208臨床檢驗(yàn)雜志2002年第20卷第4期 Chinese Journal of Clinical Laboratory Science2002o.20No.4文章編號(hào):1001-764X2002)4020803中圖分類號(hào)R46.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼3乙醇氧化酶法測(cè)定血清中乙醇含量王向陽嵊州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科浙江嵊州312400摘要:目的建立血清中測(cè)定乙醇濃度的乙醇氧化酶法。方法基于乙醇氧化酶氧化乙醇產(chǎn)生乙醛和HO,偶聯(lián) Trinder反應(yīng)生成醌亞胺可在500m波長比色測(cè)定通過優(yōu)化反應(yīng)體系中各主要成分和測(cè)定條件建立了本法。結(jié)果本法的靈敏度0.5g/L時(shí),Asom>0.08;線性范圍0.125~5.0g/L批內(nèi)CV為1.02%,批間CV為2.76%本泫(Y)與氣相色譜泫ⅹ沘較;Y=1.06X±0.12,=0.989。結(jié)論本法的靈敏度較髙、線性范圍寬、精密度和準(zhǔn)確性均較好適合臨床實(shí)驗(yàn)室急診測(cè)定用。關(guān)鍵詞乙醇血清氧化酶法醫(yī)院急診室遇疑似急性酒精中毒的患者或交通2.5測(cè)定方法自動(dòng)分析的主要參數(shù)如下反應(yīng)類管理部門遇疑有酒后駕車的對(duì)象常常需要測(cè)定血中型兩點(diǎn)法反應(yīng)溫度:37℃¨波長500m主)600乙醇濃度。血清沖乙醇濃度測(cè)定早期用蒸餾氧化mn(次)樣本6團(tuán)加RI240μ孵育3-5min后法和滲透壓法特異性差20世紀(jì)50年代開始用醇加RⅡ60團(tuán)加入RⅡ后延遲1min第一點(diǎn)讀數(shù),脫氫酶法測(cè)定60年代報(bào)告用氣相色譜測(cè)定。我們?cè)龠^4min第二點(diǎn)讀數(shù)。建立了用乙醇氧化酶(AIO)測(cè)定血清中乙醇含2.6比較方法氣相色譜法1標(biāo)本用血清量的方法其靈敏度、準(zhǔn)確度和線性范圍均較好現(xiàn)3實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告于下。3.1緩沖液種類和pH選擇乙醇氧化酶較適用的1原理緩沖系統(tǒng)為磷酸鹽和Tis,我們用它分別配成血清中乙醇經(jīng)ALO催化生成乙醛和H2O2,7.07.58.08.59.0五種不同pH的緩沖液離子強(qiáng)后者經(jīng) Trinder反應(yīng)生成紅色醌亞胺于500mm波度均為100m/L按應(yīng)用試劑加入其他成份分別長比色對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)可計(jì)算出乙醇含量反應(yīng)式如下用一份5g/L的標(biāo)本測(cè)定結(jié)果磷酸鹽緩沖液在pHALOD7.5和8.0時(shí)吸光度最高,lris/HC緩沖液在p8.5CH3 CH2OH +OCH3CHO +H20時(shí)吸光度最高。為了照顧到POD的最適pH和OD穩(wěn)定性我們采用pH7.5的磷酸鹽緩沖液。H202+4AAP+酚紅色醌亞胺+4H3O3.2ALOD的活性濃度選擇分別配制ALOD濃度為500U/L1000U/L1500U/L和2000U/L材料和方法2.1試劑乙醇氧化酶( from Candida sp.),日本的應(yīng)用試劑試劑中其他成份不變),分別測(cè)定1.0、3.0、5.0g/L的標(biāo)本結(jié)果說明酶濃度越高反應(yīng)速Asahi Chemical Industry公司產(chǎn)品辣根過氧化物爵率越快但在1000UL時(shí),三個(gè)濃度的標(biāo)本在5Roche公司產(chǎn)品;-氨基安替比林、酚和磷酸鹽均為min內(nèi)吸光度均呈直線性且有較高的吸光度故選國產(chǎn)分析純。擇此濃度。2.2儀器 Hitachi7170自動(dòng)生化分析儀Beckman du640分光光度計(jì)2.3應(yīng)用試劑組成RⅠ:苯酚10mmo/L磷酸030鹽緩沖液100mmol/L,pH7.5;RⅢ:ALOD5 000 U/L POD 1 000 U/L A-AAP 2 mmol/Lo x準(zhǔn)物為1g/L無水乙醇溶液中國煤化工2.4校準(zhǔn)物用分析天平精確稱取無水乙醇1CNMHGλmm)移至1L量瓶中加去離子水到刻度混勻及時(shí)用安瓿1ml分裝。1本法的吸收光譜掃描結(jié)果米作者簡介汪王向陽男,1952年生主管技師檢驗(yàn)科主任臨床檢驗(yàn)雜志2002年第20卷第4期 Chinese Journal of Clinical Laboratory Science2002Vo.20No.43.3波長選擇一個(gè)1.0g/L的標(biāo)本用本法測(cè)(0.07~0.15g/L)均否認(rèn)飲酒。