生物工程學報Chin J Biotech 2008, June 25: 24(6)journals. imaccnChinese Journal of Biotechnology ISSN 100cb@imaccn@2008 Institute of Microbiology, CAS CSM, All rightsresend研究報告代謝工程改善野生酵母利用木糖產(chǎn)乙醇的性能張凌燕12,張梁,丁重陽12,王正祥,石貴陽121江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室,無錫2141222江南大學生物工程學院生物資源與轉化研究室,無錫214122摘要:從256個自然樣品中篩選得到1株可高效轉化D木糖的酵母,通過生理生化和分子生物學方法鑒定,證實該菌株是屬于 Candidaπ tropicalis,以該酵母為研究對象,增加木糖醇脫氨酶表達量,通過改變代謝流以達到提高酒精產(chǎn)率的目的以pXY212ⅪY2質粒為基礎載體,構建了含有潮霉肅抗性的pYX212XYL2 Hygro,電擊轉化進入野生型C. tropicalis,潮霉抗性篩選,得到含高拷貝木糖醇脫氬酶基因的重組菌梾C.ⅳ tropicalisⅪY2-7.重組菌的比酶活達到o.5υ mg protein,比原始菌株提髙了3倍。實驗表明,重組菌木糖醇得率比原始菌株降低了3倍,酒精得率提高了5倍。首次通過實驗驗證了熱帶假絲酵母利用木糖產(chǎn)乙醇的可行性,這對研究酵母利用秸稈、麥糠、谷殼等纖維質農(nóng)業(yè)廢棄物生產(chǎn)燃料乙醇具有重要啟示關鍵詞:熱帶假絲酵母,木糖,乙醇,木糖醇脫氫酶Metabolic Engineering for Improving Ethanol Fermentationof Xylose by Wild YeastLingyan Zhang, Liang Zhang, Zhongyang Ding.2, Zhengxiang Wang and Guiyang Shi2I Key Laboratory of industrial Biotechnology of Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China2 Laboratory of Biomass Refinery Processing, Jiangnan Universiry, wuxi 214122, chinaAbstract: One yeast strain, which was isolated from 256 natural samples, was found to be able to utilize D-xylose effectively. Onthe basis of assimilation physiological and molecular biological tests, the yeast strain was identified as a strain of Candida tropicalisFurthermore, metabolic engineering breeding strategy was applied to change the metabolic flux in order to increase ethanolproductivity. In this study, the C. tropicalis was used as the host strain and the plasmid pYX212-XYL2, which was formerlyconstructed for over expression of XYL2 gene encoding xylitol dehydrogenase (XDH) from Pichia stipitis, was used as the backboneof the recombinant vector. A hygro gene was inserted into downstream position of XYLa gene, meanwhile, the result plasmidpXY212-XYL2-Hygro transformed into C tropicalis by electroporation. Thus, a recombinant yeast C tropicalis XYL2-7 was obtainedthrough hygromycin B resistance screening and its specific XDH activity was 0.5 u/mg protein, which was 3 times more than thatthe parent strain. Additionally, the recombinant yeast was applied in the fermentation of xylose. Compared with the parent yeast, itwas concluded that the xylitol yield in the broth decreased