第33卷第2期膏島科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)2012 F 4 Journal of Qingdao University of Science and Technology(Natural Science Edition) Apr 2012文章編號:1672-6987(2012)02-0131-04聚乙二醇修飾纖維素酶的性能研究謝娟,李露,蘇忠亮,于世濤青島科技大學(xué)化工學(xué)院,山東膏島266042)摘要:以單甲氧基聚乙二醇丙醛( mPEG-ALD5KD為修飾劑,對纖維素酶進(jìn)行化學(xué)修飾,得到修飾纖維素酶( mPEG-Cel)。用 mPEG-Cell降解微晶纖維素,以所得還原糖量為標(biāo)準(zhǔn)(DNS比色法測定),考察各種因素對其催化性能的影響,確定最佳修飾條件。結(jié)果表明:在0.lmol·LpH=4.8的檸櫞酸-檸褘酸鈉的緩沖溶液中,纖維纛酶質(zhì)量濃度為5mgmL1,m( mPEG-ALD):m(酶)=1:1,35℃修飾24h,所得到的 mPEG-Cell具有最佳的催化性能,在50℃下降解微晶纖維素,24h后可得還原糖量達(dá)到2.58mg·mL-1,比同條件下天然酶降解微晶纖維素得到的還原糖量多0.53mg·mL-l,即多26%關(guān)鍵詞:纖維素酶;聚乙二醇丙醛;化學(xué)修飾中圖分類號:Q556文獻(xiàn)標(biāo)志碼:AChemical Modification of Cellulase with Polyethylene Glycol-aldehydeKIE Juan, LI Lu, sU Zhong-liang, YU Shi-taocollege of Chemical Engineering, Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266042, ChinaAbstract: The modified cellulase(mPEG-Cell)was obtained by using polyethylene glycol-aldehyde(mPEG-ALD)as modifier. The mPEG-Cell was used to degrade mline cellulose and the effects of various factors on its catalytic properties were investigated based on the amount of obtained reducing sugar (by dNS colorimetric analysis)The obtained optimum conditions were using 0. 1M citric acid-sodium citrate as buffer(pH=4. 8), concentration of cellulase 5 mg.mL-, m(mPEG-ALD)I m(Cellulase)=1 :1, temperature 35 C and time 24 h. The mPEG-Cell obtained under above condi-tions was used to degrade microcrystalline cellulose at 50C for 24 h, the amount of re-ducing sugar could reach 2, 58 mg. mL-I, which was 0. 53 mg mL- (26%D) more thanthat obtained by using natural cellulase.Key words: cellulase; polyethylene glycol-aldehyde; chemical modification隨著石化資源的逐漸枯竭,利用可再生資源進(jìn)而轉(zhuǎn)化成乙醇、丙酮、丁醇等燃料和化工原生產(chǎn)生物能源的研究越來越受到國內(nèi)外研究者的料口。但是纖維素酶降解纖維素存在酶活性低,關(guān)注。纖維素作為世界上最豐富的天然可再生資與纖維素可及性差,酶穩(wěn)定性差,條件苛刻等問源,其開發(fā)與利用對解決人類面臨的資源和能源題,阻礙了纖維素酶解的進(jìn)一步發(fā)展,降低了對纖危機(jī)具有重要意義。