果樹學(xué)報(bào)2001,82)72-74Journal of Fruit Science錦橙葉片POD動(dòng)力學(xué)研究謝永紅甘霖吳正琴(重慶市果樹研究所江津40260)摘要以錦橙成熟春梢葉片提取過氧化物釀POD)分別測(cè)定了該酶的最適μ最適溫度及酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km值和vmax值比較分析了常見幾種POD抑制劑的作用程度。結(jié)果表明以鄰甲氧基酚為底物葉片POD的最適p為5.0,最適溫度為32℃Km值為28.04mmwl/L,vmsx值為147.83umit/sgFw。在所測(cè)的6種抑制劑(K+、P2+CN、Vc硫脲及L半胱氨酸)CN硫脲和L半胱氨酸對(duì)POD表現(xiàn)岀較強(qiáng)的抑制作用K對(duì)PD活性起促進(jìn)作用。在一定濃度范圍內(nèi)各種抑制劑的作用程度與其濃度具有極顯著的相關(guān)性。關(guān)鍵詞錦橙春梢葉片OD動(dòng)力學(xué)中圖分類號(hào):S66.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼∶文章編號(hào):009-9980(2001)02-072-03Study on Dynamics of Peroxidase in the Leaf of Orange cv. JinchengXie Yonghong Gan Lin and Wu ZhengqingChongging Fruit Research Institite, Jiangjin 402260)stract Peroxidase( POD )in the spring leaf of orange cv. Jinchen CitrusOsbeck )was extracted. The optimum pHoptimum temperature, Km Vmax and common inhibitors for POd were analyzed. The results showed that the optimum pH andtemperature were 5.0 and 32 C respectively Km and Vmax of POD with guaiacol substrate were 28. 04 mmol/L and 147.83B2+ thiourea and L-cysteine were strong inhibitors, but K+ was an activator for POD in sixinhibitors measured. In a proper range of inhibitors concentration the degrees of inhibition of all the inhibitors have a significantorrelation with its concentrationKey Words Orange cv. Jincheng Spring leaf POD Dynamic過氧化物釃( peroxidase,r∽OD活性在植物生理園內(nèi)10年生枳砧錦橙( Citrus sinensis osbeck城熟的研究中是一個(gè)非常重要的生理指標(biāo)。一些學(xué)者曾報(bào)春梢葉片為試材每年6月取樣重復(fù)測(cè)定3次。道了POD活性與種子活力1、組織衰老2品種耐1.2POD的提取缺鐵性3及分枝數(shù)和產(chǎn)量4的相關(guān)性。在柑橘和蘋將葉片用蒸餾水洗凈定量濾紙吸干除去葉片果上也采用PO活性及其同工酶來鑒定砧木的矮主脈后萬成碎片。稱取1g樣品加少量蒸餾水和石化程度5-η。呂斌等研究了多種柑橘砧木及嫁接樹英砂研磨成漿定容到100m稀釋5倍后1000×葉片POD活性與樹體生長(zhǎng)與結(jié)果的關(guān)系8以上g離心l0min上清液即為酶測(cè)定液。都是從POD活性及其同工酶多型性加以研究。有1.3POD的測(cè)定關(guān)樹體中POD特性及其動(dòng)力學(xué)研究較少如何對(duì)該愈創(chuàng)木酚法01:在指形試管中加入1mL酶液、酶進(jìn)行有效的調(diào)控未見報(bào)道。本文從錦橙葉片中提1mL1%愈創(chuàng)木酚和1m0.1mo/LpH5.0的HAe取POD并對(duì)酶的某些特性、動(dòng)力學(xué)參數(shù)及常用抑制NaAc緩沖液搖勻后置于30水浴預(yù)熱5min然劑的作用效果加以研究,為該酶的合理調(diào)控提供依后快速加入1mL0.08%H2O2并開始計(jì)時(shí)立即用據(jù)紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定1min內(nèi)△ODm。