by 3 times, however, the ethanol yield increased by 5 times. The feasibilityof ethanol production from xylose by C. tropicalis was firstly studied in this paper. These research results are helpful to advance thebioconversion of renewable resources(e. g. straw, wheat bran, and husk )to fuel ethanolKeywords: Candida tropicalis, xylose, ethanol, xylitol dehydrogenaseecelved: January 14, 2008: Accepted: March 12, 2008Supported by: the National Natural Science Foundation of China (No. 20706024),H中國煤化工CNMHGand DevelopmeProgram of China(No. 2007AA10Z.359).Correspondingauthor:GuiyangShi.Tel:+86-510-85918229:Fax:+86-510-85815339:E-mail:gyshi@jiangnan.edu.cn國家自然科學基金(No.20706024)和國家863計劃(No.2007AA10Z359)資助張凌燕等:代謝工程改善野生酵母利用木糖產(chǎn)乙醇的性能951我國是一個農(nóng)業(yè)大國,以農(nóng)作物秸稈、林木枝并產(chǎn)生微量的酒精。以這株酵母為研究對象,在國條為主的農(nóng)業(yè)廢棄物資源十分豐富,但并未得到有內首次嘗試將天然底物利用策略應用到酵母中效利用,反而對農(nóng)業(yè)生態(tài)形成了一定的壓力;同時,通過增加細胞內木糖醇脫氫酶的表達量,來減少木我國也是一個能源資源相對貧乏的國家,如何科學糖醇的積累,試圖將代謝流引向乙醇形成方向(圖1),利用農(nóng)業(yè)廢棄物進行能源生產(chǎn),對于實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)以達到提高乙醇產(chǎn)量的目的。展戰(zhàn)略意義重大。近年來利用秸稈、麥糠、谷殼等農(nóng)業(yè)廢棄物生1材料與方法產(chǎn)燃料乙醇正逐步成為人們研究的熱點。隨著木質1.1材料纖維素預處理技術的不斷改進和發(fā)展,特別近年來11.1樣品發(fā)展迅速的稀酸預處理、蒸汽爆碎等技術可高效破稍微腐爛的熱帶水果、花朵、土壤、酒曲、酒壞植物纖維結構,提高微生物的降解轉化速率。高醅、熱帶溫泉土、水樣等?；盍w維素酶,可利用纖維二糖的重組工業(yè)酒精酵1.1.2菌株與質粒母的研究12使木質纖維素原料中纖維素的水解和大腸桿菌( scherichia coli JMI09;PYX212X2高效利用成為可能。因此,微生物本身代謝半纖游離穿梭質粒(含酵母TPI啟動子,樹干畢赤酵母木維素水解液中各種戊糖底物(木糖、阿拉伯糖等)的糖醇脫氫酶基因)由本實驗室先期構建,物理圖譜如能力,已成為決定纖維質原料水解液發(fā)酵成敗的下(圖2); pSKsymHyg質粒由本實驗室保存;其他質關鍵粒均在本實驗中構建。據(jù)報道,酵母菌中有6個種利用木糖發(fā)酵產(chǎn)生113培養(yǎng)葚酒精的量相對較大,但這些菌株由于發(fā)酵速率慢木糖培養(yǎng)基:D-木糖10g,(NH)2SO45g,且產(chǎn)生大量副產(chǎn)物而不能應用于酒精工業(yè)生產(chǎn)。因KH2PO41g,NaCl0.1g,MgS04H2O0.5g,此,人們通過各種育種技術構建能發(fā)酵木糖產(chǎn)生酒caCl20.1g,酵母粉0.2g,水1000mL。精的酵母工程菌,即將與木糖代謝相關的酶類的基LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g,酵母粉5g,氯化鈉因以及相關的輔酶系統(tǒng)相應的基因克隆到釀酒酵母10g,定容至1L,pH70;用于大腸桿菌培養(yǎng)。固體中,使其能利用木糖產(chǎn)生酒精,郭婷向等將木糖還培養(yǎng)基添加15%瓊脂;挑轉化子時,加入100gmL原酶基因(XYL),木糖醇脫氫酶基因(XYL2),木酮氨芐青霉素。糖激酶基因(XKS轉入工業(yè)釀酒酵母獲得表達,酒精YEPD培養(yǎng)基:胰蛋白胨20g,酵母粉10g,葡產(chǎn)率提高了12%。 Pitanen'等將XYl、XYL2、XK萄糖20g,定容至1L。固體培養(yǎng)基添加1.5%瓊脂,基因克隆到釀酒酵母中,得到重組酵母能利用木糖用于熱帶假絲酵母培養(yǎng);添加一定濃度潮霉素產(chǎn)38/L的乙醇B( Hygromycin B)用于重組子篩選。本文從自然界中篩選出一株能高效利用木糖的YEPX培養(yǎng)基:胰蛋白胨20g,酵母粉10g,木熱帶假絲酵母,該菌能夠快速利用木糖生成木糖醇,糖50g,定容至1L。