作為纖維素資源化利用有效維素的利用率,因此對纖維素酶進(jìn)行化學(xué)改性途徑之一的酶解反應(yīng),可使纖維素降解為葡萄糖,成為改善其不足的有效手段之一3收稿日期:2011-10-17H中國煤化工甚金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31070520);山東省高等學(xué)校科技計(jì)劃項(xiàng)目(J驗(yàn)室項(xiàng)目(200912)CNMHG程國家重點(diǎn)實(shí)作者簡介:謝娟(1986-)女,碩士研究生,*通信聯(lián)系人132青島科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)第33卷目前國內(nèi)外對纖維素酶化學(xué)改性的研究比較1.3實(shí)驗(yàn)方法少,有研究者采用聚氧乙烯馬來酸酐聚合物、聚1.3.1化學(xué)修飾方法乙二醇和順丁烯二酸酐、三聚氯氰活化聚乙二醇在裝有溫度計(jì)、冷凝管、轉(zhuǎn)子的50mL三口PEG〕和單甲氧基聚乙二醇(mPEG)、焦碳酸二瓶中加入15mL一定pH的檸檬酸檸檬酸鈉緩乙酯和碳二亞胺對纖維素酶進(jìn)行修飾47,以上方?jīng)_溶液。設(shè)定一定溫度,待溫度穩(wěn)定后加入相應(yīng)法存在活化劑毒性大、步驟繁瑣、修飾酶不穩(wěn)定等量酶粉,慢速攪拌溶解。稱取相應(yīng)量修飾劑缺點(diǎn)。聚乙二醇類修飾劑現(xiàn)多用于藥物修飾,普( mPEGALD)計(jì)時(shí),混合均勻,再加入相應(yīng)量還遍取得較好效果,與其它聚乙二醇類修飾劑相原劑( NaNBH3)攪拌溶解,使終濃度保持在20比,單甲氧基聚乙二醇丙醛( mPEGALD)對蛋白mmol·mL1。反應(yīng)一定時(shí)間,加入3.0g甘氨質(zhì)N末端氨基的選擇性高,反應(yīng)pH范圍較寬,酸終止反應(yīng)30min。透析過夜,得到修飾酶液對蛋白質(zhì)活性影響較小[10,修飾產(chǎn)物均一性較( mPEG-Cell)高,有利于修飾產(chǎn)物的質(zhì)量控制。因此本研究嘗1.3.2修飾酶活性測定試用單甲氧基聚乙二醇丙醛為修飾劑對酸性纖維按文獻(xiàn)[1l]繪制標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線,用于換算素酶進(jìn)行化學(xué)修飾以期提高纖維素酶的穩(wěn)定性,吸光度值對應(yīng)的還原糖量。進(jìn)而提高其催化活性。以降解微晶纖維素為模型取15mL修飾酶液加入0.30g微晶纖維素反應(yīng),明確修飾條件對酶活性的影響。(20g·L-1),50℃下降解1h,采用DNS顯色法1實(shí)驗(yàn)部分檢測對應(yīng)吸光度A值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線換算成相應(yīng)還原糖量,衡量不同修飾條件得到的修飾1.1材料與儀器酶降解微晶纖維素的效果,以確定最佳修飾條件。單甲氧基聚乙二醇丙醛( mPEG-ALD),5KD,北京凱正生物工程有限公司;氰基硼氫鈉2結(jié)果與討論( NaNBH3),阿拉丁試劑;微晶纖維素(MCC),2.1修飾溫度對 mPEG-Ce催化活性的影響成都科隆化工試劑廠;纖維素酶,上海源葉生物科在pH=4.8的檸檬酸檸檬酸鈉緩沖溶液技公司;透析袋,美國Akb公司;3,5-二硝基水楊中,酶質(zhì)量濃度3mg·mL1,m( mPEG-ALD)酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、甘氨酸、EDTA、碳酸氫鈉m(酶)=1:1,修飾24h的條件下,考察不同修等試劑均為分析純。飾溫度對纖維素酶修飾效果的影響,結(jié)果見圖1。紫外光度計(jì),UV755B型,上海精密科學(xué)儀器有限公司。1.2修飾反應(yīng)原理單甲氧基聚乙二醇丙醛與蛋白質(zhì)分子N端18的氨基通過曼尼希反應(yīng)生成希夫堿,經(jīng)氰基硼氫1.2鈉( NaNBH3)還原形成比較穩(wěn)定的亞胺連接體。畫09反應(yīng)式如下:03051015202530354045505560mPEG一CH+NH2一蛋白質(zhì)冷凝圖1溫度對 mPEG-Cell!