另33人均最終定顯色后用 Beckman du640分光光度計(jì)掃描結(jié)承認(rèn)飲過酒血清中乙醇濃度在0.55~2.42g/L果見圖1。吸收峰在500mm處,次波長選用600平均1.59g/nm。5討論34反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線選擇1.0g/L3.0g/L和1976年 Hadjioannou等4用脫氫酶法在自動(dòng)5.0g/L的標(biāo)本,分別用本法測(cè)定,觀察反應(yīng)動(dòng)力分析儀上測(cè)定全血、血清和尿中乙醇含量。為了提學(xué)結(jié)果見圖2,說明三個(gè)標(biāo)本在反應(yīng)時(shí)間5min)高靈敏度Jung等5在醇脫氫酶的基礎(chǔ)上再偶聯(lián)醛內(nèi)均呈直線上升。脫氫酶這樣1分子的乙醇可產(chǎn)生2分子的NADHKapur等6在醇脫氫酶基礎(chǔ)上偶聯(lián)黃遞酶使IT08還原成甲在可見光比色似以提高靈敏度。我們建立的氧化酶法有較高的靈敏度用兩點(diǎn)法測(cè)定濃度為0.5g/L時(shí)精密度較好04批間CV為2.76%,且和氣相色譜法有良好相關(guān),適合各種類型的自動(dòng)分析儀臨床實(shí)驗(yàn)室測(cè)定非常02方便血清中乙醇濃度達(dá)到0.5~1.0g/L時(shí)可出現(xiàn)300400500600酒醉的各種癥狀如臉紅、健談、反應(yīng)遲鈍、視覺變差因此歐美將血清中乙醇含量≥0.5g/L作為酒圖2本法的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線后駕車的標(biāo)準(zhǔn)。3.5線性范圍取混合血清1份加入無水乙醇至血清中乙醇濃度>3.0g/L時(shí)中樞神精系統(tǒng)嚴(yán)5.0g/L然后再用同一混合血清稀釋至4.0,3.0,重?fù)p害可出現(xiàn)昏迷,>4.0g1L時(shí)可導(dǎo)致死亡。本2.01.00.50.25和0.125g/18個(gè)濃度用本法法的線性范圍為0.125~5.0g/L急診檢測(cè)已足測(cè)定按N(LSEP6P文件作線性評(píng)價(jià)2]線性回夠。歸方程為Y=0.9864X+0.0045,=0.991。稀正常值測(cè)定時(shí)有不到半數(shù)的標(biāo)本可測(cè)出微量的釋變異0. 08 for 0. 5 g/L of ethanol the linearity was 0. 125-5.0 g/L the precisions were1.02 for within-run CV and 2. 76% for between-run CV. Correlation between the reasults obtained by this method Y)and gaschromatographic method (X)was Y=1. 06X+0. 12 r=0.989. Conclusion This method had higher sensitivity wide linearitycy. It is suitable to use for the emergency test of clinical laboratorieKey word ethanolethanol oxidase method收稿日期200109-19修回日期20020527)本文編輯陳維忠)文章編號(hào):1001-764X2002)4021001中圖分類號(hào)R446.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼3流式細(xì)胞術(shù)白血病免疫分型中CD45設(shè)門的重要性鞏文玉(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院血液中心北京100045)關(guān)鍵詞流式細(xì)胞術(shù)泊血病浼疫分型免疫分型在急性白血病的診斷中起著重要作用它具有在白血病細(xì)胞膜上抗原的交叉表達(dá)和/或缺失現(xiàn)象很特異性強(qiáng)、客觀等優(yōu)點(diǎn)從而降低了急性白血病形態(tài)學(xué)的誤常見有些交叉是白血病細(xì)胞所特有的成為運(yùn)用FCM檢測(cè)診率。但也應(yīng)注意到所用的試劑質(zhì)量、標(biāo)本處理及染色方微小殘留病灶的依據(jù)2但系統(tǒng)誤差的存在同樣會(huì)產(chǎn)生類法等對(duì)結(jié)果會(huì)產(chǎn)生很大的影響如不進(jìn)行監(jiān)測(cè)有可能導(dǎo)致結(jié)似結(jié)果假陽性或假陰性),此時(shí)只要在成熟淋巴細(xì)跑和成果的失真。