用于酵母培養(yǎng)。NAD(P)HD-xyloseEthanolXylitol圖1熱帶假絲酵母木糖代謝途徑圍中國煤化工Flg.1 Xylose metoblic pathway in C tropicalis andCNMHGJoumals. im ac cn952ssN10003061cN11-1998/0Chin J BiotechJune 25 2008 Vol, 24 No, 6Bamh I計于600nm處測其吸光度。(2)殘?zhí)羌鞍l(fā)酵產(chǎn)物的分析TPI promoter XYL液相色譜:檢測分析用HPLC法( DIONEX P680泵; Agilent1100示差折光檢測器; SUGAR SH011色譜柱;流動相為001moLH2SO4、1ml/min;柱12-XYL2046 bp URA selectable Marker溫50°C)。12.5常規(guī)基因克隆操作方法大腸桿菌感受態(tài)制備,外源基因片段與載體連2μ接,簡易轉化操作,大腸桿菌質?？焖偬崛?酵母基因組DNA制備等操作參見文獻[1l0]。圖2質粒PYX212XYL2的物理圖譜1.2.6質粒構建Fig 2 Physical map of plasmid PYX212-XYL2以pXY212XYL2為基礎載體,該質粒還有酵母12方法TPⅠ啟動子,木糖醇脫氫酶基因XYL2,不含潮霉素1.2.1采樣與分離抗性片段。由于轉化子是進行抗性篩選,必須在該稱取5g樣品,加到含100mL無菌生理鹽水的三質粒中添加潮霉素抗性片段。具體質粒構建見圖3。角瓶中,在30℃C下,150-200rmin振蕩培養(yǎng)25min;菌懸液用無菌生理鹽水進行系列稀釋,選擇合適的稀釋1.2.7潮霉素B的敏感測定度,分別涂布于YEPD平板,30°C培養(yǎng)5-7d,觀察菌落收集熱帶假絲酵母菌體,雙蒸水洗滌兩次后懸生長情況,并將新長出的形態(tài)上有差異的單菌落挑出。浮,30℃進行饑餓培養(yǎng)2~3h。培養(yǎng)后的細胞經(jīng)適當從初篩YEPD固體平板上挑取典型特征的酵母稀釋后涂布于含不同濃度潮霉素B的YEPD平板,單菌落點種在木糖固體培養(yǎng)基上,30C培養(yǎng)48h。30°C培養(yǎng)3-4d,觀察生長情況。挑取生長快速的典型酵母單菌落在木糖固體培養(yǎng)基128轉化方法試管斜面上劃線,4°C保存酵母轉化采用電穿孔轉化法,轉化后涂布于含1.2.2酵母篩選潮霉素抗性的YEPD平板,挑選陽性轉化子。種子培養(yǎng)采用250m三角瓶裝20 L YEPX培12.9細胞裂解液的制備養(yǎng)基,置回轉式搖床,30°C,100r/min,培養(yǎng)24h。搖接種劃線分離的酵母轉化子單菌落挑入瓶發(fā)酵采用YEX培養(yǎng)基,置回轉式搖床,30c,50mYE液體培養(yǎng)基,30℃C,200rmin搖床培養(yǎng)100rmin培養(yǎng)至所需時間至靜止期。離心收集菌體,用磷酸鉀緩沖液洗滌一1.23分類鑒定次,離心后用適量檸檬酸緩沖液重懸菌體。用超聲(1)形態(tài)與生理生化特征破碎儀(vCX400系列)破碎5min(工作1s停5s),分離物的形態(tài)與生理生化特征鑒定,按照文獻破壁后高速離心,上清液即為細胞裂解物,用于酶[6]的方法進行?；顪y定。(2)分子特征1.2.10木糖醇脫氫酶酶活測定山酵母菌DNA的提取方法參照分子克隆實驗手木糖醇脫氫酶需要NAD作為輔助因子,催化冊。所用引物為真菌通用引物。PCR擴增產(chǎn)物木糖醇生成木酮糖以及NADH,由于NADH在經(jīng)電泳檢測后測序。在核酸序列數(shù)據(jù)( Gen Bank)中進340m有最大吸收峰,故可通過測量單位時間內酶行同源序列搜索,根據(jù)同源序列搜索結果,確定菌催化反應體系在340m處吸光度的增量從而計算株的分類地位。出木糖醇脫氫酶的酶活。酶活單位定義為25C時,1.24分析方法每分中國煤化工皆的酶量(1)生長量測定CNMH Radford法測定取不同發(fā)酵時間的發(fā)酵液,用721型分光光度蛋白含量。oumals imaccn張凌燕等:代謝工程改善野生酵母利用木糖產(chǎn)乙醇的性能/PI promoter XYLHind illHind il12-XYL2ori-t Col El46 bp URA selectable mark4298bpPstl2HtndⅢIHind IllBamH IXYL2TPI promoteHind IlIri- col EI pYx212-XYL2URA selectable markerT4 DNA LigaseHind IIIoni-fCol El pYX212-XYL2URA圖3表達載體pYX212XYL2 Hygro的構建Fig 3 Construction of the expression vector pYX212-XYLz-Hygro2結果與分析株能夠以木糖作為唯一碳源生長。逐一經(jīng)搖瓶發(fā)酵初篩中國煤化工示進一步復篩。對21酵母的分離篩選多CNMHG確定一株編號為從自然界中篩選出256株典型酵母菌,其中614412810的菌株能高效利用木糖。