一個(gè)酶材料和方法活性單位為每g鮮樣在1s內(nèi)使OD值升高0.1(以u(píng)mi/sgW表示1.1材料1.4中國(guó)煤化工的測(cè)定1999~2000連續(xù)兩年以重慶市果樹研究所甜橙CNMHG度(范圍10-100℃0收稿日期200007-19接受日期000-1220基金項(xiàng)目重慶市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目編號(hào)995759)謝永紅男副研究員。果樹學(xué)報(bào)18卷間隔2℃啦H5.0湘和不同p范圍3.2~6.4,間隔大于5.0時(shí)POD活性隨pH的升高而降低當(dāng)pH為0.2溫度30℃)條件下測(cè)定POD活性,以最大活性6.4時(shí)POD活性為最大活性的33.7%。管為100%計(jì)算相對(duì)活性。1.5 POD Km值和vmax值的測(cè)定以鄰甲氧基酚為底物沒置1、241020mmol/的底物濃度分別測(cè)定POD活性。用雙倒數(shù)曲線回歸法Ⅱ計(jì)算Km值和Vmx值1.6抑制劑對(duì)POD活性影響的測(cè)定在酶促反應(yīng)中加入不同的抑制劑每種抑制劑設(shè)置5個(gè)濃度2、46、8、10×10-5moL),分別測(cè)定POD的活性Ⅴ并計(jì)算各抑制劑不同濃度的扣制程度以不加抑制劑的POD活性V為對(duì)照抑制程3035404.5505.560度%)=(1-V/Vo)×1002結(jié)果與分析圖2pH對(duì)POD活性的影響Fig 2 Efect of pH on POD activity2.1溫度對(duì)POD活性的影響由圖1可以看出錦橙葉片PD的最適溫度為23POD酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vmax32℃在30~34℃范圍內(nèi)POD相對(duì)活性大于97%利用雙倒數(shù)法對(duì)1s和1/作圖圖3)并進(jìn)低溫(14℃以下)可抑制Po活性達(dá)50%左右14行線性回歸汁計(jì)算出錦橙葉片POD以鄰甲氧基酚為32℃范圍內(nèi)PO活性隨溫度的升高明顯增加溫底物的Km值為28.04mmod/ L, Vmax值為147.83U度系數(shù)Qn為0.51超過酶的最適溫度POD活性隨8gW。說明PO與鄰甲氧基酚的親和力較好溫度的增加而降低當(dāng)溫度升高到58℃時(shí)酶相對(duì)活性降為59.4%當(dāng)高達(dá)84℃時(shí)酶完全變性失去活性y=0.1897x+6.763R2=0.971vmax=14783Uis·gFWKm= 28.04 mmol L底物濃度倒數(shù)Reciprocal of shstratc conccntration ls](I-mol.圖3POD酶促反應(yīng)雙倒數(shù)曲線203040506070809010010Fig 3 Double reciprocal plot of POD enzymatic reaction溫度 Temperature( t)2.4不同扣制劑對(duì)POD活性的影響圖1溫度對(duì)POD活性的影響不同抑制劑對(duì)POD的抑制作用有明顯差別表Fig 1 Ettect of temperature on POD activity1)L-半胱氨酸、硫脲、P2+、CN-對(duì)POD活性有明顯抑釓作用茸中⌒的制效果最好,在10×22pH對(duì)POD活性的影響中國(guó)煤化工10Ⅴc對(duì)POD活性影響圖2表明該P(yáng)OD的最適p為5.0與愈創(chuàng)木較小CNMH刂率僅為14.89%。而酚法0測(cè)定POD活性要求的pH值一致。當(dāng)pH小K+的存在可提高PoD活性,當(dāng)濃度為8×10-5于5.0時(shí)PO活性隨pH值的降低而下降,特別是mol/L時(shí)POD活性提高26.6%在一定濃度范圍內(nèi)在pH為4.4-5.0范圍內(nèi)這種變化更為突出。當(dāng)pH每種抑制劑的抑制效果與其濃度具有極顯著的相關(guān)為3.2時(shí)POD活性僅為最大活性的242%。當(dāng)pH性抑制率Y%盧與濃度X×10-5mol/L)的回歸方2期謝永紅等綿橙葉片POD動(dòng)力學(xué)研究67程分別為0.691R2=0.9990)K+:Y=0.169X3-2.5955X2+7.032XCN-:Y=-0.302X3+5.2835X2-17.613X+4.468KR2=0.9892)35.319(R2=0.9740*)Vc:Y=0.0277X3-0.5462X2+3.983X+L半胱氨酸:Y=0.0609X3-1.1018X21.9681(R2=0.99981217X-9.3085(R2=0.9998)Pb2+:Y=0.1718X3-2.0564X2+8.099X硫脲:Y=3.8369X0%(R2=0.9876*)表1不同抑制劑對(duì)錦橙葉片POD活性的影響Table 1 Effects of