作為對(duì)照品等。'HNMR圖譜中，與PEG 2000圖譜比較，在溶液。分別進(jìn)樣測(cè)定，采用GPC軟件(美國(guó)Agilentδ2.90處增加了一個(gè)三重峰，推斷是與-CH,連接的公司，A.02.01版本)將保留時(shí)間對(duì)對(duì)照品分子量線-NH2的化學(xué)位移，且含與重復(fù)結(jié)構(gòu)-CH2CH2O相性回歸，由所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試品的相對(duì)分子同的化學(xué)位移。HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示自制1具有與購(gòu)量。結(jié)果表明，1的重均分子量為2045,分子量分得品相同的保留時(shí)間，結(jié)合分子量等數(shù)據(jù)，可確證散程度為1.0915。結(jié)構(gòu)。3討論3.1 1的制備參考文獻(xiàn): .本實(shí)驗(yàn)制備1的總收率為57%，粗品純度為[1] 蔣為民，王妍.蛋白質(zhì)藥物的聚乙二醇修飾[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展, 2005, 33 (4): 72-75.78%。在制備過程中應(yīng)該注意以下幾點(diǎn):首先，氯2] 趙蓉,朱家壁.聚乙二醇修飾的立體穩(wěn)定脂質(zhì)體[J].國(guó)外代反應(yīng)時(shí)加入氯化亞砜后會(huì)產(chǎn)生大量沉淀，這些沉醫(yī)學(xué):藥學(xué)分冊(cè), 199, 26(3): 161-166.淀經(jīng)TLC檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)同樣含有2，因此，用二氯甲3] 卞麗紅,梅興國(guó),章?lián)P培.新一代PEG在修飾抗原和藥物緩?fù)楸M可能地將沉淀中的2溶解出來(lái)與產(chǎn)品合并- -起釋中的應(yīng)用[].生命科學(xué), 2004, 16(5): 296-300.進(jìn)行處理以提高產(chǎn)率;其次，由于生成的2中可能4] 趙樹進(jìn),尹亮,郭勇,等.聚乙二醇修飾后超氧化物岐化含有雜質(zhì)硫，而硫的存在將導(dǎo)致后續(xù)氫化還原步驟酶的穩(wěn)定性及其在家兔體內(nèi)過程[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,中的鈀炭催化劑中毒，因此在產(chǎn)品中加入活化的氧2003, 23(4): 193-196.化鋁以吸附硫及其它雜質(zhì)。最后，3步反應(yīng)都是采5] 張宇鋒,謝蜀生,侯新樸,等.具有活性羧基末端的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的制備和分布[J].藥學(xué)學(xué)報(bào), 2000, 35(11):用無(wú)水乙醚沉淀法得到產(chǎn)品，無(wú)水乙醚的用量應(yīng)至少為濃縮液的8~ 10倍，且冷的無(wú)水乙醚沉淀效果6] 付春曉蛋白的聚乙二醇修飾及其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用更好。[J].國(guó)外醫(yī)學(xué):藥學(xué)分冊(cè), 200, 28(2): 78-81.3.2 1的分離純化[7] 董炎明.高分子材料實(shí)用剖析技術(shù)[M].北京:中國(guó)石化出1粗品中的主要雜質(zhì)為單氨基聚乙二醇、無(wú)氨版社, 1997: 80-81.基取代的PEG 2000和少量小分子物質(zhì)等。陽(yáng)離子8] 王琴梅,潘仕榮,張靜夏.雙端氨基聚乙二醇的制備及表征[D].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2003, 34(10): 490-492.交換樹脂是以陰離子交換劑為固定相，借助于樣品9] Zalipsky s. Chemistry of polyethylene glycol conjugates中電離組分對(duì)其親和力的不同從而達(dá)到分離離子型with biologically active molecules[J]. Adv Dng Deliv Rew,或可離子化的化合物的目的。- 般在陽(yáng)離子交換樹1995, 16(2): 157-182脂骨架上引入的酸性基團(tuán)有磺酸基、羧基和酚羥[10] Zalipsky s, Gilon C , Zilkha A. Attachment of drugs to基等。在1純化過程中，首先將1酸化成NH3 -PEGpolyethylene glycols[J]. Eur Polym J, 1983, 19(12):2000-NH3*,根據(jù)胺基數(shù)目的不同，PEG 2000、單17-1183.氨基聚乙二醇、1在陽(yáng)離子交換樹脂上的吸附性也[11] Zalipsky s, Chang兒L, Albericio F, et al. Preparation and依次增強(qiáng)。用乙酸鹽緩沖液梯度洗脫可達(dá)到分離純applications of polyethylene glycol-polystyrene graft resinsupports for solid- phase peptide-synthesis[J]. React Polym,化的目的。1994, 22: 243-258.3.3 結(jié)構(gòu)分析[12] Liu M, Xie C, Xu w, et al. Separation of polyethyleneIR圖譜中，理論上-NH,在3500和3400cm^中國(guó)煤化工ed derivatives by high-附近有兩條弱的吸收帶，但由于-NH2在1中所占比例少，不易顯現(xiàn)。與PEG 2000圖譜比較，該處HC N M H Galgraphy al low ioicStrength wth Tetractive index detection[J]. J Chromatogr A,吸收帶的強(qiáng)度顯著低于-OH的吸收。另外，PEG2004, 1046(1-2): 121-126.