954SN10003061cN11-1998/QChin J Biotech008Vol.24No.622分類鑒定數(shù)據(jù)庫進行同源序列搜索的結果表明,菌株2.2,1形本與生理生化特征441-28-1ms的核酸序列,與數(shù)據(jù)庫中已有的菌株41-28-1有典型的酵母菌落形態(tài),細胞短( Candida tropicalis)中序列號為EF196807核酸序列卵形至球形,多邊芽殖,所表現(xiàn)出的形態(tài)及生理生相似性達到了98%。生理生化特征及其分子生物學化特征表1)與文獻[9]的相同。特征均表明,菌株441-28-1的分類地位應屬于2.2.2分子生物學特征Candida tropicalis在中國高校工業(yè)微生物資源數(shù)據(jù)rs區(qū)域核酸序列的相似性,已經(jīng)作為確定酵平臺保藏編號為 CICIMY0092,它的 ITS rDNA基因母菌分類地位的重要分子生物學依據(jù)。對核酸序列的核苷酸序列,在 Gen Bank的登記號為EU121523表1菌株41-28-1的生理與生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of 441-28-lisolateNitrogen-carbon sources Utilization Nitrogen-carbon sources Utilization Nitrogen-carbonD-mannoseGalactitolL-SorboseGalactoseAdonitolMaltoseGlycerolTrehaloseL-rhamnoseMelezitoseD-xyloseDL-lactic acidSoluble starchCellobioseCitric acidL-arabinoseSuccinic acidD-arabinosePotassium nitrateRaffinoseEthanol22.3C. tropicalis CICIM Y002代謝聲物分析的表達量,試圖將代謝流引向乙醇形成方向,以達從圖4可以看出,該株酵母菌代謝木糖的主要到提高乙醇產(chǎn)量的目的。產(chǎn)物為木糖醇,并產(chǎn)生微量的酒精。說明該菌株具2.3.1質粒構建備酒精代謝途徑。用 Hind Il酶切 pSKsymHyg質粒,獲得13kb的 Hygro片段和29kb的質粒片段。電泳后膠回收13kb的 Hygro片段。將該片段與HindⅢ酶切XylitolpYX212XYL2質粒相連接,獲得片段大小為11kb60000的質粒pYX212XYL2 Hygro23.2質粒酶切驗證將表達載體pYX212XY2Hygo用 Bamh I和EthanolHind Il雙酶切,應釋放出不含啟動子的17kb的751125i517520XYL2片段,13kb的潮霉素抗性片段,以及8.3kb的pXY212片段。電泳結果與分析結果相同,證明質粒圖4 Candida tropicalis CICIMY02木糖發(fā)酵液相圖譜構建成功。Fig 4 HPLC chromatogram of the broth from Candidatropicalis CICIM YO09223.3潮霉素敏感性實驗23代謝工程育種酵母能表達細菌抗生素的抗性基因,它對β-內通過分析木糖代謝產(chǎn)物以及代謝途徑可知,中酰胺和其他類似青霉素的抗生素不敏感,但對于氨間產(chǎn)物木糖醇積累,代謝流不能很好地向下進行,基糖fV凵中國煤化工艮他毒素(G418)可能是導致酒精產(chǎn)率低的原因。因此,以篩選到熱抗性CNMH淚關。試驗比較發(fā)帶假絲酵母為出發(fā)菌株,增加細胞內木糖醇脫氫酶現(xiàn),當pH8.0的時候,酵母的生長情況與pH70,相Joumals. im ac cn張凌燕等:代謝工程改善野生酵母利用木糖產(chǎn)乙醇的性能955差不大;但對潮霉素B的最低抑菌濃度下降為生成情況進行對比。100ugmL,僅需pH70下的40%。在pH80的條0件下,可以提高敏感度,降低藥物使用劑量。0.4kb0.2pYX2120.1Parent strain for xylitol accumulationRecombinant strain for xylitol accumulation圖6木糖醇得率曲線Fig 6 Xylitol yield curves0.18圖5重組表達載體pYX212XYL2 Hygro的酶切驗證Fig 5 Restriction enzyme analysis of recombinant魚0.14expression vector pYX212-XYL2-Hygro0.l2表2熱帶假絲酵母對潮霉素B的最低敏感濃度0.06Table 2 Hygromycin B inhibition concentration ofindustrial C. tropicalisStrain Hygromycin B inhibition concentration(ug/mL)pH7.0Parent strain for ethanol accumulationC tropical圖6乙醇得率曲線23.4木糖醇脫氫酶牌活的測定Fig 6 Ethanol yield curves將重組載體pYX212XL2 Hygro電穿孔轉化法轉化進入野生型熱帶假絲酵母中,通過潮霉素抗性從上圖可以看出,原始菌株木糖代謝的主要產(chǎn)平板篩選轉化子,重新劃線分離后,選取C. tropicalis物是木糖醇,木糖醇得率為06g/g,同時產(chǎn)生微量XYL2-1,C, tropicalis XYL27測定酶活(表3)。