本文就流式細(xì)胞 flow cytometry FCM)血病熟粒細(xì)胞上不存在相同的抗原交叉這種表型結(jié)果就是可信免疫分型中CD45設(shè)門的重要性談些體會(huì)的否則就要認(rèn)真查找原因。值得指出的是正常細(xì)胞本身運(yùn)用rCM檢測(cè)白血病細(xì)胞免疫表型普遍采用CD45/也存在著抗原的交叉如CD10在成熟粒細(xì)胞以及CD5在BsSC雙對(duì)數(shù)散點(diǎn)圖( dot plot)對(duì)幼稚細(xì)胞設(shè)門來分析其抗原淋巴細(xì)胞某一發(fā)育階段上的表達(dá)34]這種情況并不說明試表達(dá)情況。白血病標(biāo)本在CD45/sS℃雙對(duì)數(shù)散點(diǎn)圖上一般劑質(zhì)量或樣本處理方法有問題只是這種正常交叉表達(dá)的抗可見到三群細(xì)胞即成熟淋巴細(xì)胞、成熟粒細(xì)胞及幼稚細(xì)胞,原并不是很多。它們之間相對(duì)位置固定不變。對(duì)這三群細(xì)胞分別設(shè)門可以綜上所述FCM白血病免疫分型結(jié)果的室內(nèi)質(zhì)量評(píng)估觀察其各自抗原的表達(dá)情況。成熟淋巴細(xì)胞中大部分為T的關(guān)鍵在于識(shí)別出成熟的淋巴細(xì)胞及成熟粒細(xì)胞而CD45淋巴細(xì)胞B淋巴細(xì)胞占一小部分因此此群細(xì)胞主要表達(dá)設(shè)門技術(shù)為此提供了一個(gè)強(qiáng)有力的手段。在我院檢測(cè)的急D5、Cm7、CD等T細(xì)胞抗原同時(shí)也應(yīng)有少部分細(xì)胞表達(dá)性白血病標(biāo)本中絕大部分標(biāo)本均能檢測(cè)到或多或少的成熟D9、CD0等B細(xì)胞抗原,而成熟粒細(xì)胞應(yīng)表達(dá)CD13、淋巴細(xì)胞或成熟粒細(xì)胞,包括一些形態(tài)學(xué)上幼稚細(xì)胞達(dá)CD33、CD15、MP○等髓細(xì)胞抗原。這兩群成熟細(xì)胞為白血100%的標(biāo)本這說明上述方法是確實(shí)可行的?？笴D45單抗病免疫分型結(jié)果的室內(nèi)質(zhì)量評(píng)估提供了極有價(jià)值的依據(jù)。也因此成為此項(xiàng)工作中必不可少的一個(gè)試劑種情況是成熟淋巴細(xì)胞的CD5、CD7、CD19、CD2O陽性率參考文獻(xiàn)極低或根本無細(xì)胞表達(dá)此種情況很可能預(yù)示著質(zhì)量失控。[1] Lanza p, Latorrace a, Moretti,etal.( omparative analysis ofD13、CD33、MPO也是如此。另一種相反情況是淋巴細(xì)胞different permeabilization methods for the flow cytometry抗原不僅在淋巴細(xì)胞上表達(dá),在成熟粒細(xì)跑上也表達(dá)CD13、CD33、MPO不僅在粒細(xì)胞上表達(dá)在成績淋巴細(xì)胞上normal and leukemic cell[ J ] Cytometry 1 1997 30(3 ) 134-144也出現(xiàn)。這兩種倩況一般提示免疫分型結(jié)果的不可靠需要2 Czuczman Ms, Dodge R K, Stewart Cc,ea. Value of查明原因重新檢測(cè)。前者要注意試劑的效價(jià)、有效期及細(xì)munophenotype in intensively treated adult acute lymphoblast胞濃度等因素后者要注意標(biāo)本處理方法是否得當(dāng)尤其在leukemia: cancer and Leukemia Group B Study 8364[ J ] Blood檢測(cè)胞質(zhì)內(nèi)抗原時(shí)滲透劑選擇不當(dāng)或方法不合適非常容【3】o易造成假陰性或假陽性結(jié)果。 francesco等1用三種不同的中國煤化工aa,. Flow cytometric analysisCNMH GB lymphocyte developmen[ J].滲透劑檢測(cè)了MP∽O及溶菌酶這兩種粒細(xì)胞顆粒成分在淋巴Blood j9s7m05):1316-1324細(xì)胞中的表達(dá)情況其結(jié)果是經(jīng)其中兩種滲透劑處理的正常4] Verstappen L W, Huang S, Picker I.J,etal. Flow cytometric人淋巴細(xì)胞的MPO陽性率分別為58.6%、54.0%溶菌酶ssessment of human T-cell differentiation in thymus and bone分別為8.5%、49.3%?？梢娂?xì)胞處理方法對(duì)胞質(zhì)抗原的檢marrow J].Bod,l992793)66667測(cè)有顯著影響應(yīng)慎重選擇收稿日期2001-09-28收回日期200203-30)本文編輯陳軍)