催化活性的影響N-蛋白質(zhì)Fig 1 Influence of temperature on catalyticactivity of mPEG-CellmPEG一CH+hoN蛋白質(zhì)由圖1可見起初隨著溫度的升高修飾酶活+ NaCNBH1還原性逐漸提高;修飾溫度為35℃時(shí),達(dá)到最大值;再mPEG—CH升高溫度,V山中國煤化工纖維素酶的mPEG—CH2NH蛋白質(zhì)化學(xué)本質(zhì)是CNMHG其活性具有最適宜溫度,在此溫度以下,其活性隨溫度的升高第2期謝娟等:聚乙二醇修飾纖維素酶的性能研究133而增強(qiáng),超過該溫度,酶的構(gòu)象將發(fā)生改變,使其飾效果逐漸平緩,再增加酶用量對增加修飾效果活性減小,當(dāng)溫度過高,纖維素酶將完全變性,喪不大。因此,適宜的酶用量為5mg·mL。失催化活性。因此,適宜的修飾溫度為35℃。22修飾體系pH對 mPEG-Cell催化活性的影在酶質(zhì)量濃度為3mg·mL1,m(mPEG322ALD):m(酶)=1:1,35℃修飾24h的條件下,考査不同pH的檸檬酸檸檬酸鈉緩沖溶液對纖維素酶修飾效果的影響。在修飾劑類型、相對分子質(zhì)量固定的情況下,修飾反應(yīng)條件對單修飾c(纖維素酶)/(mg·mL)產(chǎn)物體外活性保留的影響主要取決于修飾位點(diǎn)。只有修飾位點(diǎn)遠(yuǎn)離蛋白質(zhì)活性部位的時(shí)候,修飾圖3纖維素酯濃度對 mPEG-Cel催化活性的影響Fig 3 Influence of cellulase concentration on蛋白才能得到較高的活性保留。不同氨基酸殘atalytic activity of mPEG-Cell基,其pK,值不同,因而在不同的pH值條件下其親核性有較大差別。因而溶液的pH值影響了24 mPEG-ALD用量對 mPEG-Cel催化活性的蛋白質(zhì)的修飾位點(diǎn),是影響修飾產(chǎn)物活性的最主影響要的因素。圖2顯示了pH對 mPEG-Cell催在pH=4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液化活性的影響?？梢钥闯? mPEG-Cell.活性隨中,酶質(zhì)量濃度為5mg·mL1,35℃修飾24h著pH值的增大先增大后減小,在pH=4.8時(shí)的條件下,考查不同的修飾劑與酶質(zhì)量比對纖維mPEG-Cell I的活性最高。在pH=4.8的條件下,素酶修飾效果的影響,結(jié)果見圖4。由圖4可見,有利于纖維素酶非活性氨基基團(tuán)的暴露,增加其隨著修飾劑和酶配比逐漸增加,修飾酶效果先增與 mPEG-ALD修飾基團(tuán)的接觸位點(diǎn),提高修飾大后減小,在質(zhì)量比1:1時(shí)達(dá)到最大值。可能是度,以利于保持和穩(wěn)定 mPEG-Cell的空間構(gòu)象,由于修飾劑和酶配比的增加,使得酶和修飾劑分使其具有較高的活性12。因此,適宜的修飾pH子的碰撞機(jī)會增大,促進(jìn)了修飾反應(yīng)的進(jìn)行,但是為4.8修飾反應(yīng)消耗活性氨基基團(tuán),使酶活性明顯下降,導(dǎo)致修飾酶解效果下降。因此,適宜的配比為m( mPEG-ALD)1m(酶)=1:1。2.72.62.512些0.92.30.62.22.032404.85.6641.81.7圖2反應(yīng)體系pH對 mPEG-Cell催化活性的影響ig2 Influence of ph on catalytic activity of mPEG-cellm(mPEG-ALD): m(A圖4修飾劑用量對mPEC催化活性的影響2.3纖維素酶濃度對 mPEG-Cell 1催化活性的影響在pH=4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液catalytic activity of mPEG-Cell中,m( mPEGALD):m(酶)=1:1,35℃修飾2.5反應(yīng)時(shí)間對 mPEG-Cell催化活性的影響24h的條件下,考查不同酶質(zhì)量濃度對mPEG在pH=4.8的檸檬酸檸檬酸鈉緩沖溶液Ce催化活性的影響結(jié)果見圖3.由圖3可見,中,m(mPEV山中國煤化工毒質(zhì)量濃度起初隨著酶用量的增加, mPEG-Cel催化活性逐為5mg·mCNMHG同反應(yīng)時(shí)漸上升,但是當(dāng)酶用量超過5mg·mL-之后,修間對 mPEG-Cell催化活性的影響,結(jié)果見圖5。134青島科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)第33卷由圖5可見,隨著修飾時(shí)間的加長,修飾效果逐漸原糖量比天然酶多0.53mg·mL(即多26%)。