的乙醇,乙醇得率為003gg。重組菌株與原始菌株相比,木糖醇積累量只有原始菌株的10%,木糖醇表3重組子木糖醇脫氫酶比酶活得率僅為017gg,乙醇生成量是原始菌株的2倍Table 3 Specific XDH activities of C tropicalis andlis transformants乙醇得率為0.16g/g,提高了5倍。C, tropicalis C, tropicalis上述實驗表明增加了細胞內木糖醇脫氫酶的表XY2-7達量重組菌株,能夠明顯減少木糖醇的積累量,同XDH/(u/mg protein)時乙醇得率也有了一定的提高Protein/(mg/mL)6.7624從酶活測定可以看出,原始菌株木糖醇脫氫酶3討論XDH)的比活為013umg蛋白,兩個重組菌株C.以纖維質農(nóng)業(yè)廢棄物為原料生產(chǎn)乙醇,其關鍵tropicalis XYL21和C. tropicalis XYL27的酶活則分之一就是具有能有效利用各種糖底物,且高效產(chǎn)生別達到03umg蛋白、05 u/mg protein,,分別是原始乙醇的微生物菌種。由于這樣的菌種在自然界中并菌株的23倍和38倍。不存人們轉向利用代謝τ程原理,通過分2.3.5重組醇母與原始菌株發(fā)酵實驗比較子遺中國煤化工氏氧條件下高效代熱帶假絲酵母C. tropicalis與重組酵母c.謝發(fā)CNMHG糖的工程菌株3apicalis XYI2-7進行發(fā)酵實驗,并對木糖醇,乙醇本文從自然界中篩選出一株能高效利用木糖,Joumals. im ac cn956|sSN1000-3061cN11-1998QChin J BiotechJune 25 2008 Vol 24 No 6大量積累中間代謝產(chǎn)物木糖醇,并產(chǎn)生微量乙醇的Northwest Sci Tech Univ of Agri and For(Nat Sci Ed).酵母,菌落外觀、細胞形態(tài)、生理生化特征及其分2006,34(10):164-177張梁,石貴陽,王正祥,等.釀酒酵母GPD1中整合表子生物學特征均表明,菌株441-28-1的分類地位應達纖維二糖酶基因用于纖維素酒精發(fā)酵的研究.西北屬于C. tropicalis。在中國高校工業(yè)微生物資源數(shù)據(jù)農(nóng)林科技大學學報(自然科學版),2006,34(10):164-177平臺保藏編號為 CICMM Y0092,它的 ITS rDNA基因[3] Jeewon L. 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Sugarcane and活比原始菌株分別提高了2倍、3倍,說明木糖醇脫canesugar,2007,3:26-29.氫酶基因在C. tropicalis中成功的得到了表達;發(fā)酵郭婷,梁達奉,鮑曉明.工業(yè)酸酒酵母木糖代謝途徑的實驗表明重組菌株C. tropicalis XYL27的中間代謝建立以及酒精發(fā)酵初步研究,甘蔗糖業(yè),2007,3:26-29產(chǎn)物木糖醇積累明顯減少了,木糖醇的得率降低了切PkmP, tala e, Arstidou A, et al. xylose chemostat70%,同時乙醇產(chǎn)量有了一定的提高。本文以從自然界篩選出的野生酵母為出發(fā)菌株glucose, and ethanolmetabolism of the original strain.在國內首次嘗試將天然底物利用策略應用到酵母中opl Microbiol Biotechnol, 2005, 67: 827-837.[8]Qu YB. Industrialization of cellulosic ethanol. Progress in并達到了預期效果,即木糖醇積累明顯減少,乙醇Chemistry, 29(7):1098-1108的產(chǎn)量也有了一定的提高。初步證明了天然底物利曲音波.纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)化.化學進展,200,19(7)1098-1108用策略在酵母基因工程菌構建中的可行性。由于[9] Barnett JA, Payne RW. Characteristics and Identification.pYX212XYL2- Hygro質粒是游離于染色體外存在的Qingdao: Qingdao Ocean university Press, 1991在沒有選擇壓的情況下,質粒很容易丟失。進一步巴尼特JA,佩恩著RW.酵母菌的特征與鑒定手冊.青島:青島海洋大學出版社,1991的工作將通過做外源木糖醇脫氫酶基因在 Candida[10] Adams A, Gottschling DE, Kaiser CA, et aL. 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