different inhibitors on POD activity抑制劑各濃度(×10-5m/L的抑制程度回歸方程Degree of inhibition( %KCI Potassium chloride0.275.85-21.01-26.60-25.00Y=0.169X3-2.5955X2+7.032X-4.46810.9892*PhSOA Anglesite9.3111.7019.9546.54Y=0.1718X3-2.0564X2+8.099X-0.69150.9990氰化鉀 Potassium cyanide19.9525.5361.4473.4086.70Y=-0.302X3+5.2835X2-17.613X+353190,9740Ascorbic acid7.9810.9012.2313.0314.89Y=0.0277X3-0.5462X2+3.983X+1,96810.9998硫脲 Thiourea69111.1714.6319.9525.27Y=3.8369X0790.9876L-半胱氨酸L- Cysteine5.0513.3019.15242032.71Y=0.009X-1.1018X+9217X-930850.998注1.Y代表抑制程度%)代表抑制劑濃度(×10-5mo/L)2.表中數(shù)據(jù)用相關(guān)系數(shù)法檢驗(yàn),*表示達(dá)極顯著相關(guān)水平(n=5)Note 1. Y degree of inhibition ,X content of inhibitors, 2. The data in table were analysized with correlative coefficient method, * significant at P<1%影啊J]園藝學(xué)報(bào)1998252)l3討論[2]張麗欣宗汝靜.四種葉菜衰老期間呼吸、乙烯產(chǎn)生JA和過試驗(yàn)表明錦橙葉片POD的最適溫度為32℃氧化物酶的變化及其相互關(guān)系J,植物生理學(xué)報(bào),998,41)8l-89最適pH為5.0偏離最適溫度和最適pH酶活性將[3李式軍汪李平,水培生菜缺鐵脅迫品種的篩選及其生理特性明顯降低不同抑制劑及其濃度對(duì)POD活性影響具研究J園藝學(xué)報(bào)1952X2):147-152有明顯差異。因此樹體在不同環(huán)境條件下其POD【4]楊暹關(guān)佩聰陳玉娣.青花菜東京綠側(cè)枝數(shù)與產(chǎn)量及過氧化物活性各不相同這將直接影響樹體的生理狀態(tài)和生酶活性研究J園藝學(xué)報(bào)19952x2)157~160長(zhǎng)發(fā)育情況。利用外界因素或人為因素如溫度、土[5]李文斌張映南劉庚峰簿柑桔矮化砧及半矮化砧過氧化物酶同工酶及活性的比較J園藝學(xué)報(bào)198964)261-265壤pH土壤重金屬含量及鉀離子濃度等對(duì)POD活【61李秀玲馬仁懿蘋果矮化鉆與喬化鉆過氧化物酶同工酶的比性進(jìn)行有效的調(diào)控使其達(dá)到較適宜的酶活性范圍,較研究J]植物學(xué)報(bào)J9812x1)82~84以滿足柑橘不同時(shí)期樹體、果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育的需要這〔η]胡國(guó)謙漲谷雄周中建籌.利用葉片過氧化物酶同工酶鑒定在果樹栽培和生理研究中都具有重要的意義。柑桔砧木資源矮化性能J]熱帶作物科技,1992,1(1):15本文僅以鄰甲氧基酚為底物對(duì)錦橙葉片POD[8]呂斌陳學(xué)年李質(zhì)怡等.不同砧木先鋒橙葉片POD活性與樹的某些特性及常見抑制劑進(jìn)行了試驗(yàn)有關(guān)其它底體生長(zhǎng)勢(shì)的關(guān)系J]西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)99x(2)63-67物的情況、POD的其它特性以及不同扣制劑的相互[9門歐毅毛啟才曹照春等不同砧木錦橙葉片過氧化物酶活性作用等有待進(jìn)一步研究。在酶對(duì)外界調(diào)控因子的表與植株生長(zhǎng)結(jié)果的關(guān)系J]云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),199491)23達(dá)研究中尚需進(jìn)行POD同工酶分離與活性分析以確定各調(diào)控因子的主要表達(dá)蛋白和表達(dá)強(qiáng)度。[10]陳秀偉馮敘橋.農(nóng)產(chǎn)品貯藏運(yùn)銷學(xué)實(shí)驗(yàn)教稙M]重慶西南中國(guó)煤化工參考文獻(xiàn)CNMH Gmination of enzyme dissociationcontantAmer Chem Soc, 1934 56 585-688[1]吳岳軒曾富華空間飛行對(duì)番茄種子活力及其活性氧代謝的