增強(qiáng),24h后趨于平緩。隨著反應(yīng)時(shí)間的增加在聚乙二醇鏈的作用下纖維素酶的穩(wěn)定性增強(qiáng),mPEG-ALD與酶之間的結(jié)合量增加,促使酶的結(jié)同時(shí)修飾酶活性中心外露更易與纖維素接觸結(jié)合位點(diǎn)外露,增加其構(gòu)象穩(wěn)定性, mPEG-Cell催合,使修飾酶催化中心更好的降解纖維素,從而增化效果顯著增加,到24h后, mPEG-ALD與酶之加還原糖的量間的結(jié)合度基本達(dá)到飽和, mPEG-Cell催化效果變化不明顯。因此,適宜的修飾時(shí)間為24h。結(jié)論采用單甲氧基聚乙二醇丙醛化學(xué)修飾纖維素3.0酶,使得修飾后的纖維素酶 mPEG-Cell比天然酶2.5具有了更好的穩(wěn)定性和催化活性。在0.1mol·LˉpH=4,8的檸檬酸檸檬酸鈉的緩沖溶液中,纖維素酶質(zhì)量濃度為5mg·mL-1,m(mPEGALD):m(酶)=1:1,35℃修飾24h,所得到的1.0纖維素酶 mPEG-Cell在50℃下降解微晶纖維61218243036424854素,24h后得到的還原糖量比同條件下天然酶降解微晶纖維素得到的還原糖量多0.53圖5反應(yīng)時(shí)間對 mPEG-C催化活性的影響mg·mL-1(即多26%)。本研究為提高纖維素酶Fig 5 Influence of reaction time的活性和穩(wěn)定性又開辟了一條新的途徑atalytic activity of mPEG-Cell考文獻(xiàn)2.6 mPEG-Cell與天然酶降解微晶纖維素催化效果比較[1] Ragauskas J. The path forward for biofuels and biomaterialsm PEG-Cel(50mL3mg·mL-1)與天然酶[刀. Science,2006,311:484-488(50mL3mg·mL1)在50℃下降解140mg微[2]夏詠梅吳紅平張玥等離子液體的制備及其在酶催化反晶纖維素,分別檢測降解1,3,6,9,12,24h后得應(yīng)中的應(yīng)用[J].化學(xué)進(jìn)展,2006,18(12):1660-1671.到的還原糖量。[3]張松平,王平化學(xué)修飾提高酶催化性能的重要工具[].生物加工過程,2006,4(1):4-15[4]劉靖夏文水,焦碳酸二乙酯及碳二亞胺對纖維素酶殼聚糖酶雙功能隆的修飾作用[J,食品科學(xué),2008,29(8):460mPEG-ce[5]張?jiān)Ｇ?李濱縣.修飾纖維素酶催化提取薯貴皂素的方法中國,GB1966712A[P].2006[6]張?jiān)Ｇ淅顬I縣.聚氧乙烯馬來酸酐聚合物改性纖維素酶催1,2化酸水解盾葉薯費(fèi)蕃預(yù)皂苷元的研究[門]中草藥,2007,38(4):527-53206E[7] Zhang Y Q. Modification of cellulase and its application to0369121518212427extraction of diasgenin from Dioscorea zingiberensis C. HWright [J]. Biochemical Engineering Journal, 2009,47:80-國6 mPEG-O"l!與天然酯降解微晶纖維囊對比[8]劉霞丁志山,蔣福升.聚乙二醇修飾小分子藥物的研究進(jìn)Fig 6 Contrast between MCCs degraded展)[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2010,24(5);380-386by mPEG- Cell and cellulase[9]王旭東李曉暉蛋白藥物的棗乙二醇定點(diǎn)修飾策略與最佳位點(diǎn)[門中國生物工程雜志,2010,30(4):101-109由圖6可見,隨時(shí)間的增加在兩種酶催化下[10許培,戎隆富聚乙二醇修飾天花粉蛋白的初步研究[中的微晶纖維素所得到的還原糖量都在逐漸增加,國新藥雜志,2006,15(5):154-348.[11張永風(fēng),盧紅梅.酸性纖維素酶酶活力的測定[門.釀酒科最初天然酶和 mPEG-Cell催化效果基本相當(dāng),但隨著降解時(shí)間的增加, mPEG-Cel.的優(yōu)勢逐漸增12]郭勇酶工H中國煤化工CNMHG38-141強(qiáng),24h后 mPEG-Cell I降解微晶纖維素得到的還任觸輯林琳)